PROCEDIMIENTO STAPHLYLOCOCUS EREUS

Aparatos
(a) Pipetas.-1.0 mL con graduaciones de 0.1 mL; 5,0 y 10,0 ml
con graduaciones de 0.5 y 1.0 mL.
(b) Blender.-Waring, o modelo de 2 velocidades equivalente, con
operación de alta velocidad a 16 000-18 000 rpm, y 1 L de vidrio o metal
vasos de licuadora con tapas. Se requiere un frasco para cada unidad analítica.
(c) Mezclador.-Vor tex Ge nie, o equivalente.
(d) Baño de agua. -Mantenido a 35 ° -37 ° C.
(e) Incubadora: mantenido a 35 ° -37 ° C.

Medios y reactivos

(a) caldo de tripticasa (tríptico) de soja con 10% de cloruro de sodio y

Piruvato de sodio al 1%. Agregue 95 g de NaCl a 1 l de solución de 17,0 g.
Trypticase o triptosa (digestión pan cápita de café), 3.0 g Phytone
(extracto papaico de harina de soja), 5,0 g de NaCl, 2,5 g de K2HPO4
, 2.5 g
dextrosa (Trypticase deshidratado o caldo de soja tríptico se encuentra en fábrica),
y 10 g de piruvato de sodio. Ajustar a pH 7.3. Calienta suavemente si es
necesario. Dispense 10 ml en 16 tubos de 150 mm. Autoclave
15 min a 121 ° C. El pH final debe ser de 7.3 ± 0.2. Tienda 1 mes a 4 °
± 1 ° C.

(b) Solución salina fisiológica. Disolver 8,5 g de NaCl en 1 L

H2O. Pasar en autoclave 15 minutos a 121 ° C y enfriar a temperatura ambiente.
(c) medio Baird-Parker (agar de glicina de piruvato de tellurita de huevo,
ETGPA) .- (1) Medio basal. Suspender 10,0 g de triptona, 5,0 g
extracto de carne de vacuno, 1.0 g de extracto de levadura, 10.0 g de piruvato de
sodio, 12.0 g
glicina, 5,0 g de LiCl x H2O y 20,0 g de agar en 950 ml de H2O. Calor a pb
con frecuente agitación para disolver los ingredientes por completo. Dispensar
Porciones de 95 ml en botellas de tapón de rosca. Auto-ñclave 15 min a 121 ° C.
El pH final debe ser de 7.0 ± 0.2 a 25 ° C. Almacenar 1 mes a 4 ° ± 1 ° C.

(2) Enriquecimiento.-Bacto E Y enriquecimiento telurito (BD

Biosciences Codified Cat. No. 277910, o equivalente) o prepararse como
lo siguiente: Remoje los huevos frescos alrededor de 1 minuto en dilución de HgCl2
saturado
lución (1 + 1000). Asépticamente romper huevos y separar las yemas de
ropa blanca. Mezcla de yema y solución salina fisiológica, (b), (3 + 7, v / v)
en la licuadora de alta velocidad ca 5 s. A 50 ml de emulsión de yema de huevo,
agregue
10 ml de telurito de potasio al 1% esterilizado por filtración y filtrado (p / v). Mezcla
y almacenar a 4 ° ± 1 ° C.

Medio completo. Agregue 5 mL de enriquecimiento calentado a 95 mL

el agua basal fundida se enfrió a 45 ° -50 ° C. Mezcle bien, evite
burbujas, y verter 15-18 ml en placas de Petri 100 mm estériles.
Guarde las placas a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 días antes de su uso.
El medio debe ser densamente opaco; no use placas nonopacas.
Las planchas secas deben usarse antes de usar uno de los siguientes métodos: (a)
en
horno de convección o incubadora 30 min a 50 ° C con tapas retiradas y
agar sur boca abajo; (b) en horno de tiro forzado o en cubeta durante 2 h en
50 ° C con tapas en agar sur boca arriba; (c) en incubadora 4 ha 35 ° C
con tapas en agar sur boca arriba; o (d) en el banco de laboratorio 16-18 h
a temperatura ambiente con las tapas puestas y agar sur boca arriba.

(d) Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI). Disuelva la infusión de

200 g de cerebro de ternera y de 250 g de corazón de vaca, 10,0 g de peptona de
proteosa
o Gelysate, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de Na2HPO4

× 12H2O y 2.0 g de glucosa en

1 L H2O, calentando suavemente si es necesario. Dispense porciones de 5 mL en
16
Tubos de ensayo de 150 mm y autoclave 15 min a 121 ° C. El pH final debería
ser 7.4 ± 0.2.

Plasma de coagulasa desecado (conejo) con

EDTA.-Reconstituir de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si no
disponible, reconstituir plasma desecado de coagulasa (conejo) y agregar
Na2H2EDTA a una concentración final de 0,1% en plasma reconstituido.
(f) Diluyente de fosfato tamponado de Butterfield .- (1) Stock
solución.-Disolver 34.0 g KH2PO4

en 500 ml de H2O, justo a pH 7,2

con ca 175 ml de NaOH 1M, y diluir a 1 L. Almacenar en el refrigerador. (2)
Diluyente. Diluir 1.25 mL de solución madre a 1 L con H2O. Preparar
dilución en blanco con esta solución, dispensando lo suficiente para permitir
pérdidas durante el autoclave. Autoclave 15 min a 121 ° C

Preparación de Homogenato de Alimentos

Asépticamente pesar 50 g de porción de prueba de alimento no estéril en estéril
vaso de licuadora Agregue 450 ml de dilución tamponada con fosfato H2O y
homogeneizar 2 minutos a alta velocidad (16 000-18 000 rpm). Usa esto 1:10
dilución para preparar diluciones seriadas de 10-2
a 10-6
transfiriendo
10 ml de dilución 1:10 a blanco de dilución de 90 ml, mezclando bien con
sacudidas vigorosas, y continuar hasta 10-6
es alcanzado.

Técnica de numero mas probable

Inocular 3 tubos de caldo de soja Trypticase con 10% de NaCl y

1% de piruvato de dium, B (a), en cada dilución de prueba con alícuotas de 1 ml
de las digestiones decimales del homogeneizado de alimentos. Dilución máxima de
la prueba
La porción debe ser lo suficientemente alta como para producir un punto final
negativo. En cu
48 ha 35 ° C.
Usando un bucle de 3 mm, transfiere 1 asa de cada crecimiento positivo
tubo para secar las placas de Baird-Parker, B (c) (3). Mezcle los tubos en una
Mezclador vortex antes de rayar si el crecimiento es visible solo en bottom o
lados de los tubos. Ráfaga para obtener colonias aisladas. Incubar 48 h
a 35 ° -37 ° C.

Interpretación

Las colonias de S. aureus son típicamente circulares, lisas, convexas

húmedo, 2-3 mm de diámetro en placas sin amontonar, gris-negro a

negro azabache, con frecuencia con un margen de color claro (grisáceo),

sur redondeado por la zona opaca (precipitado), y con frecuencia con exterior

zona clara; las colonias tienen una consistencia mantecosa a pegajosa cuando

tocado con aguja de inoculación. Cepas nolipolíticas ocasionales

tal vez encontré que tienen una apariencia similar, excepto que

no hay zonas circundantes opacas y claras. Colonias aisladas

de alimentos congelados o desecados que han sido almacenados para

los periodos extendidos son negro sin frecuencia que las colonias típicas y

puede tener una apariencia áspera y una textura seca.

Técnica de confirmación

Para cada placa que muestre crecimiento, elija 31 colonia sospechosa para ser

S. aureus. Con aguja estéril, transfiera colonias a tubos que contengan

0,2 ml de caldo BHI, B (d), y para agar inclinado que contienen cualquier caldo
adecuado

medio de mantenimiento, por ejemplo, agar de soja Trypticase, recuento estándar

de placas

agar, etc. Incubar suspensiones de cultivo BHI e inclinarse 18-24 h en

35 ° C. Conservar cultivos inclinados a temperatura ambiente para auxiliares, o

repetir la prueba en caso de que los resultados de la prueba de coagulasa sean

cuestionables.

Para cultivos de BHI, agregue 0.5 ml de plasma de coagulasa reconstituido con

EDTA, B (e) y mezclar completamente. Incubar a 35 ° -37 ° C y

examine periódicamente durante un intervalo de 6 h para la formación de coágulos.

Cualquier grado de formación de coágulo se considera una reacción positiva. Los

coágulos pequeños o mal organizados pueden ser observados con un tubo de ping
con punta suave.

esa parte líquida de la mezcla de reacción se aproxima al labio del tubo; coágulos

sobresaldrá por encima de la superficie del líquido. Las culturas positivas a la

coagulasa son
considerado como S. aureus. Prueba de controles positivos y negativos

simultáneamente con cultivos de reactividad coagulasa desconocida.

Vuelva a verificar los resultados de las pruebas de coagulasa dudosas en cultivos

de BHI que tienen

se incubó a 35 ° -37 ° C durante> 18 pero 48 h.

Informe el número más probable (MPN) de S. aureus / g de la tabla de

Valores de MPN [Tabla 966.24 (ver 17.2.02)].