Práctica No.

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Tinciones diferenciales

Objetivo: Realizar diferentes tinciones simples y diferenciales y reconocer las

diferentes estructuras y morfologías bacterianas.

Introducción:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de

ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es
la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de

teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más
corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se
realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las
células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo
que es realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas
o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna

afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos
son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son
moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan
con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá
atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la

microscopia, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de
metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células
bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se

dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve,
por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa
es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de
partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en
agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de
las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la
presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman
en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares
auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse
muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparación de un frote

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que
se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra.
Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril,
ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una
aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la
superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o
solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de
colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea
una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose
así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre
el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el
portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de
la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que
moleste al tacto, pero no queme.
Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con
la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

Tinción Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian

en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia
constitución química.

Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

Tinción Gram.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares, hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y
de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

Gram positivo Gram negativo

La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así
como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que
confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram positiva es
gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como
algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram
positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos,
y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram negativa es
peptidoglicano.

Las paredes de las bacterias Gram positivas contienen menos aminoácidos que
las Gram negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las Gram
negativas que en las gram positivas. Este hecho se ha propuesto como
explicación del mecanismo de la reacción al gram.

Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano

(mureina) unida a una membrana exterior por
lipoproteínas. La membrana exterior está
Tiene una capa gruesa de
hecha de proteína, fosfolípido y
peptidoglicano (mureina) y dos clases
lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la
de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico
porción de lípido está embebida en el
que está en la superficie, empotrado
fosfolípido y el antígeno O polisacárido está
en la capa de peptidoglicano y unido a
en la superficie. El lípido se llama Lípido A y
la membrana citoplásmica. Y ácido
es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se
teicoico de la pared que está en la
llama Endotoxina. La pared de la célula tiene
superficie y se une sólo a la capa de
poros llamado Porines para el transporte de
peptidoglicano. El ácido Teicoico es el
substancias de peso molecular bajo. Entre la
responsable del determinante
membrana citoplásmica y la pared celular
antigénico del organismo.
hay un espacio periplásmico con enzimas
hidrolíticas, enzimas inactivadoras de
antibióticos y proteínas de transporte.
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una
tinción Gram:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos,

aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas.
Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño

División a lo largo del mismo plano, formando cadenas

Forma esférica: Se cortas
llama coco Dos cocos juntos: Cuatro a veinte en cadenas:
Diplococos Estreptococos

División a lo largo de División a lo largo de tres planos

dos planos diferentes:
Regularmente: Irregularmente: Estafilococos
Tétradas
Sarcinas
Bacilos

Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Empalizadas, Bacilos
Forma de vara: Dos bacilos juntos: Cadenas de bacilos:
lado con lado o en
se llaman Bacilos Diplobacilos Estreptobacilos
figuras en X, V o Y

 Espirales. (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rígida se llama: Si la espiral es flexible y ondulada se llama:

Espirilo Espiroqueta

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes

formas en una misma especie.
Tinción Gram:

Bacterias Gram - positivas

Cocos Gram-positivos

Staphylococcus sp.: Ejemplo: Staphylococcus. aureus

Streptococcus sp. Ejemplo Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo B

Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Clostridium sp: Ejemplo Clostridium perfringens, Clostridium septicum

 Actinomycetes y Nocardia

Bacterias Gram-negativas

Cocos Gram-negativos

Neiseria sp. Ejemplo Neisseria meningitidis

Bacilos Gram-negativos

Enterobacteriaceae: Ejemplo Escherichia coli

Tinción Ziehl Neelsen

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos de

alto peso molecular (ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono)
que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido,
después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-
alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los
parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades
de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras.
Tinción de una expectoración conteniendo Mycobacterium tuberculosis
Tinción de esporas

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de
los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.)
formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el
ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa.
La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias
productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y
observación son de enorme interés.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil
tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con

agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo
colorante.

Esporas de la bacteria Bacillus anthracis

Tinción de cápsula.
Muchas bacterias segregan polímeros orgánicos de solubilidad limitada en agua y
que tienden a acumularse como capas sueltas y confluentes en la vecindad
inmediata de las células, justamente alrededor de la pared. Se denominan
cápsulas si el material está dispuesto de un modo compacto alrededor de la
superficie celular. Si el material es laxo, de manera que sólo forma una capa
difusa, se denominan capas mucosas o viscosas.

Las cápsulas y las capas mucosas, normalmente están compuestas de

polisacáridos, polipéptidos o complejos de polisacáridos y proteínas.

Las características de producir cápsulas, es una propiedad hereditaria del

organismo, pero estas estructuras no son componentes celulares absolutamente
esenciales, ya que cepas mutantes sin cápsula, son capaces de crecer en cultivo
puro.

Imagen a microscopía óptica de la cápsula del neumococo (Streptococcus pneumoniae)

Material:

Microscopio de campo claro Pizeta con agua destilada

Asa de platino Pizeta con solución de benzal al 10 %
Mechero Fisher Algodón
Portaobjetos Baño maría
Cubreobjetos Vaso de precipitado de 100 m l
Charola y puente de tinción Lápices de colores

Soluciones:

Tinción de Gram Tinción de Ziehl - Neelsen

Cristal violeta Fucsina Fenicada
Lugol Etanol - Ácido
Etanol - Acetona Azul de metileno de Loeffler
 Safranina Etanol

Tinción de cápsula (Método Tinción de espora (Método de

del Rojo Congo) Scheaffer – Fulton)
Rojo Congo para cápsula Verde malaquita
Mordente para cápsula Safranina para esporas

tinción de pared celular

Tinción simple para espora
(método de knaysii)
Mordente de Knaysii Cristal violeta
Fucsina fenicada

Descripción de la práctica:

Método de Gram

1. Colocar una gota muy pequeña de solución salina en el portaobjetos

2. Tomar con el asa de platino previamente esterilizada y no caliente una
pequeña porción de la colonia que se desea observar.
3. Colocarla sobre el portaobjetos en la solución salina y extenderla
suavemente sobre una superficie de 1.5 a 2.0 cm.
4. Dejar secar el aire.
5. Fijar los frotes al calor, pasando los portaobjetos tres veces sobre la
flama del mechero Fisher, por la cara contraria de aquella en que se
encuentra el frote. Tenga cuidado de no calentar en exceso.
6. Coloca la preparación sobre el puente de tinción y cubrir el frote con
solución colorante de cristal violeta.
7. Dejar actuar el colorante por 1 minuto
8. Lavar con agua destilada y dejar escurrir los frotes.
9. Cubrir con solución de lugol y dejar actuar por 1 minuto.
10. Lavar con agua destilada y dejar escurrir bien los frotis.
11. Enjuagar por goteo con etanol - acetona inclinando el portaobjetos para
dejar escurrir la solución hasta que ya no se observe color en la solución
de enjuague.
12. Enjuagar nuevamente con agua destilada.
13. Cubrir con solución colorante de safranina y dejar actuar por 1minuto.
14. Lavar suavemente con agua destilada y escurrir bien los frotes.
15. Dejar secar al aire y observar al microscopio
16. Registrar los resultados obtenidos con ilustraciones.
Gram – positivos

Cocos
En racimos: forma típica Staphylococcus sp. ejemplo: S aureus.

Bacilos gruesos: forma típica Clostridium sp,

Ejemplo: Clostridium perfringens y Clostridium septicum

Gram - negativos

Cocos

Diplococos: forma habitual

Neiseria sp, y Moraxella
Ejemplo: Neisseria. meningitidis y
Moraxella sp

Bacilos

Bacilos finos: forma habitual

Enterobacteriaceae
Ejemplo: Escherichia coli

Método de Ziehl – Neelsen

1. Preparar un frote en el centro del porta objetos como se explicó antes,

utilizando una cepa o mezcla de dos cepas que pueden ser de los siguientes
microorganismos:
o Mycobacterium phlei y Staphylococcus aureus
o Mycobacterium phlei y Escherichia coli
o Mycobacterium phlei y Bacillus subtilis
o Mycobacterium phlei y Streptococcus sp

2. Dejar secar al aire los frotes y fijar a la flama del mechero

3. Cubrir totalmente el portaobjetos con la solución colorante de fucsina-
fenicada
4. Calentar suavemente con un pabilo de algodón ligeramente humedecido con
etanol hasta emisión de vapores. Cuidar de que en ningún momento
hierva el colorante. Manteniendo esta emisión de vapores por lo menos 5
minutos.
5. Agregar más colorante si es necesario, no debe secarse el colorante en el
portaobjetos
6. Lavar los frotes con suficiente agua destilada.
7. Enjuagar con solución de alcohol – ácido inclinando el portaobjetos para que
escurra la solución hasta no existir decoloración.
8. Lavar con agua destilada rápido y suavemente.
9. Cubrir los frotis con solución de azul de metileno y dejar actuar 1 minuto.
10. Enjuagar nuevamente con agua destilada y escurrir bien los frotes
11. Dejar secar al aire y observar al microscopio
12. Registrar los resultados obtenidos con ilustraciones

Mycobacterium phlei

Tinción ácido-alcohol resistente (AAR+)

Cápsula. Método de Rojo Congo

1. En un portaobjetos limpios coloque una pequeña gota de rojo de congo,

puede hacer uso del asa para clocarla.
2. Utilizando esta gota realice un frote con el cultivo de Klebsiella penumoniae o
Bacillus subtillis y dejar secar al aire.
3. Sin fijar el frote cúbralo con una gota de mordiente para cápsula y déjelo
actuar por 1 minuto.
4. Con precaución lavar el frote con agua destilada hasta que no haya
coloración en el agua de enjuague.
5. Escurra el agua y deje secar al aire.
6. Observar al microscopio y registrar sus resultados con ilustraciones

Espora. Método de Sheaffer - Fulton

1. Haga un frote como se indicó en tinción de Gram, utilizando un cultivo de
Bacillus subtilis
2. Cubra el frote con verde de malaquita durante 1 minuto y caliéntelo a
emisión de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe hervir ni
secarse.
3. Lavar con agua destilada y escúrralo.
4. Cubra con safranina para esporas y deje actuar 30 segundos.
5. Lave con agua destilada y deje secar al aire.
6. Observar al microscopio y registrar sus resultados con ilustraciones.

Bacillus tinción de esporas

Esporas. Tinción simple

1. Con el cultivo de Bacillus subtillis haga un frote como se ha indicado antes.

2. Cubra el frote con colorante cristal violeta y dejar actuar un minuto.
3. Lave con agua destilada y dejar secar al aire
4. Observar al microscopio y registrar sus resultados con ilustraciones.

Pared celular. Método de Knaysi

1. Con el cultivo de Bacillus subtilis en agar BHI, haga un frote.

2. Cubra el frote con el mordente de knaysi y déjelo actuar durante 10 minutos.
3. Lave con agua destilada y déjelo escurrir bien.
4. Con el asa bacteriológica coloque gotas de fucsina fenicada sobre la
preparación húmeda.
5. Coloque un cubre objetos sobre la preparación y observe al microscopio
Evaluación:

Examen escrito sobre la temática de la práctica

Reporte de la práctica
Habilidades durante el desarrollo de la práctica

Análisis y discusión de resultados:

Tinción de Gram
Tinción de Ziehl – Neelsen

Tinción de Cápsula

Tinción de Esporas

Tinción de Pared Celular

Conclusiones:

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la razón de emplear colorantes en microbiología?

2. ¿Que es un mordente? ¿Cual es el que se emplea en la tinción de Gram

3. ¿Cual es la diferencia entre una tinción simple y una diferencial?

Actividades de síntesis:
 Explique como interaccionan los colorantes y los componentes
estructurales de los microorganismos
 Cuales son los componentes estructurales de los microorganismos
susceptibles de interaccionar con los colorantes
Referencias bibliográficas:

1. Beveridge, T. J. 1989. The Structure of bacteria. In Bacteria in Nature, Vol.

3.J. S. Poindexter and E. R. Leadbetter editors. New York: Plenim. Pp 1 – 65
2. Clark, G. L. 1973. Staining Procedures used by the Biological Stains
Comission.. 3 ed. Baltimore: Williams & Wilkins.
3. Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed.
Boston: Butterwortths
4. Scherrer, R. 1984. Gram`s Staining reaction, Gram Tyoes and Cell Walls of
bacteria. Trends Biochems Sci. 92: 242 – 45