Facultad de Ingeniería Química LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN

MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos
necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden
crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan
medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios
desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las
necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los
siguientes requisitos:

- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo

que se siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
- Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos
categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y
la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las
fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y determinados
factores orgánicos de crecimiento.
- Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones
adecuadas.

Además las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofos. Las primeras
comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la
atmósfera y de la materia inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas requieren
compuestos orgánicos más complejos como fuente de carbono y nitrógeno, así como
proteínas o sus derivados, también requieren carbohidratos y grasas. Este último
grupo de organismos es el más importante en bacteriología médica.

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II. OBJETIVOS

 Elaborar adecuadamente los medios de cultivo deshidratados por componentes

 Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de

cultivo. Así como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso.

 Familiarizarse con las técnicas empeladas en microbiología para el cultivo y la

manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.

III. MARCO TEORICO

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el

laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos
sólo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:

I. POR SU CONSISTENCIA:

1. Medios Líquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.

2. Medios Sólidos: Contienen nutrientes disueltos en

agua pero se les añade un agente solidificante. El Agar es
un polisacárido complejo que se obtiene de algas
rodofíceas de origen marino cuyas propiedades son de
gran utilidad en la preparación de medios de cultivo
sólidos: No es degradado enzimáticamente por los
microorganismos (a excepción de algunos
microorganismos de ambientes marinos), funde
aproximadamente a 100ºC y permanece en estado líquido
mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-
50ºC.

Además, una vez solidificado se puede incubar a

temperaturas elevadas sin que se licúe. Generalmente el
Agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una
concentración del 1,5%. Los medios con Agar se envasan
en tubo o en placa de Petri.

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3. Medios Semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del
agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados
mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la
movilidad de los microorganismos.

II. POR SU COMPOSICIÓN

1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento

de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que
forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de
sus componentes proceden de la degradación parcial de tejidos o productos animales,
de plantas o de microorganismos que son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos,
vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas
(proteínas animales digeridas enzimáticamente), el extracto de carne y el extracto de
levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares
pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un
ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y
extracto de carne.

2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de
productos químicos puros (pero no extra puros) y en concentraciones conocidas. Así,
un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco
exigente", como E. coli, debería contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y
nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales,
como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como
contaminantes de los productos químicos antes citados, en cantidades suficientes para
el crecimiento.

III. POR SU UTILIZACIÓN:

Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que
se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos
requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar
a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo número y que
pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un número más
elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a
separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el
crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:

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1. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento

de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el
desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un
agente selectivo como antibióticos, productos químicos,
colorantes, etc.

Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sódico, que

en concentración elevada inhibe la mayoría de los
microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes,
como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el
crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la
porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los
estreptococos, que carecen de este sistema, así como otros
Gram positivos.

De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que
se añaden en selectivos para Salmonella ya que, además de inhibir a los
microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben también a
bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde
brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo también inhibidor
para la mayoría de las bacterias intestinales excepto para Salmonella.

Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento
de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo
también por su pH, así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa
para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.

2. Medios Diferenciales: Son aquellos diseñados

para distinguir unos microorganismos de otros, a
partir de una población mixta, por la apariencia
distinta que toman sus colonias. Estos medios de
cultivo ponen de manifiesto propiedades que un
determinado tipo de microorganismo posee. Por
ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un
indicador de pH, que pone de manifiesto la
degradación de un nutriente específico
(generalmente un azúcar) por el cambio de color que
se origina cuando éste es metabolizado, como en el
caso del medio CLED.
Los medios diferenciales pueden ser además selectivos,
si se añaden agentes que inhiben el crecimiento de
determinados microorganismos. En este caso va a ser
posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del
limitado grupo de microorganismos que pueden crecer.
Así, el medio EMB de Levine es selectivo para las
bacterias Gram negativas por contener dos colorantes,
eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de
bacterias Gram positivas.

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Es también un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la

lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. La formación de ácidos a
partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias,
que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E.
coli, las colonias presentan además un brillo metálico. El Agar Mac Conkey es otro
ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta
inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas; la fermentación de lactosa con
liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.

REQUERIMIENTOS PARA EL DESARROLLO BACTERIANO

Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y

heterótrofos. Las primeras comprenden las bacterias del
suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la
atmósfera y de la materia inorgánica simple. Las bacterias
heterótrofas requieren compuestos orgánicos más
complejos como fuente de carbono y nitrógeno, así como
proteínas o sus derivados, también requieren
carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos
es el más importante en bacteriología médica.

- Proteínas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran

disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas
pépticas, consisten en polipéptidos, dipéptido y aminoácidos.
- Carbohidratos: Suministran carbono para las síntesis, y además su fermentación
libera energía utilizable en el metabolismo.
- Factores accesorios de crecimiento: Son también
requeridos por algunas bacterias. Entre ellos están las
vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico,
piridoxina, botina). Estas sustancias son necesarias y las
bacterias no las pueden sintetizar. Otros factores necesarios
para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más
complejos, como el suero, la sangre la yema del huevo, etc.
- Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio,
etc. También son requeridos por algunas bacterias en su
desarrollo.
- Atmósfera: Microorganismos aerobios obligados,
anaerobios obligados, anaerobios facultativos, etc.
- Presión osmótica: Las células pueden encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en
soluciones hipertónicas, inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua,
en las soluciones hipotónicas.
- Temperatura: Para la mayoría de bacterias patógenas del hombre la temperatura
óptima de crecimiento es de 37° C.
- Luz: La mayoría de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta puede
ser letal.
- Reacción: La mayoría de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente alcalino
(pH 7,2- 7,6).

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IV. PROCEDIMIENTO

Técnica de estría cruzada

a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una

muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5
estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar
la caja (Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir
nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de
la zona de estrías recién hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un
segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el
último cuadrante, no se deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más
abierta (simple).

Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo

1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y
en tubos con agar nutritivo inclinado.
2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con
agar nutritivo solidificado en forma recta (Figura 5)

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Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos

1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de
MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estría simple.
2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por
estría cruzada la muestra problema.

Condiciones de incubación

1. Incubar las cajas en forma invertida a 37°C durante 24 horas. De las cajas
inoculadas por estría cruzada, seleccionar la colonia más aislada (generalmente del
cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de esta colonia a tubos inclinados
con agar nutritivo.
2. Incubar los tubos a 37°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y
reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo.

Preparación de medios de cultivo

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V. CONCLUSIONES

 Al inicio de cualquier práctica de laboratorio, es necesario lavar, desinfectar y

esterilizar los instrumentos y el medio de trabajo.
 Para la obtener buenos resultados es necesario considerar los factores de
contaminación: el analista, el medio de trabajo y la muestra.
 El uso adecuado de los equipos nos brinda resultados más confiables.
 Cada uno de los equipos cumple con una función específica durante el trabajo.
 La estufa se utiliza para esterilizar a los instrumentos de laboratorio.
 En la incubadora se colocará el medio de cultivo, ya sembrado, para el
crecimiento de los microorganismos.
 El conteo de colonias se realiza por triplicado, logrando un resultado preciso.
 La autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivos preparados en
laboratorio.

VI. CUESTIONARIO

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVO UTILIZADOS EN MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA

(Cantidades de ingredientes para 1 litro de medio de cultivo)

1. Para el aislamiento de SALMONELLA

Agar BPLS (Brilliant-greet phenol-red lactose sucrose agar) Cantidades

Peptona de carne 7g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 15g
Rojo de fenol 0.04g
Verde brillante 0.05g
Agar 13g

pH 6.5

2. Para el aislamiento de ESCHERICHIA COLI

Agar Endo Cantidades

Peptona de carne 10g
di-potasio hidrogenofosfato 3.5g
Lactosa 10g
Sulfito de sodio 2.5g
Fucsina básica 0.4g
Agar 12.5g

pH 7.5 ± 0.2

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3. Para el aislamiento de STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Agar Manitol Salado Cantidades

Peptona de carne 10g
Extracto de carne 1g
Cloruro de sodio 75g
d-manita 10g
Rojo de fenol 0.025g
Agar 12g

pH 7.4 ± 0.2

4. Para el aislamiento de BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS

Agar Plate Count Cantidades

Extracto de levadura 5g
Extracto de carne 3g
Peptona de caseína 15g
Cloruro de sodio 5g

pH 7.2 ± 0.2

5. Para el aislamiento de CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Agar SPS Cantidades

Peptona de caseína 15g
Extracto de levadura 10g
Citrato de fierro III 0.5g
Sulfito sódico 0.5g
Polimixina B sulfato 0.01g
Sulfadiazine sódica 0.12
Agar 14g

pH 7.0 ± 0.2

6. Para el aislamiento de COLIFORMES

Agar Mac Conkey Cantidades

Peptona de caseína 17g
Peptona de carne 3g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 10g
Sales biliares 1.5g
Rojo neutro 0.03g
Cristal violeta 0.001g
Agar 13.5g

pH 7.1 ± 0.2

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7. Para el aislamiento de MICROORGANISMOS MOCROAERÓFILOS

Caldo Tioglicolato Cantidades

Peptona de caseína 15g
Extracto de levadura 5g
Glucosa 5.5g
Cloruro de sodio 0.5g
Tioglicolato de sodio 2.5g
Resazurina sódica 0.5g
Agar 0.01g
0.75g
pH 7.1

8. Para el aislamiento de VIBRIO CHOLERAE

Agar TCBS Cantidades

Peptona de caseína 5g
Peptona de carne 5g
Extracto de levadura 5g
Citrato de sodio 10g
Bilis de buey 10g
Colate de sodio 5g
Sacarosa 3g
Cloruro de sodio 20g
Citrato de hierro III 10g
Azul de timol 1g
Azul de bromotimol 0.04g
Agar 14g

pH 8.6

9. Para el aislamiento de ENTEROCOCOS

Agar selective para Enterococos Cantidades

Peptona de caseína 15g
Peptona de harina de soya 5g
Extracto de levadura 5g
Glucosa 2g
di-potasio hidrogenofosfato 4g
azida de sodio 0.4g
2.3.5 trifeniletrazolio cloruro 0.1g
Agar 10g

pH 7.2

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10. Para el aislamiento de ENTEROBACTERIAS

Agar Kligler Hierro Cantidades

Peptona de carne 13g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 10g
Tripteina 10g
Glucosa 1g
Citrato de hierro y amonio 0.5g
Tiosulfato de sodio 0.3g
Rojo fenol 0.025g
Agar 15g

pH 7.3 ± 0.2

11. Para el aislamiento de SHIGELLA

Agar SS (Salmonella-Shigella) Cantidades

Extracto de carne 5g
Peptona de carne 5g
Lactosa 10g
Bilis de buey 8.5g
Citrato de sodio 10g
Tiosulfato de sodio 805g
Citrato de hierro III 1g
Verde brillante 0.0003g
Rojo neutro 0.25g
Agar 12g

pH 7.0 ± 0.2

VII. BIBLIOGRAFIA
o VILCHEZ UCEDA, Víctor. Manual de Practicas de Microbiología. p.32-38
o PEREZ CHABELA, María. Manual de Practicas del Laboratorio de
Microbiologia General. P 37-40

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