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Disciplina:

BIOLOGIA MOLECULAR

Prof. Dr. José Ferreira Marinho Júnior

Paulista – 2017.2
Genética molecular e suas aplicações

Os avanços da Engenharia Genética permitiram conhecer, sequenciar e


até alterar o código genético de um ser vivo. Essas informações têm sido
aplicadas em muitas situações que envolvem a nossa vida, tais como

 serviços de aconselhamento genético;


 prevenção de doenças hereditárias;
A manipulação  diagnóstico anomalias genéticas (pré-natal);
do DNA  identificação de pessoas com base na análise de DNA;
envolve muitas  testes de paternidade;
aplicações.  produção de medicamentos.
• Breve Histórico

Na década de 1970, descobrimento de certas enzimas bacterianas,


chamadas enzimas de restrição ou endonucleases, que podiam cortar
a molécula de DNA em pontos específicos e de forma controlada.

As enzimas de restrição são produzidas naturalmente pelas bactérias e


atuam contra a invasão de determinados vírus bacteriófagos.

São “tesouras químicas” altamente específicas, pois cada tipo de


enzima reconhece e corta apenas uma determinada sequência de
nucleotídeos.
• Enzimas de restrição Tabela: nome de algumas enzimas, bactérias que as produzem
e a sequência de corte das bases nitrogenadas.

NOME DA BACTÉRIA DE SÍTIO DE AÇÃO


Atualmente, existem inúmeras ENZIMA ORIGEM
enzimas de restrição Aha III Aphanothece 5’-TTTAAA-3’
identificadas, isoladas das halophytica 3’-AAATTT-5’
bactérias e purificadas em Bam HI Bacillus 5’-GGATCC-3’
laboratório para a Amyloliquefaciens H 3’-CCTAGG-5’
comercialização. Eco RI Escherichia 5’-GAATTC-3’
Coli RY 13 3’-CTTAAG-5’
O nome de uma enzima de Hind III Haemoplhilus 5’-AAGCTT-3’
Influenza Rd 3’-TTCGAA-5’
restrição é formado pelas
Taq I Thermus 5’-TCGA - 3’
iniciais do nome da espécie e,
Aquaticus YTI 3’-AGCT - 5’
às vezes, a sigla da linhagem Fonte: AMABIS,J.M.MARTHO,G.R.Biologia dos organismos. São
Paulo:Editora Moderna, 2010, adaptado.
que a produz.
• Enzimas de restrição

Bactérias Escherichia coli ao microscópio

Imagem: Rocky Mountain Laboratories / National


Institutes of Health / public domain.
• Enzimas de restrição - aplicações

Na análise de DNA oriundo de reação molecular *

Pode-se separar
fragmentos de DNA
produzidos pelas enzimas
de restrição através de
eletroforese.
• Plasmídeo

 As bactérias possuem, além das


enzimas de restrição, DNA principal e
pequeno DNA circular, chamado
plasmídeo, no qual estão inseridos
genes que lhes dão resistência a
antibióticos.

 Plasmídeos são utilizados como


vetores para manipulação do DNA.
Bastante utilizados na tecnologia de
DNA Recombinante

Através de técnicas...
Os cientistas conseguiram unir trechos
de plasmídeo com fragmentos de DNA
isolados de outros organismos!
• Plasmídeo
• Geralmente moléculas de DNA circulares e cadeia dupla, com replicação
independente do cromossoma bacteriano
• Podem existir em todos os tipos de bactérias
• Papel importante na adaptação e evolução bacteriana
• Codificam proteínas que na maioria dos casos conferem vantagens à
célula
• Número variável de cópias
• Dimensões muito variáveis: 3kb‐200 kb
• Células bacterianas podem conter mais do que um tipo de plasmídio
• Grupos de incompatibilidade plasmídica
• Importantes ferramentas em engenharia genética
DNA recombinante: clonagem molecular

 No processo de produção de um DNA


recombinante, corta-se, com a enzima de
restrição específica, o plasmídeo e o
emenda a um segmento de DNA Lugar da Clivagem

selecionado de outra espécie;

 O DNA recombinante é introduzido em Plasmídeo Hospedeiro


Clivagem por Endonucleases
uma bactéria hospedeira; de restrição

Anelamento
 Quando a bactéria transformada se
Ponto de ligação
e anelamento

reproduz, o DNA recombinante também se


replica, obtendo-se milhões de bactérias Extremidades DNA
recombinado
idênticas ou clones. Coesivas Genes
Específicos do plasmídeo

O resultado é a formação de uma colônia de bactérias transgênicas,


capazes de sintetizar diferentes substâncias.
Aplicação da clonagem molecular

1- O vetor DNA da bac-


téria e o gene da insu-
lina do DNA humano
são isolados pelas Lugar da Clivagem
A insulina foi a enzimas de restrição.
primeira proteína
humana produzida 2- Com a ajuda da em- Plasmídeo Hospedeiro
pela Engenharia zima DNA ligase, o DNA Clivagem por Endonucleases

Genética em humano é então ligado de restrição

ao plasmídeo vetor.
células de bactéria Anelamento Ponto de ligação
e anelamento
e aprovada para
uso em pessoas. 3- O plasmídeo recom-
Extremidades DNA
binante é introduzido Coesivas Genes recombinado
na bactéria hospedeira, Específicos do plasmídeo

que, ao se reproduzir,
Imagem: Autor desconhecido / GNU Free Documentation
passa a fazer cópias License.
produtoras de insulina
humana.
BIOLOGIA, 3º Ano do Ensino Médio
Tecnologias de manipulação do DNA: riscos e benefícios

As sequências de DNA utilizadas para identificar pessoas

No caso da identificação de  As amostras dos


pessoas, as sequências de DNA envolvidos são tratadas
usadas para detectar o DNA com endonucleases de
fringerprint são chamadas VNTR restrição;
(Variable Number of Tandem
 Depois, são colocadas
Repeats), isto é, “número variável
em uma mesma placa de
de repetições em sequências”, e
gel e tratadas com uma
são formadas por repetições de
sonda que revela certos
poucos nucleotídeos.
tipos de VNTR;
Com exceção dos gêmeos  O resultado é um padrão
univitelínicos, cada pessoa tem de faixas mostrado como
um padrão específico de um filme.
repetições herdados dos pais.
EXERCÍCIOS
• Exercício
Sobre os PCR tempo real...
PCR em tempo real

O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial
é denominado de Cycle Threshold (CT )

É possível o uso de corantes flourescentes intercalantes de DNA, tais como o


Sybergreen®, ou de sondas específicas acopladas a flouróforos de escolha. A
primeira técnica é mais específica que a segunda.

O uso de sondas do tipo Taqman, acopladas a diferentes fluoróforos, permite


realização do experimento em multiplex.

Embora a PCR em tempo real seja extremamente precisa, ela


não pode ser aplicada a estudos de carga viral.
• Exercício
Sobre os PCR tempo real...
PCR em tempo real

O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial
é denominado de Cycle Threshold (CT ) CERTO

É possível o uso de corantes flourescentes intercalantes de DNA, tais como o


Sybergreen®, ou de sondas específicas acopladas a flouróforos de escolha. A
primeira técnica é mais específica que a segunda. ERRADO

O uso de sondas do tipo Taqman, acopladas a diferentes fluoróforos, permite


realização do experimento em multiplex. CERTO

Embora a PCR em tempo real seja extremamente precisa, ela não pode ser
aplicada a estudos de carga viral. CERTO
• Exercício
Sobre os PCR tempo real...
Sondas (enzimas polimerases)

SyberGreen
Trata-se de sonda com menor especificidade.

Taqman
Trata-se de uma sonda mais específica, pode ser usada em ensaio multiplex...
Ou seja... Que possui mais de um alvo.

É possível o uso de corantes flourescentes intercalantes de DNA, tais como o


Sybergreen®, ou de sondas específicas acopladas a flouróforos de escolha. A
primeira técnica é mais específica que a segunda.
• Exercício
Sobre os PCR...
A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) em tempo real revolucionou
o processo de quantificação de fragmentos de DNA. Ela realiza a quantificação
desses ácidos nucleicos de maneira precisa e com maior reprodutividade.
Assinale o fator que permite essa quantificação:

a) O sequenciamento do DNA.

b) A eletroforese.

c) A carga elétrica do DNA.

d) Os marcadores STRs

e) A fluorescência.
• Exercício
Sobre DNA / RNA responda Certo ou errado

O DNA estoca e replica informação genética, possui atividade catalítica e é facilmente


degradado por hidrólise, o que facilita a reutilização de seus monômeros e, portanto, a
colonização da Terra com polímeros primordiais de DNA.

Errado.
atividade catalítica???

Existe a possibilidade de o RNA ter sido o precursor das demais moléculas, visto que
certas sequências de RNA, chamadas íntrons, são capazes de acelerar reações
químicas e, além disso, mostraram capacidade de fazer cópias de si mesmas.
Certo.
• Enzimas de restrição

Enzimas de restrição, ou endonucleases de


restrição, são proteínas produzidas por bactérias
que podem cortar a molécula de DNA sempre em
determinados pontos.
Certo.

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