CRECIMIENTO MICROBIANO, METODOS Y RECUENTOS.

Crecimiento microbiano

En microbiología el crecimiento se define como el incremento en el número de células. El

crecimiento es un componente esencial de la función microbiana, ya que en la naturaleza
cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como resultado de
crecimiento continuo de la población.

 La bipartición (fisión binaria) es una manera de reproducción asexual que se lleva a cabo
en arqueas, bacterias, levaduras de fisión, algas unicelulares y protozoos. Consiste en la
duplicación del ADN, seguida de la división del citoplasma (citocinesis), dando lugar a
dos células hijas. La mayor parte de las bacterias se reproducen por bipartición, lo que
produce una tasa de crecimiento exponencial. Por ejemplo, bajo condiciones óptimas,
la bacteria Escherichia coli se puede dividir una vez cada 20 minutos.
 El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una célula se llama
generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación o tiempo de
duplicación.

Proteínas Fts

Son proteínas implicadas en la división celular. Están presentes en los dominios bacterias y
archaea.

Tras la duplicación del cromosoma, moléculas de FtsZ polimerizan, se forma el anillo FtsZ
alrededor del cilindro celular en la zona que define el plano de división. Luego ataren a otras
proteínas Fts y a otras proteínas implicadas en la síntesis de peptidoglucano (Divisoma). Cuando
ocurre la constricción, el anillo FtsZ se des polimeriza, disparándose hacia el interior la síntesis
de materiales para la nueva pared celular.

 FtsZ polimeriza y forman una anillo en el centro de la célula.

 FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para ensamblar proteínas en el
divisoma.
 ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática.
 FtsI es una proteína involucrada en la síntesis de peptidoglucano y es también llamada
proteína de unión a penicilina (su actividad es bloqueada por el antibiótico).

Proteína MreB y la forma de las bacterias

La proteína clave que determina la forma en procariotas se denomina MreB. Esta proteína forma
una especie de cito esqueleto similar al de la actina en bacteria y probablemente también en
Archaea. La proteína MreB forma bandas filamentosas en espiral en el interior de la célula,
debajo la membrana citoplasmática. Parece que el cito esqueleto de MreB determina de alguna
manera la forma celular generando una fuerza contra la membrana citoplasmática.

Curiosamente, las bacterias con forma de coco carecen de proteínas MreB y de los genes que
las codifican. Esto sugiere que <por defecto> la forma de una bacteria es la esférica y que las
variaciones en la disposición de los filamentos MreB en las células no cocoides determina la
forma bacilar y otras morfologías celulares típicas de varios procariotas. Por lo tanto, con FtsZ y
Mreb, la célula procariota posee proteínas estructuralmente similares a la tubulina y a la actina,
respectivamente, que son las proteínas involucradas en la división celular y en el andamiaje
interno de las células eucariotas.

Autolisinas

Pequeñas aberturas son llevadas a cabo por las enzimas autolisinas que tiene una función
similar a la lisozima.

Las autolisinas se encuentran presentes en el complejo divisoma.

La síntesis del nuevo peptidoglocano deja en las células Gram positivas una cicatriz.

Las aberturas y la síntesis deben ser coordinadas para evitar la autolísis de la célula.

Crecimiento exponencial

Esta modalidad de crecimiento tiene lugar cuando en cada periodo fijo de tiempo se duplica el
número de células de la población. Para que ello ocurra la población (cultivo bacteriano) debe
crecer en un medio adecuado, sin limitaciones de nutrientes y sin productos tóxicos de desecho.
El tiempo de generación puede deducirse directamente de este tipo de representaciones. Una
característica del crecimiento exponencial es que la velocidad del aumento del número de
células es inicialmente lenta pero incrementa cada vez más con el tiempo.

Curva de crecimiento

En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado, también conocido como cultivo

monofásico, se obtiene una curva de crecimiento típica. Esta curva puede dividirse en distintas
fases llamadas, fases de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.

 Fase de latencia: periodo de tiempo que tarda en crecer la bacteria tras su inoculación
en el medio de cultivo. En un periodo de adaptación y su duración depende del estado
fisiológico de la bacteria y de las condiciones del cultivo.
 Fase exponencial: fases en la cual el número de bacterias crece de forma exponencial
(aumenta de forma constante). La velocidad del crecimiento en esta fase depende de
las características genéticas del organismo y las condiciones de cultivo.
En la industria interesa trabajar en esta fase y por ello se realizan cultivos continuos
(figura 3) (Prescott et al., 1999) donde la concentración de una sustancia limitante del
crecimiento, por ejemplo una vitamina, es incorporada al medio de modo de lograr una
velocidad de crecimiento constante y máxima por mucho tiempo. Los cultivos continuos
se caracterizan por: i) Suministrar igual cantidad de medio fresco que el removido del
sistema ii) La concentración de nutrientes limitantes controla la densidad celular iii) La
tasa de dilución controla la tasa de crecimiento iv) Si el cultivo es cuidadosamente
controlado puede ser mantenido indefinidamente
 Fase estacionaria: fase en la cual no hay ni aumento ni descenso en el número de células.
No hay crecimiento neto. Se debe a una limitación impuesta por la falta de un nutriente
esencial o por acumulo de desechos tóxicos en el medio o por ambos factores.
 Fase de muerte: Fase en la que el equilibro desaparece y predominan los
microorganismos muertos. No hay nutrientes para el recambio y las condiciones del
medio de cultivo son adversas para el crecimiento.

Evaluación de crecimiento

Analizaremos los distintos procedimientos para medir el crecimiento (cuadro 2).

Recuento de microorganismos totales en cámaras
Fundamento del método: una muestra de cultivo bacteriano diluido se coloca en una cámara de
volumen pequeño y conocido, como por ejemplo la de Petroff-Hause que encierra 2,5x10-7 mL
y se cuentan al microscopio las células contenidas en numerosos cuadrados de la cámara (figura
4) (Prescott et al., 1999). Se calcula el promedio de células contenidas en dicho volumen y se
expresa el Nº células/mL de la muestra. La desventaja es que no se pueden distinguir células
viables de no viables y el error experimental es alto. Pero se pueden efectuar numerosas
determinaciones en poco tiempo, con solo lavar la cámara y volverla a cargar.

Este tipo de recuento es muy empleado cuando se desea conocer el nivel de crecimiento de
cultivos conocidos, en el laboratorio o en la industria que se encuentren en fase logarítmica, en
forma rápida.

Método indirecto- Recuento de viables en placa

El fundamento del método es permitir el crecimiento de una sola célula en la superficie de un

medio de cultivo sólido apropiado. Se postula que cada colonia proviene de una sola célula y
teniendo en cuenta el volumen de inóculo empleado y la suspensión-dilución sembrada (figura
5) se calcula el Nº de unidades formadoras de colonias (ufc)/mL) o por gramo en caso de
muestras sólidas (suelo, alimentos, etc.).

Ventajas: es el único procedimiento correcto, ya que cada unidad formadora de colonia (célula,
trozo de micelio, espora) da origen a una colonia.

Desventajas: es más lento, no existe un medio de cultivo para desarrollar a todos los
microorganismos presentes en una muestra. Resulta muy útil en la evaluación de grupos
fisiológicos: microorganismos que pueden no estar relacionados taxonómicamente, pero que
realizan una función metabólica común. Por ejemplo: fijadores aerobios de nitrógeno,
celulolíticos anaerobios, nitrificantes, etc.
Procedimiento: consiste en contar el número de colonias formadas en medio de cultivo sólido
adecuado, luego de sembrar volúmenes conocidos de varias suspensiones-diluciones de la
muestra (suelo, aguas, alimentos). La siembra con varias repeticiones permite disminuir el error
experimental, el cual es alto en esta técnica. El método selecciona las cajas de Petri con entre
30 y 300 colonias (figura 6), ya que más de 300 colonias por caja implica que muchas pueden
originarse por más de una célula dada su alta densidad y las de menos de 30 colonias también
presentan gran error.

Recuento en aguas: la figura 7 (Prescott et al., 1999) muestra el procedimiento seguido para el
recuento de viables, por ejemplo coliformes en aguas, las que deben ser filtradas (por ejemplo
100 mL de agua) a los efectos de concentrar la carga microbiana, por filtros bacteriológicos (0,45
micras), los que luego se depositan en la superficie de medios adecuados. Muchas veces los
filtros están cuadriculados, lo que facilita el recuento de las colonias formadas.

Recuento de viables en medio líquido (Número más probable = NMP)

Se basa en la siembra (1mL, por ejemplo) de 3 o 5 tubos por cada suspensión-dilución de la

muestra en estudio, con medio adecuado para el grupo fisiológico analizado (celulolíticos,
fijadores de N2, amonificantes, etc.). Se efectúan 3 repeticiones del recuento completo (figura
8). Luego de un período adecuado de incubación se leen los tubos positivos (crecimiento por:
turbidez y/o aparición o desaparición de una sustancia, evaluada químicamente) en tres
diluciones consecutivas.

Se forma así el número característico = Nº característico, de 3 cifras, con el cual se entra en

tablas como la de Mc Crady (Anexo práctico), que da el NMP en un mL de la primera de las tres
diluciones del Nº característico.
Constituye un método indirecto, ya que la tabla se construyó realizando el recuento de viables
en medio sólido de algunas combinaciones y luego por computadora se calculan los puntos no
determinados. Es muy empleado en recuentos de coliformes en aguas y de muchos grupos
fisiológicos en suelos. No requiere el manipuleo de cajas de Petri.

Otros métodos

Muy empleado es el método de evaluación del crecimiento por determinación de la masa celular
en forma indirecta, por la turbidez de los cultivos en función del tiempo. Se evalúa la densidad
óptica a unos 600nm en espectrofotómetro. La misma es proporcional a la concentración,
dentro de ciertos límites y esta técnica es muy empleada en la rutina del laboratorio. Requiere
de una determinación previa que relaciona densidad óptica frente a recuentos microbianos,
efectuados en medio sólido en placas.
Los otros métodos de evaluación del crecimiento emplean propiedades bioquímicas y
metabólicas como son las de- terminaciones de alguna enzima, actividad respiratoria,
contenidos de C, N. etc., muchos de ellos pueden encontrarse en el Apéndice práctico.

EFECTO DEL AMBIENTE SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Los microorganismos están muy distribuidos en la naturaleza, en ambientes tan variables como
los suelos, aguas, aire, superficie de vegetales, en animales e incluso en el hombre. El carácter
mayoritariamente unicelular o muy simple de los microorganismos los hace muy vulnerables a
cambios en el ambiente (cuadro 3):
Se aprecia una relación inversa entre complejidad de la organización de los distintos organismos
y su dependencia con el ambiente. En los microorganismos toda su superficie celular está en
contacto con el ambiente y cambios muy marcados en factores como la temperatura, acidez,
presión osmótica, concentración de sustancias químicas, pueden detener procesos microbianos.
Si los microorganismos pueden esporular, lo harán en condiciones adversas, otras veces su
número decae marcadamente.

Por comodidad los factores del ambiente se dividen en:

● Físicos, como la temperatura, gases, presión osmótica, pH

● Químicos, o físico-químicos: nutrientes, sustancias antimicrobianas

● Biológicos, otros organismos: microorganismos, micro y mesofauna, la vegetación, afectan

también las actividades microbianas.

Los distintos factores actúan simultáneamente y resulta difícil el estudio integrado de los
efectos. En general, se varía uno de los factores, por ejemplo la temperatura de incubación y se
dejan los restantes factores a niveles constantes y óptimos. Se evalúa el crecimiento del
microorganismo en estudio determinando su velocidad de crecimiento, tiempo de generación o
la cosecha máxima (log Nº de células a las que llega con y sin la incidencia del factor en estudio).
Muchas veces se aprecian fracasos en aislamientos de organismos debido a pequeñas
variaciones en los niveles de nutrientes o en las condiciones de cultivo.

La comprensión de cómo los factores ambientales afectan el crecimiento microbiano permite

interpretar la distribución de los mismos en la naturaleza y diseñar métodos de control del
desarrollo microbiano y destruir organismos indeseados.

Efecto de algunos factores del ambiente Físicos y físico-químicos

● Temperatura

● Oxígeno y otros gases

● pH

● Presión osmótica

● Radiaciones

Temperatura: los microorganismos se encuentran en casi todos los ambientes, incluso los muy
extremos y cada uno presenta un rango de temperatura de crecimiento, con una temperatura
mínima, debajo de la cual no se evidencia el crecimiento, una óptima, donde este es máximo y
una máxima, por encima de la cual el crecimiento cesa (figura 9) (Madigan et al., 2000).
La mayoría de los habitantes de los ecosistemas naturales son mesófilos, incluidos los patógenos
de animales y el hombre. Se encuentran sicrófilos sobre glaciales, suelos congelados, a los que
colorean con sus pigmentos y son sobre todo algas y cianobacterias. La mayoría de los
microorganismos activos en suelos en períodos fríos del invierno se consideran mesófilos
resistentes al frío, más que verdaderos sicrófilos. Algunos hongos se desarrollan en heladeras
(5ºC) donde deterioran alimentos (cuadro 5).

Los termófilos son los más activos metabólicamente, sabemos que las reacciones químicas
duplican su velocidad por cada aumento de 10ºC de la temperatura, hasta un valor en que se
desnaturalizan macromoléculas importantes, como ácidos nucleicos, proteínas, etc.

pH

Si bien el pH interno de las células es neutro, los microorganismos poseen mecanismos de

control de entrada y salida de protones y cationes a nivel de la membrana y pueden desarrollarse
en amplios rangos de concentración hidrogeniónica (cuadro 6).

En ambientes de pH bajo dominan bacterias fermentativas, como las lácticas, las anaerobias y
hongos, que si bien son neutrófilos como grupo, se favorecen en ambientes ácidos por falta de
competencia de las bacterias. Los medios de cultivo se acidifican con ácidos orgánicos, láctico,
acético, ya que penetran en la célula sin disociarse y dentro liberan los protones que alteran el
pH interno de las células, más eficientemente que los ácidos inorgánicos, disociados.

Por el efecto sobre el pH del ambiente se distinguen micoorganismos:

● acidófilos: bajan el pH de restos vegetales en los silos, de suelos, en la leche, por producción
de ácidos (láctico, etc.) o consumo de álcalis, como el amonio

● alcalinizantes: suben el pH del ambiente por consumo de ácidos (deterioro de los silos al
descender el ácido láctico), o por liberación de bases, como aminas, amonio.
Para mantener el crecimiento de los microorganismos se agregan a los medios o bien sustancias
con carácter ácido o alcalino (carbonato de calcio; ácidos orgánicos) o pares de sustancias con
carácter tampón (buffers), como el par fosfato: K2HPO4 y KH2PO4 (figura 10). Estas sustancias
permiten el crecimiento durante más tiempo y resultan imprescindibles en la industria, donde
se requiere llegar a altos números de células por mL.

Gases

El oxígeno afecta a los microorganismos y éstos se clasifican por sus relaciones con este gas
(cuadro 8 y figura 12).
Factores químicos

Las sustancias químicas pueden ejercer distintos efectos sobre el desarrollo de los
microorganismos:

● no afectarlo

● estimularlo, son los nutrientes

● inhibirlo, sustancias microbiostática y microbicida, con y sin lisis (microlítica)

La figura 15 muestra alguno de estos efectos en un cultivo bacteriano creciendo

exponencialmente en un medio líquido. En el momento indicado por la flecha se ha agregado
una concentración inhibitoria de la sustancia en estudio. Se aprecia diferencia en los recuentos
de células totales y de viables, consecuencia de la lisis celular.

La ubicación de una sustancia química en alguna de estas categorías es muchas veces arbitraria
ya que una misma sustancia puede ser nutriente o bacteriostático dependiendo de la
concentración, como es el caso de los azúcares que al 1% son nutrientes para la mayoría de los
microorganismos, pero a altas dosis previenen el crecimiento por plasmolisis (conservación de
alimentos).

Prácticamente cualquier sustancia orgánica de origen biológico es utilizada por algún grupo de
microorganismo. Aquellas sustancias naturales o artificiales que se acumulan en los ecosistemas
a concentraciones no deseables para las comunidades naturales, se denominan recalcitrantes
(capítulo 22).

Por su toxicidad, las sustancias químicas se clasifican en:

● toxicidad no selectiva, el agente actúa sobre todo tipo de células: microbianas, del
hospedante. Son conocidos los antisépticos, que son efectivos sobre mucosas (colorantes, sales
de mercurio, etc.) y los desinfectantes aplicados sobre superficies inertes (alcoholes, jabones,
cresoles). Esta separación también es arbitraria, pues los efectos dependen de la concentración.
Actúan, en general, a altas concentraciones.

● toxicidad selectiva, son más tóxicos para las células microbianas (incluso para Gram positivas
y no para Gram negativas) y son inocuas para las células del hospedante. Estos son los agentes
quimioterapéuticos, de gran empleo en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Son
efectivas a muy bajas concentraciones.

Los factores que influyen en la acción antimicrobiana son:

a) concentración del agente químico

b) temperatura en que se emplea

c) tipo y concentración del microorganismo

d) naturaleza del material a tratar

Por sus efectos en el equilibrio biológico en ambientes naturales analizaremos el efecto de

algunas de estas sustancias: las bacteriocinas, las toxinas, enzimas, antibióticos en los capítulos
14 y 20.

El cuadro 10 señala conceptos referentes a sustancias que actúan como desinfectantes: usados
para la reducción o eliminación de microorganismos en objetos inanimados, como mesadas,
pinzas, como son los alcoholes, formaldehido, compuestos fenólicos, detergentes. Son en
general más corrosivos que los empleados como antisépticos, los que pueden emplearse
además, en tejidos animales, como la piel y mucosas (nitrato de plata, ciertos colorantes, los
organo-mercuriales).

Muchas veces una misma sustancia puede actuar de una u otra forma, según la concentración.

Agentes quimioterapéuticos
 Los agentes quimioterapéuticos se emplean para el control microbiano dentro del huésped,
deben reconocer estructuras celulares microbianas y no actuar sobre las mismas estructuras del
organismo superior (acción selectiva). Son sustancias químicas utilizadas para matar o inhibir
microorganismos dentro del cuerpo humano; poseen toxicidad selectiva: actúan sobre las
células de algunos microorganismos y no sobre las células del tejido humano, para esto su acción
debe estar dirigida a estructuras o funciones exclusivamente microbianas.

Los más empleados son las sulfanilamidas o análogos de factores de crecimiento y los
antibióticos.

Bibliografia

 file:///D:/Descargas/microlobiologa_bsica_ambiental_y_agricola_lilian_friomi_2006
%20(2).pdf
 https://es.scribd.com/doc/128794514/Biologia-de-los-Microorganismos-Brock-10ed-
pdf
 https://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=arti
cle&id=462&Itemid=528

EXPOSICION DE MICROBIOLOGIA APLICADA A LA

INDUSTRIA DE ALIMENTOS.
TEMA:
CRECIMIENTO MICROBIANO, METODOS Y RECUENTO.
En microbiología, el crecimiento microbiano se define como el incremento del número
de células o de masa microbiana, a partir de cualquier método de división celular. Este
crecimiento es algo esencial en el funcionamiento de los microorganismos porque una
célula individual posee un periodo de vida determinado en la naturaleza y de esta forma
permite la permanencia o subsistencia de la especie.
Para que ocurra o se lleve a cabo el proceso de crecimiento microbiano es importante que
tenga lugar en un medio adecuado de nutrientes y condiciones para el desarrollo, conocido
como medio de cultivo, que puede ser artificial o natural. Los microorganismos captan
todos estos nutrientes y elementos esenciales a través de mecanismos de transportes a
través de la membrana celular.
Ahora bien, se puede considerar el crecimiento individual de los microorganismos que
equivale al ciclo celular o el crecimiento colectivo; es decir, crecimiento de poblaciones.
El ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados entre sí, que
comienza con la formación o la preparación de la célula madre para obtener 2 células
hijas. Los ciclos celulares se describen en su mayoría a partir de eventos identificables
que ocurren en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos
hace falta que se complete el anterior. Se dividen en las siguientes fases:
 Fase C, replicación del ADN cromosómico.
  Fase D, se distingue porque su terminación coincide con el final de la división
celular.
 Fase innominada, equivalente a la G1 eucariótica.

Basándonos en esto, podemos realizar una medida del crecimiento de las poblaciones
bacterianas, donde se toman muestras en diversos momentos de su desarrollo en un medio
de cultivo. Como se mencionó anteriormente, el crecimiento de una población o cultivo
bacteriano se puede expresar en función de:
 Aumento de masa de cultivo.
 Aumento en el número de células.

Para la medida de masa celular existen dos métodos, ya sea de manera directa o indirecta.
METODOS DIRECTOS
 Determinación de peso húmedo.
Se tara un tubo de centrifuga, para luego centrifugar el cultivo eliminando el
sobrenadante y a eso se le determina el peso.
 Determinación de peso seco.
Como el método anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105°C
toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar
el 10-15% de los valores de peso húmedo.
 Determinación del nitrógeno total.
Se aplica la técnica de micro-Kjeldahl.
 Determinación de un componente característico.
Peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofila en organismos
fotosintéticos, etc.

METODOS INDIRECTOS
 Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por
unidad de tiempo.
Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2),
determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.
  Métodos turbidimétricos (ópticos).
Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos
métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a
través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que
cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión
de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.
a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio
de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la
absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión).
Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de
A con la masa bacteriana en una muestra problema.
b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está
situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se
mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotómetro.

Para la medida del número de individuos, también existen dos métodos, que pueden ser
de forma directa e indirecta.
METODOS DIRECTOS

Los microorganismos se pueden reproducir por medio de fisión binaria; que es un proceso
en el cual una célula se divide para formas 2 células hijas idénticas, sin lugar a duda es
uno de los procesos más simples y más comunes de reproducción por parte de
microrganismos. Esto ocurre cuando la célula aumenta de tamaño, replica si ADN y la
pared celular y la membrana citoplasmática comienzan a crecer hacia adentro a partir de
direcciones opuestas formando una partición conocida como Septo donde finalmente cada
célula hija recibe una copia de los cromosomas, los ribosomas, complejos
macromoleculares.
Además, existe un método diferente al de bipartición, conocido como gemación donde se
produce una versión en miniatura de la etapa adulta: una yema crece directamente sobre
el cuerpo del adulto, obteniendo todos los nutrientes de su progenitor y que una vez esta
se haya desarrollado completamente, esta se desprende y se hace independiente.
Sin embargo, existen fenómenos parasexuales entre los microorganismos, este tipo de
procesos lo que involucra es una recombinación de ADN mediante la transferencia de
parte del material genético de una célula donante a una receptora. Existen 3 métodos que
son:
 Conjugación: es la transferencia de material genético entre las células y que se
hace por contacto directo.

 Transducción: es la transferencia de material genético por los bacteriófagos,

quienes luego de la primera infección, llevan parte de dicho material de la bacteria
infectada a otra bacteria a la cual será inyectado.
 Transformación: es la transferencia de material genético libre sin contacto celular
o la existencia de algún intermediario viral.