Preparación de la muestra.

- Medir 100.0 mL de muestra.

- Acidificar ligeramente con ácido acético glacial hasta obtener un pH entre 2.5-3.0, medido con
papel pH.

- Rotular esta solución como A. - Realizar dos extracciones más y rotular como B y C.

ii. Extracción de los colorantes.

- Agregar 20 cm de lana desengrasada a las muestras acidificadas.

- Hervir la solución durante 5 minutos y luego dejarla en contacto a temperatura ambiente por 15
minutos.

- Retirar la lana de la solución y lavarla con agua destilada fría.

- Transferir la lana coloreada a un beaker de 50 mL que contenga 10 mL de amoniaco 0.5 N y dejar

en contacto hasta que el colorante depositado en la lana pase a la solución amoniacal.

- Retirar la lana del Beaker que contiene la solución amoniacal y colocarla nuevamente en la
solución acidificada anterior.

- Repetir el mismo procedimiento en los mismos 10 mL de solución amoniacal hasta que la

muestra quede incolora.

- Retirar la lana del Beaker con el colorante en la solución amoniacal y concentrar la solución
hasta un volumen aproximado de 1 mL, de ser necesario agregar agua a la muestra para evitar
llegar a sequedad.

- Enfriar y transferir la solución concentrada a un balón volumétrico de 10.0 mL y aforar con agua
destilada. 73

iii. Identificación de los colorantes por el método de Cromatografía en Capa Fina (TLC)

- Proceder a la activación de la placa cromatográfica 20x20 cm calentándola en una estufa a 110 ºC

- 120ºC por 20 minutos.

- Preparar el eluyente compuesta por Isopropanol e hidróxido de Amonio concentrado (4:1 v/v). -
Colocar la fase móvil en un tanque para cromatografía y tapar el tanque hasta saturar la cámara. -
Sacar la placa cromatográfica de la estufa y dejarla enfriar a temperatura ambiente.

- Preparar estándares de los colorantes amarillo Nº 5 y Nº 6 FD&C con las siguientes

concentraciones 0.25, 0.50, 1.0, 1.25, 1.50 mg/mL. (ver anexo Nº 5).

- Marcar sobre la placa cromatografía marcar una línea de 2 cm del borde inferior, y sobre esta
línea marcar puntos equidistantes, dejando una distancia de 1 cm de cada borde lateral.
- Aplicar con una jeringa de tuberculina, 0.1mL de las soluciones estándares de las diferentes
concentraciones de los colorantes, secar las manchas con secadora de cabello.

- De igual forma aplicar 0.1mL de las muestras a analizar de la repetición A, B, C e igualmente secar
las manchas con secadora.

- Colocar la placa cromatográfica en el tanque cromatográfico, desarrollar el cronograma hasta

que el frente del solvente haya recorrido ¾ desde el borde inferior de la placa.

- Retirar la placa cromatográfica de la cámara cromatográfica y marcar el frente del solvente.

- Medir el desplazamiento de las muestras y de los estándares. iii. 74

- Documentar los resultados obtenidos del desplazamiento de cada una de las muestras y
estándares sobre la placa CCF (ver anexo Nº 6)

- Utilizar la siguiente fórmula para determinar el coeficiente de reparto Rf y así identificar los
colorantes (Los Rf teóricos para el amarillo Nº5 son de 0.36-0.39 y(Y)