EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

ENZIMÁTICA

EFFECT OF TEMPERATURE ON ENZYMATIC REACTION SPEED

Andrade Hernández Joycy1, Medina Domínguez Eber1, Narváez Gómez

Paula1, Támara Ortega Hernán1.
1Facultad de Ingeniería, Ingeniería Agroindustrial, Universidad de Sucre.

RESUMEN ABSTRACT

La α-amilasa es conocida por The α-amylase is known to possess

poseer la facultad de aumentar la
velocidad para alcanzar el equilibrio
de la reacción en la que se
encuentra, determinada por factores
entre ellos, uno de los que tiene
mayor relevancia es la
concentración de sustrato. En el
siguiente trabajo se determinó cómo
afecta el cambio de temperatura la
actividad enzimática. Dentro de los
resultados obtenidos se encontró
𝑐𝑎𝑙
que la Ea fue 3374.28𝑚𝑜𝑙 ,
considerándose pequeña. Con el
cálculo de la actividad enzimática,
se puede analizar el
comportamiento de la reacción a
partir de la relación de velocidad y
concentración de sustrato, durante
el proceso ejercido por la enzima en
la solución de almidón, hasta la
obtención de sus productos.
the ability to increase the speed to
reach the equilibrium of the reaction
in which it is found, determined by
factors among them, one of the most
relevant is the substrate
concentration. In the following work
it was determined how the change of
temperature affects the enzymatic
activity. Within the obtained results it
was found that the Ea was
3374.28cal / mol, considered small.
With the calculation of the enzymatic
activity, the behavior of the reaction
can be analyzed from the ratio of
speed and concentration of
substrate, during the process
exerted by the enzyme in the starch
solution, until obtaining its products.
Keywords: Starch, enzyme,
temperature, Arrhenius

Palabras claves: Almidón, enzima, INTRODUCCIÓN

temperatura, Arrhenius
La historia moderna de las enzimas
comenzó en 1833, cuando el
francés Papeyen logro aislar el
componente activo α-amilasa en la
malta, el cual llamó diastasa. Luego
de que no hubiese acceso a fuentes
tradicionales de azúcar y se
empleara la acción catalítica no
especifica del ácido que daba lugar
a la formación de productos de
sabor y color indeseables.
Obtener una ecuación cinética que
reproduzca las conversiones en
función del tiempo es difícil, debido,
fundamentalmente a que el almidón
es una mezcla de amilopectina y
amilasa (20.50%); esto conlleva a
una estructura compleja en donde
existen ramificaciones y diferentes
tipos de enlaces, α(1.4) y α(1-6), que
son hidrolizados por distintas
enzimas. También la mezcla de
almidón y productos de reacción
varían en función del tiempo de
hidrolisis y está formada por
sacáridos de diferentes pesos
moleculares y durante el proceso de
hidrolisis pueden producirse
reacciones de reversión (Gallegos,
2005). Por estas razones, la
mayoría de los autores que estudian
la hidrolisis del almidón con
diferentes enzimas, se limitan a
evaluar las velocidades de reacción
aplicando la ecuación de Michaelis-
Menten y determinan los parámetros
Km y Rm, o proponen modelos
empíricos que de alguna forma
explican sus resultados empíricos.
(Nouri, 1993). Durante la hidrólisis
enzimática se rompen los enlaces
α(1-4) y α(1-6) presentes en el
almidón para liberar cadenas más
cortas: dextrinas, maltosa y glucosa.
Las enzimas actúan
específicamente sobre un tipo de
enlaces o en algunos casos sobre
los dos.
La velocidad de una reacción
enzimática varía al aumentar la
temperatura. Esto es, la velocidad de
una reacción enzimática se incrementa
al aumentar la temperatura dentro de un
determinado rango. La temperatura a la
cual la actividad catalítica es máxima se
llama temperatura óptima, como
podemos ver en la figura 1; por encima
de esta temperatura, el aumento de la
velocidad de la reacción debido a la
temperatura es contrarrestado por la
pérdida de actividad catalítica debida a
la desnaturalización térmica, y la
actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse. A
valores superiores la actividad
disminuye debido a que la enzima como
cualquier otra proteína sufre procesos
de desnaturalización por lo tanto de
inactivación. (Anonimo, 2011)
Figura 1: Efecto de la temperatura
en la velocidad de reacción.

Cada reacción tiene su propia
constante de velocidad
característica k, su valor depende de
las condiciones de la reacción, en
especial de la temperatura. Esta
dependencia con respecto a la
temperatura se expresa a través de
la ecuación de Arrhenius, quien
observó que la que la mayoría de
reacciones mostraba un mismo tipo
de dependencia con la temperatura
(Carvajal, 2016), como muestra la
ecuación:
𝐾 = 𝐴𝑒 −𝐸𝑎⁄𝑅𝑇
Esta práctica tuvo como objetivo
demostrar cual es el efecto
de la temperatura sobre las
reacciones enzimáticas y la
velocidad de reacción calculando el
valor de la energía de activación de
la reacción catalizada por la enzima
α-amilasa.
METODOLOGÍA
La práctica se realizó en la planta perico
de la Universidad de Sucre; en la que se
buscaba determinar la actividad
enzimática de la 𝛼 − Amilasa variando la
temperatura desde 42°C hasta 77°C,
siendo en total seis ensayos con seis
temperaturas. Al iniciar se elaboró la
curva de calibración, depositando en un
beaker 50 mL de agua destilada, para
luego en 10 tubos de ensayo preparar el
blanco y 9 soluciones con diferentes
concentraciones de glucosa y la misma
cantidad de agua para cada uno, se
adicionó el 3-5 DNS. De cada muestra
se tomó 0,25mL y se adicionó 0,25mL
de 3-5 DNS para ser sometido a choque
térmico (5 minutos en agua
aproximadamente a 100°C y 5 minutos
en hielo), se agrega 2,5mL de agua
destilada y se procede a agitar para
homogeneizar la muestra y realizar
posterior lectura en el espectofotómetro
a 540nm.
La preparación de los ensayos fue con
un volumen de 100 ml, en biorreactores;
luego se inició la biorreacción, a través
de un baño de los biorreactores hasta
que se alcanzó la estabilización de cada
temperatura a trabajar en las soluciones
𝜇𝐿
a 300 rpm; se adicionó 100 ⁄𝑔 𝑆𝑙𝑛 𝐸
de la enzima (𝛼 − Amilasa), y
𝜇𝑔
100 ⁄𝑔 𝑑𝑒 𝐴𝑙𝑚𝑖𝑑ó𝑛 del activador
enzimático (CaCl2). Durante intervalos
de tiempo de 0, 25, 50 y 75 minutos, se
tomaron 2 ml de la muestra se
depositaron en tubos de ensayo de tapa
rosca, se les realizó dilución con agua
destilada, y posterior toma de 0,25 ml a
los cuales se le adicionaron 0,25 mL de
reactivo DNS para posteriormente
realizar un choque térmico, estando 5
minutos en ebullición y 5 minutos en
hielo, luego se adicionó 2,5 mL de agua
destilada, y se homogenizó para la
lectura en el espectofotómetro.
Los azúcares reductores fueron
determinados por la siguiente
ecuación:
𝐴𝑅 = 𝑎(𝑎𝑏𝑠) + 𝑏
Y= 2,3852 (x) – 0,0384
Luego se hallaron las velocidades y
posteriormente la energía de activación
mediante la ecuación de Arrhenius y el
factor de frecuencia (A).
RESULTADOS
A partir de la ecuación de la curva de
calibración, se obtuvieron los datos de la
concentración de azucares reductores. según la ecuación de Arrhenius,
Teniendo en cuenta estos datos se para determinar la Energía de
graficó concentración de azucares activación (Ea) y el factor de
(variable dependiente) vs tiempo
frecuencia (A).
(variable independiente) (Grafica 1) y
se tomaron las pendientes arrojadas
como las velocidades de reacción ;
(Tabla I), seguidamente se graficó
Temperatura (°C) vs Velocidad para
observar el comportamiento de esta
última a medida que la temperatura
aumentaba (Grafica 2). Ln(V) vs 1/T
1
INSERTAR 0.5

Ln(V)
GRÁFICA 0
0.0028
y = -2096.9x + 6.7772
R² = 0.5003
0.0029 0.003 0.0031 0.0032
-0.5
Gráfica 1: Concentración de azucares 1/T
vs Tiempo

T (°C) V(g/(L*min)
42 0.8158 Grafica 3: Ln(V) vs 1/T.
𝐸𝑎
49 1.5 Igualando− a la pendiente y
𝑅
56 1.997 𝑐𝑎𝑙
utilizando un R de 1.98 se
𝑚𝑜𝑙∗𝐾
63 2.1481 𝑐𝑎𝑙
70 1.6693 calculó una Ea= 3374.28𝑚𝑜𝑙 así
77 1.864 mismo igualando Ln(A) al intercepto
Tabla 1: Temperatura vs Velocidad y despejando se tiene un A= 6.5025

ANÁLISIS DE RESULTADOS
Velocidad vs Temperatura
2.5 Analizando la gráfica 2 se puede
Velocidad (g/(L*min)

2
observar que al aumentar la
1.5
temperatura de la reacción hay
1
0.5
incremento de la velocidad de
0 reacción hasta llegar a los 63°C
0 20 40 60 80 100 donde se observa su máxima
actividad, sin embargo, al sobre
Temperatura
pasar esta temperatura esta decae
Gráfica 2: V vs T abruptamente; esto debido a que la
gran mayoría de las enzimas
Posteriormente se procedió a conocidas son proteínas y por lo
graficar Ln(V) vs 1/T (Grafica 3) tanto son susceptibles a los mismos
factores que desnaturalizan a las CONCLUSIONES
proteínas, como el calor, los ácidos
fuertes, los metales pesados y los
detergentes (Stryer, 1988).

BIBLIOGRAFÍA
Un aumento de temperatura
aumenta la velocidad de la reacción,
Anonimo. (2011). Enzimología. En
con independencia de que ésta sea Anonimo, Cinetica_enzimatica
exotérmica o endotérmica. La (pág. 122). 125.
explicación está en el hecho de que, Carvajal, L. (2016). QUÍMICA PARA
al aumentar la temperatura, INGENIEROS. Recuperado el
aumenta el número de moléculas Marzo de 2018, de QUÍMICA
con una energía igual o mayor que PARA INGENIEROS:
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la energía de activación, con lo que
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aumenta el número de choques ejercicios/
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El efecto de la temperatura sobre la Recuperado el Marzo de 2017,
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Nouri, M. (1993). Hidrólisis enzimática
con energía de activación grande de harina detrigo, Tesis
son muy sensibles a la temperatura Doctoral. Granada:
y las reacciones con energía de Departamento de Ingenieria
activación pequeña son muy poco Quimica, Uniersidad de
sensibles a la temperatura Granada.
Stryer, L. (1988). Biochemistry. New
(Levenspeil, 2005) en el ensayo se
York: W. H. Freeman.
obtuvo una energía de activación de
𝑐𝑎𝑙
3374.28𝑚𝑜𝑙 , lo cual puede
considerarse pequeña es decir, la
reacción no es muy sensible a la
temperatura. Además, se deduce de
la ecuación de Arrhenius, que el
factor de frecuencia (A) no afecta a
la influencia de la temperatura sobre
la reacción. En una reacción real
puede haber una pequeña influencia
de la temperatura sobre este factor,
sin embargo, es muy pequeña y
puede despreciarse.