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GUIA DE TRABAJO N°2: DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN ALIMENTOS. NÚMERO

MÁS PROBABLE (NMP)

1. OBJETIVOS

Conocer la técnica de número más probable (NMP) de Coliformes en una muestra de

alimento, a partir de la técnica de tubos múltiples, en la cual volúmenes decrecientes
de la muestra (diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en el medio de
cultivo adecuado. La combinación de los resultados positivos y negativos es usada en
la determinación de NMP.

2. FUNDAMENTOS

El número más probable (NMP) es un método de realizar recuento bacteriano basado en

la probabilidad que existe en el laboratorio de aislar bacterias en un sistema de medios de
cultivo líquidos donde se siembran los inóculos empleando series de 5 y 3 tubos por cada
dilución. Esta técnica que es tal vez de las más sensibles, se aplica a un grupo de
microorganismos que comprende varios géneros de la familia Enterobacteriacea; los
cuales estan ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo. También es habitante
normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Su presencia en
alimentos es signo de mala calidad higiénica en el proceso, falta de higiene de los
manipuladores, recontaminación después del proceso y aún de contaminación fecal. En
este caso se utilizara la técnica para la búsqueda de Coliformes Totales y Fecales,
Escherichia coli, como indicadores bacterianos de contaminación fecal.

La Prueba consta de tres etapas:

1. Prueba presuntiva
2. Prueba confirmativa
3. Prueba completa

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3. MÉTODOS

MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES REACTIVOS
 1 Boeco 250 mL  Caldo Lauril Sulfato Triptosa de
 2 tubos tapa rosca (preparación muestra) sencilla concentración
 Asa bacteriológica  Caldo Lactosado Verde Brillante
 Incubadora a 35ºC +/- 2ºC Bilis
 Baño de agua con agitación, graduado a  Caldo Triptona o EC
44.5ºC  Agar eosina azul de metileno
 Micropipeta de 100-1000 µL con puntas (EMB)
 18 tubos de fermentación (Durham)  Reactivo de Kovac`s
 10 Tubos con 9 ml de Caldo Lauril Sulfato
Triptosa de sencilla concentración
 10 Tubos con 9 ml de Caldo Lactosado Verde
Brillante Bilis 2%
 10 Tubos con Caldo Triptona
 3 Cajas de Petri
 Gradillas
 2 Mecheros
 Gramera

PROCEDIMIENTO

3.5 Preparación y dilución de los homogenizados de las muestras de alimentos

Prepare la muestra del alimento con los 90 ml de agua peptonada y a partir de ella haga
diluciones hasta 10-3. (Figura 1)

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Figura 1. Preparación de las diluciones.

3.2 Prueba presuntiva

1. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en

tubos con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de sencilla concentración, utilizando tres
tubos por cada dilución. (Figura 2)
2. Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35ºC +/- 2ºC por 24 – 48 horas
3. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas, que se
observa por el desplazamiento del medio en el tubo de Durham. Si a las 24 horas
todos los tubos muestran producción de gas, continuar con la prueba confirmativa.

Figura 2. Número más probable (NMP), Prueba presuntiva.

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3.3 Prueba confirmativa

1. A partir de los tubos positivos, con producción de gas de la prueba presuntiva de

NMP de Coliformes, transferir de cada tubo una asada de cultivo en: Verde
Brillante Bilis al 2% con campana de Durham y Caldo Triptona o EC, el que este
disponible en el laboratorio(Fig. 3)
2. Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 35ºC +/- 2ºC (Verde Brillante Bilis al
2%) y 44.5ºC +/- 0.5ºC (Caldo Triptona o EC) por 48 horas, en baño de agua con
rotación, teniendo cuidado de que el nivel de agua del baño sobrepase el nivel del
medio de cultivo.
3. Al cabo de la incubación observar los tubos de Caldo Verde Brillante Bilis al 2%
que presenten gas y revelar los Caldos Triptona adicionando 0.2 mL del reactivo
de Kovac`s observando la formación de un anillo rojo cereza en la superficie de la
capa de alcohol amílico indicando la presencia de indol cundo la prueba es
positiva o el color original del medio cuando la prueba es negativa, para el caso del
EC, observar turbidez y gas. Con el verde brillante se confirman coliformes totales,
con el triptona y EC se confirman coliformes fecales
4. Considerar como Coliformes de origen fecal en triptona, los tubos que demuestren
positividad en ambas pruebas: gas positivo e indol positivo. No incluya los tubos
Indol negativo aunque el brilla haya sido positivo.
5. Confrontar los resultados con la tabla de NMP (Tabla 1).

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Figura 3. Número más probable (NMP), Prueba confirmativa

3.4 Prueba completa

1. De los tubos que fueron Indol positivos en la prueba confirmativa en el caldo
triptona o positivos en el EC, tome una asada para sembrar por estría en Agar
eosina azul de metileno (EMB), Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA), agar
MaConkey o Agar Endo. (Figura 4)

Figura 4. Siembra por estría en prueba completa

2. Incubar las placas invertidas a 35ºC +/- 2ºC por 24 horas, al cabo de este tiempo
observe la morfología de las colonias. Si encuentra colonias aisladas y típicas se
puede purificar el cultivo en agar nutritivo inclinado.
3. A partir de una colonia aislada a del agar nutritivo realice las pruebas bioquímicas
para identificar completamente Eschechia coli.

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3.5 Cálculo e interpretación de los resultados para NMP

Para obtener el NMP, proceder de la siguiente manera: Ver en cada una de las tres
diluciones seleccionadas el número de tubos en los que se confirmó tanto la presencia de
Coliformes totales como fecales. Buscar en la tabla del NMP (Tabla 1) y anotar el
resultado correspondiente al número de tubos positivos de cada dilución.

Para calcular el NMP de organismos Coliformes por gramo o mL de alimento utilizar la

siguiente fórmula:

NMP de la tabla x 10 = NMP / 100 g ó mL

Mayor volumen estudiado

Valor del NMP de la tabla x 10 = NMP/100 ml

Mayor volumen sembrado
♦ Ejemplo 1: Si hemos sembrado 5 porciones o réplicas de 0.01 ml, 5 de 0.001 ml
y 5 de 0.0001 ml, de las cuales resultaron positivas 5 de 0.01 ml, 2 de 0.001 ml y 0
de 0.0001 ml, el código será 5-2-0.
♦ Al buscar en la tabla 1, éste código corresponde a un índice de 49/100 ml.
♦ Aplicando la fórmula tendremos: NMP =
49 x 10 = 49.000 / 100 g ó mL
0.01

Ejemplo: 2
Si se obtuvieron los siguientes datos en la prueba confirmativa:

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2 tubos positivos en la dilución 10-1

1 tubo positivo en la dilución 10-2
1 tubo positivo en la dilución 10-3
Tabla NMP 2: 1: 1 = 20
Aplicando la fórmula: 20 x 10 = 2000 Coliformes / g ó mL
0.1
Expresar los resultados como NMP de Coliformes totales g o mL de alimento o NMP de
Coliformes fecales g o mL de alimento.

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 Cuando se inoculan más de tres diluciones o volúmenes de

muestra, se deben determinar las tres diluciones significativas, de
acuerdo con las siguientes reglas:

- Solamente deben usarse tres diluciones en el código, para

calcular el valor del NMP.

- Como primer número del código, seleccionar los

volúmenes de muestra más pequeños en los cuales todos los
tubos resultaron positivos (5) y los dos volúmenes o diluciones
menores que le suceden. (Ver tabla 2, pruebas 1 y 2).

- Si menos de tres diluciones muestran tubos con resultados

positivos, se seleccionarán los tres mayores volúmenes de
muestra incluyendo las diluciones con los tubos positivos (tabla
2, prueba 3).

- Si resultaron tubos positivos en diluciones más altas o

mayores que en aquellas escogidas para el código, dichos
positivos se suman a la dilución más alta de las tres
seleccionadas en la primera ocasión (tabla 2, prueba 4).

- No debe haber resultados negativos en volúmenes de

muestra superiores a aquellos escogidos. Sin embargo si
aparecen tubos negativos, ejemplo: 4/5, 3/5 y 0/5, debe usarse
el mayor volumen de muestra con todos los tubos positivos,
junto con los dos siguientes volúmenes de muestra más bajos.
(tabla 2, prueba 5).

- Si todos los tubos son positivos se escogen las tres

diluciones más altas (tabla 2, prueba 6).

- Si todos los tubos son negativos, escoger para el código,

las tres diluciones más bajas (tabla 2, prueba 7).

- Si no resultaron tubos positivos en una dilución intermedia,

seleccionar para el código, la dilución más alta con tubos

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positivos y las dos diluciones más bajas (tabla 2, prueba 8).

- Si solamente la dilución intermedia es positiva, escoger

para el código ésta dilución, la siguiente más alta y la anterior
más baja (tabla 2, prueba 9).

Tabla 2. Selección del código de resultados, serie de 5 tubos.

Prueba 10 1.0 0.1 0.01 0.001 0.0001 Código

1 5 3 0 0 0 0 5-3-0
2 5 5 4 0 0 0 5-4-0
3 4 1 0 0 0 4-1-0
4 5 5 4 1 1 0 5-4-2
5 4 5 3 0 0 5-3-0
6 5 5 5 5 5 5-5-5
7 0 0 0 0 0 0-0-0
8 4 0 2 0 0 4-0-2
9 0 1 0 0 0 0-1-0

Cálculo de los resultados de Coliformes fecales

En el cálculo de la densidad probable de Coliformes fecales se

obtiene con base en la combinación de los resultados positivos y
negativos obtenidos de los tubos con medio E.C. de acuerdo con
la tabla del NMP utilizada para Coliformes totales, teniendo en
cuenta las reglas señaladas allí. La densidad de Coliformes
fecales se expresa como: NMP de Coliformes fecales/100 ml.

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Sandra Rivera
Sandrapatriciarivera82@gmail.com
Elaboró Angélica María E-mail
angelica.guevara00@usc.edu.co
Guevara R.
Revisado Departamento Ciencias Básicas

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Aprueba x Área Microbiología

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