PRÁCTICA Nº 04

I. INTRODUCCIÓN:

II. TITULO:

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMO DEGRADADORES DE MATERIA ORGÁNICA.

III. OBJETIVO:

1.1 Aislar microorganismo de lodo activo

IV. MATERIAL:

Material Biológico:

 Lodo activo superficial (cernido)

Material de Laboratorio:

 Placas Petri estériles servidas con Agar Almidón (1 / mesa)

 Placas Petri estériles servidas con Agar Leche al 5% (1 / mesa)
 Placas Petri estériles servidas con Agar Yema de Huevo al 5% (1 / mesa)
 Placas Petri estériles servidas con Agar Almidón (1 / mesa)
 Pipetas (de 1 ml /mesa).
 Frascos con 4.5 ml de SSF (5 / mesa).
 Set de Gram
 Frascos con PCA inclinado
 Guantes impermeables
 Mascarilla
 4 Mecheros
 Láminas portaobjetos.
 1 paquete de algodón
 litros de ron de quemar
 litros de alcohol (Tipo: Industrial)
 Tintura de yodo
 1 rollo de papel toalla

Medio de Cultivo:

 Medio de cultivo para recuento (PCA)

V. PROCEDIMIENTO:

1. Conseguimos ½ L de muestra eliminando los residuos solidos y filtrando.

2. Tomamos una alícuota de 1ml, de la muestra de lodo activo.

3. Procedemos a hacer las respectivas diluciones hasta 10-5:

1 ml 1 ml
1 ml 1 ml 1 ml

Frascos de penicilina conteniendo

4 ml de disolución de
4.5 ml de solución salina
agua y muestra

4. Por el método de siembra: en superficie se coloca en placas estériles secas una dilución y
luego se la extiende.
5. En la siembra por superficie se colocó 0.1 mL de las disoluciones 10-4 y 10-5 por duplicado
en placas Petri.
 NOTA: El método de siembra por incorporación se lleva a una temperatura de 20°C o a
temperatura ambiente.

6. Llevar las placas Petri a incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.

7. Procedemos a observar las diferentes colonias que colocándolas en el microscopio,
tomando nota sus características macroscópicas. Estás serán transcritas a una tabla.
8. Con ayuda de la coloración GRAM, procedemos a observar características microscópicas,
anotando cada detalle encontrado.
Coloración GRAM:

1º Una vez elegida la colonia a observar, tomamos una asada y la colocamos sobre una
lámina porta objetos para hacer la coloración GRAM. De esta manera podemos observar
sus características.

2º Realizamos el proceso de fijación de la muestra, para esto hacemos uso del mechero
sometiendo a calor la lámina, para así fijar la muestra al cristal y evitar que se mueva.

3º Añadimos violeta de genciana, dejándola reposar por 1 minuto.

4º Fijamos nuevamente la muestra agregando lugol y dejándolo reposar por 3 minutos

aproximadamente.
 5º Enjuagamos con alcohol cetona, con el propósito de decolorar las bacteria GRAM (-), ya
que solo se busca observar las bacterias GRAM (+)

6º Para finalizar agregamos la safranina, dejándola actuar por 30 segundos.

NOTA: Lugo de cada paso se busca limpiar la muestra, agregándole agua y secándola con
el fuego del mechero.

9. Procedemos a evaluar los Halos de hidrólisis, que se manifiestan debido a la degradación

enzimática por parte de las bacterias. De acuerdo a este parámetro es que determinamos
la existencia de microorganismos encargados de esta función.

VI. RESULTADOS

TABLA Nº 01: Características macroscópicas de las poblaciones microbianas

Observaciones Macroscópicas
Colonia
Tamaño Color Aspecto Borde
1 Pequeño Anaranjado Plano Irregular
2 Grande Crema Plano Regular
3 Grande Crema Plano Irregular

*Las 3 muestras presentan una coloración turbia

* La muestra Nº 01 presenta una característica especial, se observó un punto anaranjado

Después de haber realizado la coloración GRAM pudimos observar en el microscopio, las

características microscópicas que deseábamos realizar, mostrándolas en la siguiente tabla:

TABLA Nº 02: Características microscópicas de las características microbianas.

Observaciones microscópicas
Muestra Gram Forma
Positiva (+) Negativa (-) Coco Bacillus Espirilo
X
1 X
(pequeño)
X
2 X
(grande)
X
3 X
(pequeño)
VII. COMENTARIO:

 Utilizamos la coloración GRAM para podernos referir a la morfología celular bacteriana

como para poder realizar una aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram Positiva a las bacterias que se visualizaron de color moradas.
 La violeta de genciana penetra en todas las células bacterianas a través de la pared
bacteriana.
 El lugol es un compuesto que fija con mayor intensidad la violeta de genciana a las
paredes de la célula bacteriana.
 Al enjuagar la lámina (con agua corriente) conteniendo la muestra, se debe de tener en
cuenta el chorro de agua (delgado) que NO debe hacer directamente sobre la muestra, ésta
debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

 http://iesgarciamorato.org/Bio%20y%20Geo/Pract_micros.htm
 http://html.rincondelvago.com/fisiotaxonomia-de-bacterias-gram-positivas.html
 http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
 http://www.galileog.com/ciencia/biologia/bacterias/bacterias.htm
 http://perso.wanadoo.es/microdominguez/b.htm
 http://cdigital.dgb.uanl.mx/te/1020160690/1020160690_03.pdf
 http://www.wordreference.com/definicion/halo
 http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/411/41100206.pdf
 http://iesgarciamorato.org/Bio%20y%20Geo/Pract_micros.htm