Validacion de Métodos

ANÁLISIS DE ALIMENTOS
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ANALÍTICOS
Dra. Roxana Verdini
rverdini@fbioyf.unr.edu.ar
2018
CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
Los laboratorios de análisis instrumental de
alimentos,
alimentos propiedades físicas y microbiología
pueden prestar servicios a clientes internos y externos
q
de análisis fisicoquímico y microbiológico
g para muestras
p
de alimentos.
Acorde
A d a la l política
líti d calidad,
de lid d los
l l b t i
laboratorios d
de
análisis deben trabajar con el objetivo de generar y
garantizar resultados confiables.
confiables
CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
El trabajo realizado en los laboratorios bajo los
lineamientos establecidos en la norma ISO/IEC
17025:2005, (NORMA ARGENTINA IRAM 301*
ISO/IEC 17025)) g garantiza el mejoramiento
j continuo,,
para el logro de la eficacia y eficiencia en los objetivos
del Sistema de Gestión de Calidad.
También EURACHEM que es una red de organizaciones

en Europa,
Europa que tiene el objetivo de establecer un
sistema de trazabilidad internacional de las mediciones
químicas y la promoción de buenas prácticas de calidad,
proporciona una Guía de Laboratorio para la
Validación de Métodos y Temas Relacionados.
EURACHEM
Proporciona un foro para la discusión de los problemas
comunes y para el desarrollo de un enfoque informado y
considerado que considera cuestiones técnicas y
políticas de decisión.
Promueve las
P l mejores
j prácticas
á ti en la
l medición
di ió analítica
líti
mediante la producción de una guía autorizada dentro de
sus grupos de expertos,
expertos guías de publicación en la web y
el apoyo a talleres para comunicar las buenas prácticas.
EURACHEM
La orientación incluye cuestiones técnicas como la
evaluación de la incertidumbre de medición, validación
de métodos y ensayos
y de aptitud .
También trabaja a través del enlace con los organismos

d acreditación
de dit ió y otras
t organizaciones
i i con intereses
i t en
la calidad de la medición para ayudar a asegurar
políticas prácticas de acreditación y promoción de las
provisiones técnicas sensibles en la regulación.
IRAM 301*
301 ISO/IEC 17025
Esta norma establece los requisitos generales para la
competencia en la realización de ensayos o de
calibraciones, incluido el muestreo.
Cubre los ensayos y las calibraciones que se realizan

utilizando:
métodos normalizados,
métodos no normalizados,,
métodos desarrollados por el propio laboratorio.
IRAM 301*
301 ISO/IEC 17025
Organización
Sistema de gestión
Control de los documentos
Revisión de los pedidos, ofertas y contratos
Subcontratación de ensayos y de calibraciones
Compras de servicios y de suministros
Servicio al cliente
Control de trabajos de ensayos o de calibraciones no conformes
Mejora
Acciones correctivas
Acciones preventivas
Control de los registros
Auditorías internas
Revisiones por la dirección

ORGANIZACIÓN
Debe ser una entidad con responsabilidad legal y tener una
dirección técnica con responsabilidad total ...
Debe realizar sus actividades de ensayo y de calibración de modo

que se cumplan los requisitos de esta norma ...
Debe tener personal que tenga los recursos necesarios para

desempeñar sus tareas ...
Debe tomar medidas para asegurarse de que su personal están

libres de cualquier presión o influencia indebida ...
Debe tener ppolíticas y procedimientos

p para
p asegurar
g la protección
p
de la información confidencial y los derechos de propiedad de sus
clientes ...
Debe proveer adecuada supervisión al personal encargado de los

ensayos y calibraciones ...
SISTEMA DE GESTIÓN
Debe establecer, implementar y mantener un

sistema de gestión apropiado al alcance de sus
actividades.
actividades
Debe documentar sus políticas, sistemas,

programas, procedimientos e instrucciones tanto
como sea necesario para asegurar la calidad de
los resultados de los ensayos o calibraciones.
La documentación del sistema debe ser

comunicada al personal pertinente, debe ser
comprendida por él, debe estar a su disposición y
debe ser implementada por él.
SUBCONTRATACIÓN DE ENSAYOS Y DE
CALIBRACIONES
Cuando un laboratorio subcontrate

un trabajo, se debe encargar este
trabajo a un subcontratista
competente
Un subcontratista competente es el
que, por ejemplo, cumple esta
norma para el trabajo en cuestión
COMPRAS DE SERVICIOS Y DE
SUMINISTROS
Deben existir pprocedimientos para

p
la compra, la recepción y el
almacenamiento de los reactivos y
materiales consumibles de
laboratorio que se necesiten para
los ensayos y las calibraciones
El laboratorio debe asegurarse de que

los suministros, los reactivos y los
materiales consumibles comprados
comprados, que
afectan a la calidad de los ensayos o de
las calibraciones, no sean utilizados
hasta que no hayan sido
inspeccionados…
SERVICIO AL CLIENTE
El laboratorio debe estar dispuesto a cooperar con los

clientes o sus representantes para aclarar el pedido del
cliente y para realizar el seguimiento del desempeño del
laboratorio en relación con el trabajo realizado siempre que el
laboratorio garantice la confidencialidad hacia otros clientes
Los clientes valoran el mantenimiento de una buena

comunicación,, el asesoramiento y los consejos
j de orden
técnico, así como las opiniones e interpretaciones basadas en
los resultados
El laboratorio debe procurar obtener información de retorno,

tanto positiva como negativa, de sus clientes
La información de retorno debe utilizarse y analizarse para

mejora rel sistema de gestión, las actividades de ensayo y
calibración y el servicio al cliente
QUEJAS
El laboratorio debe tener una

política y un p
p procedimiento para
p
la resolución de las quejas
recibidas de los clientes o de
otras partes
partes.
Se deben mantener los registros

de todas las quejas así como de
las investigaciones y de las
acciones correctivas llevadas a
cabo por el laboratorio
CONTROL DE TRABAJOS DE ENSAYOS
O DE CALIBRACIONES NO
CONFORMES
El laboratorio debe tener una política y
procedimientos que se deben implementar
cuando cualquier aspecto de su trabajo de
ensayo o de
d calibración,
lib ió o ell resultado
lt d ded
dichos trabajos, no son conformes con sus
propios procedimientos o con los requisitos
acordados con el cliente
Cuando la evaluación indique que el trabajo no

conforme p podría volver a ocurrir o existan
dudas sobre el cumplimiento de las
operaciones del laboratorio con sus propias
políticas y procedimientos, se deben seguir
rápidamente los procedimientos de acciones
correctivas
las quejas de los
clientes
las auditorías el control de la

internas o externas calidad
¿CÓMO
CÓMO IDENTIFICAR
las revisiones por TRABAJOS NO la calibración de
la dirección CONFORMES O instrumentos
PROBLEMAS?
el control de los
el control de los
informes de ensayo y
materiales
y certificados de
consumibles
calibración
la observación o la
supervisión del
personal
ACCIONES CORRECTIVAS
Cuando se necesite una acción correctiva, el

laboratorio debe identificar las acciones correctivas
posibles
Debe seleccionar e implementar la o las acciones con

mayor posibilidad de eliminar el problema y prevenir
su repetición
Las acciones correctivas deben corresponder en

importancia a la magnitud del problema y sus riesgos
El laboratorio debe documentar e implementar

cualquier cambio necesario que resulte de las
investigaciones de las acciones correctivas.
AUDITORÍAS INTERNAS
El laboratorio debe efectuar, periódicamente,

de acuerdo con un calendario y un
procedimiento predeterminados, auditorías
internas de sus actividades para verificar
que sus operaciones continúan cumpliendo
los requisitos del sistema de gestión y de
esta norma.
El programa de auditoría interna

debe considerar todos los
elementos del sistema de gestión,
incluidas las actividades de ensayo
y calibración
EXACTITUD Y CONFIABILIDAD DE LOS
ENSAYOS O DE LAS CALIBRACIONES
Intervienen factores:
humanos,
instalaciones y condiciones ambientales.
El grado con el que los factores contribuyen a la

i
incertidumbre
tid b t t l
total d
de l
la medición
di ió difi
difiere
considerablemente según los ensayos y calibraciones.
El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al

desarrollar los métodos y p
procedimientos de ensayo y y de
calibración, en la capacitación y la calificación del
personal, así como en la selección y la calibración de los
equipos
i utilizados.
tili d
PERSONAL
La dirección del laboratorio debe asegurar la
competencia de todos los que operan equipos
específicos, realizan ensayos o calibraciones,
evalúan los resultados y firman los informes de
ensayos
e sayos y los
os ce
certificados
cados de ca
calibración.
b ac ó
Cuando emplea personal en formación, debe

proveer una supervisión apropiada.
El personall que realiza

li t
tareas específicas
ífi d b
debe
estar calificado sobre la base de una educación,
capacitación una experiencia apropiadas y de
una capacitación,
habilidades demostradas, según sea requerido.
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Las instalaciones de ensayos o de calibraciones del
laboratorio,
laboratorio incluidas,
incluidas pero no en forma excluyente,
excluyente las
fuentes de energía, la iluminación y las condiciones
ambientales,, deben facilitar la realización correcta de los
ensayos o de las calibraciones.
El laboratorio
l b t i debe
d b asegurarse de d que las
l condiciones
di i
ambientales no invaliden los resultados ni comprometan
la calidad requerida de las mediciones.
mediciones
Se deben tomar p precauciones especiales

p cuando el
muestreo y los ensayos o las calibraciones se realicen
en sitios distintos de la instalación permanente del
laboratorio.
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Debe haber una separación eficaz entre áreas vecinas
en las q
que se realicen actividades incompatibles.
p
Se deben tomar medidas para prevenir la contaminación
cruzada.
Se deben controlar el acceso y el uso de las áreas que
afectan a la calidad de los ensayos o de las
calibraciones.
El laboratorio debe determinar la extensión del control en
función de sus circunstancias particulares.
Se deben
S d b t
tomar medidas
did para asegurar ell orden
d y la
l
limpieza del laboratorio.
Cuando sean necesarios se deben preparar
procedimientos especiales.
¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El laboratorio debe utilizar los métodos de ensayo o de
calibración, incluidos los de muestreo, que satisfagan
las necesidades del cliente y que sean apropiados
para los
l ensayos o las l calibraciones
lib i que realiza.
li
Se deben utilizar preferentemente los métodos

publicados como normas internacionales, regionales o
nacionales.
El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la última

versión
ió vigente
i t de
d lal norma, a menos que no sea
apropiado o posible.
Cuando sea necesario, la norma debe ser

p
complementada con detalles adicionales p
para asegurar
g
una aplicación coherente.
¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El cliente debe ser informado del método elegido.
g
El laboratorio debe confirmar que puede aplicar

correctamente
t t los
l métodos
ét d normalizados
li d antes
t d
de
utilizarlos para los ensayos o las calibraciones.
Si el método normalizado cambia, se debe repetir la

confirmación.
confirmación
También se pueden utilizar los métodos

desarrollados por el laboratorio si son apropiados
para el uso p
p previsto y si han sido validados.
¿SE PUEDEN APLICAR MÉTODOS
DESARROLADOS EN EL
LABORATORIO?
La introducción de los métodos de ensayo y de
calibración desarrollados por el laboratorio para su
propio
p p uso debe ser una actividad pplanificada y debe ser
asignada a personal calificado, provisto de los recursos
adecuados
Cuando sea necesario utilizar métodos no normalizados,

éstos deben ser acordados con el cliente y deben incluir
una especificación clara de los requisitos del cliente y del
objetivo del ensayo o de la calibración.
Los métodos desarrollados debe haber sido

validados adecuadamente antes del uso.
DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
U id
Una identificación
tifi ió apropiada
i d
El alcance
La descripción del tipo de ítem a ensayar o a calibrar
Los p
parámetros o las magnitudes
g y los rangos
g a ser determinados
Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos de funcionamiento
Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos
Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período de estabilización

que sea necesario
La descripción del procedimiento

MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Las mediciones analíticas deben realizarse para

satisfacer un requisito acordado (es decir, con
un objetivo
bj ti definido).
d fi id )
Las mediciones analíticas deben realizarse

utilizando métodos y equipos que han sido
g
probados para asegurar que son adecuados a
su propósito.
li las
El personall que realiza l mediciones
di i líti
analíticas
debe ser calificado y competente para
emprender la tarea asignada
asignada” (y demostrar que
pueden desempeñar el análisis apropiadamente).
MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Deberá existir una evaluación periódica e

independiente del desempeño técnico de un
l b t i
laboratorio.
Las mediciones analíticas hechas en un

laboratorio deben ser consistentes con
aquéllas que se realicen en cualquier otro
laboratorio.
L
Las i i
organizaciones h
que hacen di i
mediciones
analíticas deben tener procedimientos bien
definidos de control y de aseguramiento de
calidad.
VALIDACIÓN
La ISO define a la validación como la confirmación, a
través del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos
particulares
ti l para un uso específico
ífi previsto.
i t
El laboratorio debe validar los métodos no normalizados,

normalizados
los métodos que diseña o desarrolla, los métodos
p
normalizados empleados fuera del alcance p
previsto, así
como las ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados, para confirmar que los métodos son aptos
para ell fin
fi previsto.
i t
La validación debe ser tan amplia como sea necesario

para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o
p de aplicación
del campo p dados.
VALIDACIÓN
Es conveniente utilizar una o varias de las técnicas
siguientes para la determinación del desempeño de un
método:
calibración utilizando patrones de referencia o
materiales de referencia,
comparación con resultados obtenidos con otros
métodos,
comparaciones interlaboratorios,
evaluación
l ió sistemática
i t áti d los
de l f t
factores que influyen
i fl
en el resultado,
evaluación de la incertidumbre de los resultados
basada en el conocimiento científico de los principios
teóricos del método y en la experiencia práctica.
práctica
VALIDACIÓN
La gama y la exactitud de los valores que se obtienen
empleando métodos validados tal como fueron fijadas
para el uso previsto, deben responder a las necesidades
d los
de l clientes.
li t
incertidumbre de los resultados
límite de detección
selectividad del método
linealidad
repetibilidad o de reproducibilidad
robustez ante influencias externas
sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la

muestra o del objeto de ensayo
VALIDACIÓN – Enfoque de la
EURACHEM
La existencia de métodos analíticos confiables para la
realización de ensayos de laboratorio es indispensable para el
control de calidad e inocuidad de los alimentos.
La confiabilidad
L fi bilid d de
d un método
ét d se determina
d t i mediante
di t
procesos de validación.
La validación de un método es un requisito importante en la

práctica del análisis químico.
Hay varias preguntas:

é debe
porqué d b hacerse?
h ?
cuándo debe hacerse?
que necesita hacerse?
VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
Algunos analistas ven la validación de métodos como algo que
sólo puede hacerse en colaboración con otros laboratorios y
por consiguiente no la realizan.
Por ejemplo la comisión del Codex Alimentarius requiere

para que un método sea incluido ciertos datos sobre la
perfomance del mismo tales como: especificidad, exactitud,
precisión (repetitividad, reproducibilidad), límite de detección,
sensibilidad, aplicabilidad, practicidad, etc.
Este proceso de validación requiere extensos estudios
colaborativos.
Estos procesos de validación son muy complejos y pueden
requerir el análisis de 5 o más muestras y la participación
de 8 o más laboratorios.
Sin embargo no siempre los métodos incluidos en algunas
normas han sido sometidos a una validación tan compleja.
VALIDACIÓN - Enfoque de la ISO
¿Qué es la validación?
Según ISO la validación es la confirmación mediante examen

y suministro
i i t de
d evidencia
id i objetiva
bj ti de
d que se cumplen l los
l
requisitos particulares para un uso específico previsto (ISO
8402:1994).
Ésta se puede interpretar para la validación de un método

como ell proceso de
d definir
d fi i una necesidad
id d analítica
líti y confirmar
fi
que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño
consistentes con las que requiere la aplicación.
Está implícita la necesidad de evaluar las capacidades de

d
desempeñoñ del
d l método.
ét d
El criterio de la “conveniencia”
conveniencia del método es importante.
EURACHEM
En el pasado la validación del método tendía a concentrarse
sobre el proceso de evaluación de los parámetros de
desempeño.
E ell proceso de
En d validación
lid ió del ét d está
d l método tá implícito
i lí it que:
Los estudios para determinar los parámetros de
d
desempeñoñ se realizan
li usando
d equipos
i d t
dentro d
de
especificaciones, que están trabajando correctamente y
que están calibrados adecuadamente.
El operador que realiza los estudios debe ser
técnicamente competente en el campo de trabajo bajo
estudio y debe poseer suficiente conocimiento sobre el
trabajo a realizar con el fin de que sea capaz de tomar
d i i
decisiones apropiadas
i d a partir
ti de
d las
l observaciones
b i
hechas mientras avanza el estudio.
EURACHEM
VALIDACIÓN Y DESARROLLO
Generalmente se considera que la validación del método está
li d estrechamente
ligada t h t con ell desarrollo
d ll del
d l método.
ét d
No es fácil determinar exactamente donde termina el

desarrollo del método y donde empieza la validación.
Por lo
P l general,
l muchos
h de d los
l parámetros
á t d desempeño
de d ñ del
d l
método que están asociados a su validación son evaluados,
como parte del desarrollo del método.
¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
Millones de mediciones analíticas se realizan diariamente en

miles de laboratorios alrededor del mundo con diversos fines:
evaluar bienes para propósitos de comercio,

como apoyo a la
l salud,
l d
para verificar la calidad del agua para consumo
humano,
para el análisis de la composición elemental de una
l ió
aleación fi
para confirmar i i
su conveniencia l
en la
construcción de aeronaves,
en análisis
áli i f
forenses d
de fl id
fluidos corporales
l en
investigaciones criminales.
¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
El costo de realizar estas mediciones es elevado y surgen

costos adicionales de las decisiones tomadas en base a los
resultados.
lt d
Por ejemplo, las pruebas que muestran que algún alimento no

es adecuado para su consumo pueden resultar en demandas
por compensación; pruebas que confirmen la presencia de
d
drogas prohibidas
hibid podrían
dí ocasionar
i multas,
lt encarcelamiento
l i t
o más aún, la ejecución en algunos países.
Claramente
Cl t es importante
i t t determinar
d t i ell resultado
lt d correcto
t y
ser capaz de demostrar que lo es.
EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
El cliente espera poder confiar en los resultados reportados y
por lo general sólo los cuestiona cuando surge una
controversia.
De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara
responsabilidad de corresponder a la confianza del cliente
proporcionando la respuesta correcta a la parte analítica del
problema,
bl en otras
t palabras,
l b proporcionando
i d resultados
lt d que
han demostrado ser “adecuados a su propósito”.
Esto
E t lleva
ll i lí it que las
implícito l pruebasb realizadas
li d son apropiadasi d
para la parte analítica del problema que el cliente desea
resolver y que el informe final presenta los datos analíticos de
tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y sacar
conclusiones apropiadas.
La validación del método permite a los químicos demostrar
que el método es “adecuado para su propósito”.
EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
Para que un resultado analítico concuerde con el propósito
requerido, debe ser lo suficientemente confiable para que
cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con
confianza.
Así, el desempeño del método debe validarse y debe

estimarse la incertidumbre del resultado a un nivel de
confianza dado.
La incertidumbre
L i tid b deberád b á ser evaluada
l d y establecida
t bl id ded una
forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma
interna y fácil de interpretar.
La mayor parte de la información requerida para evaluar la

i
incertidumbre
tid b se puede
d obtener
bt d
durante
t la
l validación
lid ió del
d l
método.
ALGUNAS DEFINICIONES
La exactitud es la proximidad de concordancia entre el
resultado de una medición y el valor de referencia
aceptado.
La precisión es una medida de que tan cercanos están

los resultados unos con respecto a los otros y por lo
general se expresa mediante medidas tal como la
desviación estándar la cual describe la dispersión
p de los
resultados.
El sesgo es la
l diferencia
dif i entre
t ell valor
l esperadod de
d los
l
resultados de prueba y un valor de referencia aceptado.
Adicionalmente, una expresión cada ves más común de
Adicionalmente
exactitud es la incertidumbre de medición, la cual
g
proporciona una figura única de expresión de la
exactitud.
La evaluación
L l ió práctica
á ti de
d la
l veracidad
id d se fundamenta
f d t en
la comparación de la media de los resultados de un
método con relación a valores conocidos,
conocidos es decir,
decir la
veracidad se determina contra un valor de referencia (o
sea,, un valor verdadero o un valor verdadero
convencional).
Se dispone de dos técnicas básicas:
la verificación con respecto a los valores de

referencia de un material caracterizado,
la verificación con respecto de otro método

caracterizado.
Los valores de referencia son idealmente trazables a
patrones internacionales.
Los materiales de referencia certificados por lo

general se aceptan como medio de proveer valores
t
trazables
bl y por lo
l tanto,
t t ell valor
l ded referencia
f i es ell valor
l
certificado.
Para verificar la veracidad utilizando un material de

referencia, se determina la media y la desviación
estándar de una serie de réplicas de una prueba y se
compara contra el valor caracterizado del material de
f i
referencia.
El material de referencia ideal sería un material de
referencia certificado de matriz natural, muy semejante a
las muestras de interés.
Claramente la disponibilidad de estos materiales es

limitada.
limitada
Los materiales de referencia p

para una validación p
pueden
ser por consiguiente:
preparados por adición de materiales típicos con
materiales de referencia de pureza certificada u
otros materiales de p pureza y estabilidad
adecuadas,
materiales típicos bien caracterizados, de
estabilidad verificada internamente y
conservados para control de calidad interno.
Normalmente, la precisión se determina para
Normalmente
circunstancias específicas las cuales en la práctica
pueden ser muyy variadas.
Las medidas de precisión más comunes son la

“
“repetibilidad”
tibilid d” y la
l “reproducibilidad”.
“ d ibilid d”
La repetibilidad dará una idea de la clase de

variabilidad esperada cuando un método se ejecuta por
un solo analista, con un equipo en un período corto de
tiempo.
l muestra
Si la t se analizali i
por varios l b t i
laboratorios para
fines comparativos, entonces una medida de precisión
más significativa a usarse es la reproducibilidad.
reproducibilidad
Tanto la reproducibilidad como la repetibilidad
dependen generalmente de la concentración del
analito y deben determinarse a varias
concentraciones y de ser pertinente, deberá
establecerse la relación entre la precisión y la
concentración
t ió del
d l analito.
lit
La desviación estándar relativa puede ser más útil en

este caso puesto que la desviación estándar dividida por
la concentración es pprácticamente constante dentro del
intervalo de interés, a condición de que éste no sea
demasiado grande
La sensibilidad es efectivamente la pendiente de la
curva de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta
del instrumento que corresponde a un cambio en la
concentración del analito.
Cuando
C d se hah establecido
t bl id que la l respuesta
t es lineal
li l
con respecto a la concentración (o sea, dentro del
intervalo lineal del método) y se ha determinado la
intercección de la curva de respuesta, la sensibilidad es
un pparámetro útil ppara calcular y usar en fórmulas de
cuantificación.
L robustez
La b t did de
es una medida d lal efectividad
f ti id d del
d l
método analítico es qué tan buen desempeño se
mantiene aun sin una implementación perfecta.
perfecta
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
El análisis mediante recta de calibración puede hacerse
cuando sólo el analito de interés presenta señal analítica
o respuesta ((absorbancia, fluorescencia, potencial
eléctrico, corriente, etc.), o cuando la señal del blanco es
constante.
Las etapas que deben seguirse en un análisis mediante

recta de calibración son:
determinación del extremo superior del rango
lineal
preparación de patrones
medición de la respuesta de los patrones
estimación de los parámetros de la regresión
cálculo
ál l ded las
l cifras
if d mérito
de é it del
d l método
ét d
predicción en muestras incógnita
Determinación del extremo superior del
rango lineal
Esta etapa es fundamental, ya que la regresión lineal
está basada en la suposición de que los datos de
respuesta analítica están linealmente relacionados
con la concentración del analito.
Si se sospecha que existen desvíos de la linealidad, se
recomienda realizar un análisis exploratorio
p previo
p
cuyo objeto es extender el rango de aplicabilidad de la
técnica analítica a la máxima concentración posible.
En dicho análisis, se incluyen patrones de concentración
conocida del analito desde cero hasta valores q que se
desvíen visiblemente de la linealidad.
Preparación de patrones
Una vez estimado el extremo superior del rango lineal de
la técnica, deben prepararse patrones de concentración
conocida dentro de dicho rango, e incluyendo el valor
cero de concentración del analito (blanco).
Usualmente, se preparan varios patrones (como mínimo

Usualmente
cinco) con concentraciones igualmente espaciadas entre
cero y el extremo superior del rango lineal,
lineal y cada patrón
se analiza por triplicado.
Debe ponerse especial cuidado en la preparación de los

patrones del analito para la calibración, de manera que
l
las concentraciones
t i d calibrado
de lib d se conozcan con la l
máxima precisión posible.
Este requisito se relaciona con el hecho de que la recta
de regresión se ajusta mediante ecuaciones que
suponen que los valores del eje x (concentraciones)
tienen una incertidumbre considerablemente menor que
los del eje y (respuestas).
Por ejemplo, si se realizan mediciones de absorbancia

como respuesta, podemos suponer que el nivel de
incertidumbre en la respuesta puede ser de alrededor de
0,005 unidades de absorbancia.
Si los valores de las respuestas son, en promedio, de 1

unidad de absorbancia, esto implica un nivel relativo de
incertidumbre de aproximadamente 0,5% en la
respuesta.
Por lo tanto, se deben preparar patrones de calibrado
cuyas concentraciones se conozcan con un error menor
al 0,5%.
Preparar soluciones de calibrado, por ejemplo, con

incertidumbres del orden del 0,1%
0 1% en promedio,
promedio requiere
pesar más de 100 mg de reactivo, preparar soluciones
en matraces calibrados de al menos 100 mL, mL tomar
alícuotas con pipetas aforadas calibradas, etc.
Medición de la respuesta de los patrones
Una vez preparados los patrones de concentración
conocida, se miden sus respuestas analíticas,
incluyendo réplicas de cada medición.
Usualmente cada patrón se mide por triplicado.
Es importante establecer la siguiente nomenclatura: si se

emplean 6 patrones, cada uno por triplicado, entonces el
número de niveles diferentes de concentración (p) es 6,
y el número total de puntos de la recta de calibrado (m)
es 18.
Estimación de los parámetros de la
regresión
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión
lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al
origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B.
Los valores estimados de A y B se calculan mediante las

siguientes ecuaciones:.
regresión
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión
lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al
origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B.
Los valores estimados de A y B se calculan mediante las

siguientes ecuaciones:.
regresión
Además de los valores individuales de A y B, es
importante tener una idea de su incertidumbre asociada,
ya que los datos instrumentales llevan asociados un
error que depende del ruido instrumental, y el ajuste por
cuadrados mínimos sólo provee estimaciones de la
pendiente y ordenada al origen.
Los desvíos estándar en los parámetros A y B se

calculan con las siguientes ecuaciones:
regresión
En las ecuaciones precedentes, el parámetro sy/x es el

desvío estándar de los residuos de la regresión
g y está
dado por:
regresión
donde yi es la respuesta experimental de cada patrón de

calibrado e yî representa la respuesta estimada en cada
punto, esto es, yî = A xi + B.
Se emplean m – 2 grados de libertad,

libertad ya que hay m
datos disponibles, y 2 parámetros estimados en la
regresión (A y B).
Estos parámetros estadísticos dan también una idea

de la bondad de la regresión.
regresión
Es deseable que sy/x sea lo más pequeña posible; no
obstante su valor está limitado por el ruido instrumental.
La distribución de los residuos, es decir, el modo en que

los valores de (yi – yî ) varían con la respuesta, cumple
también un papel importante en el análisis de la
adecuación de los datos al modelo lineal.
lineal
Cifras de mérito del método
Las cifras de mérito de un método analítico se utilizan
regularmente con el propósito de calificar un
determinado método y comparar sus propiedades
analíticas con las provistas por otras técnicas.
Incluyen, entre otras,

Incluyen otras las siguientes:
sensibilidad de calibración
sensibilidad
ibilid d analítica
líti
límite de detección
límite de cuantificación
rango dinámico
rango lineal
Sensibilidad
La sensibilidad de calibración no es adecuada para
comparar dos métodos analíticos cuando estos están
basados en respuestas de diferente naturaleza (por
ejemplo, absorbancia y fluorescencia, o absorbancia y
medidas electroquímicas, etc.).
Para ello es preferible utilizar la llamada sensibilidad

analítica γ,
γ definida por la relación entre la sensibilidad y
el ruido instrumental:
donde sy es una medida conveniente del nivel de ruido

en la respuesta.
Sensibilidad
Para estimar el nivel de ruido pueden usarse dos
procedimientos, que en teoría deberían coincidir.
En el primero, se estima el ruido instrumental (sy) a

través de los desvíos de las réplicas de las mediciones
de calibrado respecto de sus promedios.
promedios
En el segundo método de estimación del nivel de ruido,

se lo estima como el desvío estándar de los residuos de
la regresión lineal, el parámetro ya definido sy/x
Límite de detección (LOD)
Es la mínima concentración detectable de manera
confiable por la técnica.
En la definición moderna, el límite de detección (LOD) se

calcula en función del desvío estándar de la
concentración predicha para una muestra blanco (s0)
n
Límite de detección (LOD)
De este modo, el LOD está dado por:
LOD = 2 × t0,05,m–2 × s0
definición que ha sido adoptada también por IUPAC e

ISO.
ISO
En la p
práctica,, dado q
que m es un número relativamente
grande, el valor de (2×t0,05,m–2) tiende a 3,3, por lo que
una ecuación aproximada para el límite de detección es
LOD = 3,3 s0
Límite de cuantificación (LOQ)
Es la mínima concentración cuantificable en forma
confiable.
Este parámetro (LOQ) se toma como la concentración

correspondiente a 10 veces el desvío estándar (en
unidades de concentración) del blanco,
blanco con lo cual:
LOQ = 10 s0
De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) para

una concentración igual al LOQ es del 10%, nivel que se
toma convencionalmente como el máximo DSR
aceptable para cuantificar el analito en una muestra.
muestra
Rango dinámico
Se considera que va desde la menor concentración
detectable (el LOD) hasta la pérdida de relación entre
respuesta y concentración.
El rango dinámico es también el rango de aplicabilidad

de la técnica.
técnica
En la zona de pérdida de la linealidad, podría aplicarse,

en principio, un método de regresión polinómica para la
calibración (o algún otro de naturaleza no lineal), de
modo que nada impide que dicha zona sea utilizada con
propósitos predictivos.
Rango dinámico
Rango lineal
Se considera que el rango lineal comprende desde la
menor concentración que puede medirse (el LOQ) hasta
la pérdida de la linealidad.
La prueba estadística que se utiliza para determinar si

los datos se ajustan a la ley lineal es la F: en primer
lugar se calcula un valor "experimental" de F, dado por:
Rango lineal
Luego se compara este valor con el crítico que se
encuentra en tablas de F (de una cola) para m – 2 y m –
p grados de libertad, y un determinado nivel de
confianza, por ejemplo 95%.
Si Fexp < F, F se acepta que los datos se comportan

linealmente.
Alternativamente, se calcula la probabilidad pF asociada

a este valor de Fexp, y se considera que la prueba de
linealidad es aceptada si pF > 0,05.
Otro parámetro obtenido en el análisis de regresión es el
coeficiente de determinación o de regresión, R2.
El coeficiente casi siempre tiene un valor cercano a la

unidad, que es el máximo valor que puede alcanzar.
Pero no debe mal interpretarse puesto que un

coeficiente de correlación de 1, no necesariamente
significa que la linealidad sea buena, sino que el
numerador y el denominador de la expresión anterior se
cancelan mutuamente.
fi i t de
El coeficiente d correlación
l ió sólo
ól es otro
t indicio
i di i adicional
di i l
que debe sumarse al análisis de los residuos.
BIBLIOGRAFÍA
.
NORMA ARGENTINA IRAM 301* ISO/IEC 17025. Cuarta

edición. 2005-09-05.
Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y

T
Temas R l i
Relacionados.
d EURACHEM 2005.
EURACHEM. 2005 Disponible
Di ibl en:
http://www.metroquimica.com.ar/descargas/Eurachem-
Guia-Validacion-CNM-MRD-030-2da-Ed pdf
Guia-Validacion-CNM-MRD-030-2da-Ed.pdf
La Calibración en Química Analítica. Goicoechea, HC y

Olivieri, AC. Editorial UNL, 2007.

Validacion de Métodos

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ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Dra. Roxana Verdini

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