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1. A enzima de restrição EcoRI (5'-G^A A T T C-3’) foi usada para digerir uma molécula
de DNA linear que contém 10 locais de restrição EcoRI e uma molélula de DNA circular
que também contém 10 locais EcoRI.
2. Pretende-se exprimir, em bactérias, a proteína humana codificada pelo gene YFE. Para
isso é necessário clonar a sequência num plasmídeo. Mas antes é ainda necessário
construir um vector adequado, por técnicas de DNA recombinante.
2.3. Imagine que vai clonar o cDNA do gene YFE no vector de expressão que a seguir se
representa. Descreva a estratégia de clonagem que seguiria.
P
Bam HI
Eco RI Kpn I Pst I Sma I Eco RI
Eco RV
pRSET B
2,9 Kb
Eco RI G↓AATTC
Kpn I GGTAC ↓C
Pst I CTGCA↓G
Bam HI G↓GATCC
Eco RV GAT↓ATC
SmaI GGG↓CCC
3. Pretende clonar o cDNA do geneX no vector pBluescript para efectuar uma reacção de
transcrição e tradução in vitro. Na reacção de transcrição in vitro juntam-se num
microtubo, o vector recombinante e todos os reagentes necessários para a transcrição. O
vector pBluescript possui 2 promotores, o T7 e o T3, que são reconhecidos
respectivamente pela RNA polimerase do bacteriófago T7 e T3. Nesta reacção pretende
utilizar a RNA polimerase T7.
Promotor 5’
Bam HI
Xba I
Xho I
Xba I
Nde I
Nde I
Eco RI
Bam HI
Ori Xba I
3 Kpb 3’
Promotor 5’
Bam HI
Bam HI
Bam HI
Xho I
Xho I
Nde I
Pst I
Pst I
Pst I
Ori Eco RI
3 Kpb 3’
M 1 2 3
5000 pb -
4000 pb -
3000 pb -
2000 pb -
1000 pb -
500 pb -