UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL

FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y

ACUICULTURA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA

MICROBIOLOGÍA GENERAL Y DE LOS

ALIMENTOS:

“OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE
BACTERIAS”

DOCENTE: Dra. Flores Córdova, E. María Teresa

INTEGRANTES:
 Arapa Chambi, Yovana
 Ricra Quispe, Lourdes

PRÁCTICA: N° 05
AÑO: 3° “B”

MIRAFLORES, 12 DE JUNIO DEL 2015

I. OBJETIVOS
Aprender a usar las técnicas microscópicas para diferenciar bacterias
morfológicas y tintorialmente.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El examen microscópico de microorganismos constituye una de las técnicas
características de la Microbiología y aunque es posible observar ciertos
microorganismos sin colorear, en el caso de las bacterias se hace necesaria la
coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo. Para
obtener el máximo aprovechamiento de la observación microscópica, debe
poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y
composición química de las diferentes partes de la anatomía bacteriana.

III. MARCO TEÓRICO

3.1 Colorantes:

Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún
colorante. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el
contraste.

3.2 Observaciones Microscópicas de bacterias

Las bacterias solo pueden ser vistas con ayuda del microscopio con gran poder
de resolución. En la mayoría de las veces, son necesarias 400 o 1000 aumentos
para ver a estos microorganismos como pequeños cuerpos puntiformes, y
además, se deben aplicar ingeniosas técnicas de coloración para resaltar
algunas estructuras de su célula y contrastarlos con el medio.

Para realizar los estudios microscópicos de bacterias se deben disponer de

cultivos jóvenes, los cuales preparados convenientemente en láminas
portaobjetos, se llevan al microscopio y con los objetivos de mayor poder de
resolución (40 X o 100X) se observan para sacar la mejor información acerca
de su forma, agrupación, tamaño, estructuras y reacciones tintoriales.

Por lo menos, se deben distinguir dos tipos de observaciones microscópicas:

 Observaciones al estado fresco.- Que se hacen con células vivas, sin
ayuda de colorantes.

 Observaciones de preparaciones coloreadas.- Que se hace con bacterias

muertas y teñidas con ciertos colorantes que confieren su color al reaccionar
con algunas estructuras de la célula.

3.2.1 Observaciones microscópicas de bacterias al estado fresco

Se hacen para determinar la movilidad de los microorganismos vivos.

TECNICA DE LA GOTA PENDIENTE

• Ponga un poco de vaselina en las

cuatros esquinas de una lámina
cubreobjetos.

• Deposite una pequeña gota de

agua en el centro del cubreobjetos.

• emulsione en el agua una

pequeña porción de masa
microbiana.

• Adherir una lámina portaobjetos

excavada, haciendo coincidir el
centro de la gota con la parte más
profunda de la depresión.

• Voltear la preparación, llevarla

al microscopio y observarla con el
objetivo de 40X, en seco, o con el
objetivo de 100X, previa adición de Fig 1: Preparación de una muestra de gota pendiente
una gota de aceite de inmersión.

El examen en fresco se dirige principalmente a la detección de bacterias

directamente en las muestras, a obtener alguna información sobre su
morfología y con frecuencia, a determinar la motilidad de una especie aislada.
Las burbujas de aire producidas por un mal montaje, los artefactos, la
suciedad del portaobjeto y otros pormenores, pueden confundir al observador
no experto.
3.2.2 Observaciones de preparaciones coloreadas
Las técnicas por tinción son imprescindibles para el estudio microscópico de
las muestras y de los propios microorganismos, pues permiten observar con
detalle la morfología bacteriana y proporcionar información complementaria
sobre su comportamiento frente a determinados colorantes, lo cual posibilita
su diferenciación. Las preparaciones teñidas se visualizan en el microscopio
con el condensador alto y el objetivo de inmersión de gran aumento.

TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram fue desarrollada en 1884 por el bacteriólogo danés Hans

Christian Gram. Es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque
divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram-positivas y Gram-negativas.

En esta técnica se cubre la extensión fijada por calor con un colorante básico
morado, generalmente cristal violeta. Como imprime un color morado a toda
la preparación se denomina tinción primaria. Al poco tiempo se lava el
colorante y se cubre la extensión con lugol, un mordiente. Cuando se lava el
lugol tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas aparecen de
color violeta oscuro o morado. A continuación la preparación se lava con una
solución de etanol o de etanol y acetona. Esta solución es un agente
decolorante que elimina el color morado de las células de algunas especies
pero no de otras. Se lava entonces el alcohol y se tiñe la preparación con
safranina, un colorante básico rojo. La extensión es lavada nuevamente,
secada y examinada al microscopio.

El colorante morado y el lugol se combinan con las bacterias coloreándolas de

violeta oscuro o morado. Las bacterias que retienen este color después del
intento de decoloración con alcohol se clasifican como Gram-positivas. Las
bacterias que pierden el color violeta oscuro o morado tras la decoloración se
clasifican como Gram-negativas. Como las bacterias Gram-negativas quedan
incoloras tras el lavado con alcohol ya no son visibles. Por este motivo se
aplica entonces la safranina que tiñe a este tipo de bacterias de rosado.
Colorantes como la safranina, que se utilizan para proporcionar contraste, se
denominan colorantes de contraste.
Fig 2: Preparación de coloración Gram.
Como las bacterias Gram retienen la tinción morada inicial no se ven afectadas
por la tinción de contraste con la Safranina.

Los distintos tipos de bacterias reaccionan de forma diferente a la tinción

Gram debido a diferencias químicas de sus paredes celulares, que afectan a la
retención o salida del complejo cristal violeta – lugol (CV- L).

DIFERENCIAS ENTRE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

Entre las diferencias entre estos dos tipos de bacterias, las bacterias Gram
positivas, presentan una pared celular más gruesa compuesta de péptido
glucano, mientras que las Gram negativas la tienen más delgada, aunque
también con péptido glucano, además la pared celular de las Gram negativas
tiene una capa externa con lipopolisacáridos. El cristal violeta y el lugol
penetran con facilidad tanto en las bacterias Gram positivas como en las
negativas. En el interior el cristal violeta y el lugol combinan para formar el
complejo (CV-L). Este complejo es mayor que las moléculas de cristal violeta
que han penetrado y por su tamaño no puede ser lavado por el alcohol a través
de la capa intacta de péptido glucano de las células Gram positivas. Por
consiguiente, las células Gram positivas retienen el color del colorante cristal
violeta. Sin embargo, en las células Gram negativas el alcohol desorganiza la
capa externa de lipopolisacáridos y lava el complejo CV-L de la delgada capa
de péptido glucano. Como resultado, las bacterias Gram negativas quedan
decoloradas hata que se realiza la tinción de contraste con Safranina.
Introducción a la Microbiología, (1993)
3.3 CEPAS:
 Bacillus subtilis
Morfología

Bacillus es el género tipo de la

familia Bacillaceae. Es un bacilo
catalasa-positivo. Es un
microorganismo Gram –
positivo aerobio, forma
endoesporas. No se considera
patógeno para los seres
humanos, se usa como fungicida
para semilla de flores y de
productos agrícolas.
Microbiología de los Alimentos, (1997) Fig. 4: Bacillus subtilis

Salmonella typhi
Género: Salmonella
Fig. 5: Salmonlla typhi
Especie: typhi

La S. typhi es una bacteria anaeróbica

facultativa, Gram negativa. Estos bacilos
no producen esporas. La S. typhi produce
ácido a partir de glucosa, maltosa y
sorbitol, sin la producción de gas; pero no
fermenta la lactosa, sacarosa, la ramnosa
y otros azúcares.
Produce nitrito a partir de nitrato y
también produce ácido sulfhídrico. Su
temperatura óptima de crecimiento es de
37oC.
Es resistente a bajas temperaturas lo que
le permite transmitirse a través de
alimentos conservados a bajas
temperaturas

Universidad Nacional Autónoma de México (Microbiología)

 Staphylococcus aureus
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus

Staphylococcus aureus, conocido como estafilococo

áureo, o comúnmente estafilococo dorado, es una
bacteria anaerobia facultativa, gram positiva,
productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no
esporulada que se encuentra ampliamente
distribuida por todo el mundo, estimándose que una
de cada tres personas se hallan colonizadas, aunque
no infectadas, por ella.

Las cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina,

dejando como los antibióticos más eficaces para combatirlos a los aminoglucósidos,
las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina.3 Además de la administración del
tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser conveniente, en función del
caso, la eliminación de puertas de entradas como catéteres venosos permanentes o
drenajes quirúrgicos.

Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Microbiología)

Fig. 6: Staphylococcus aureus

IV. PARTE EXPERIMENTAL

A) MATERIALES Y REACTIVOS:

* Lamina porta y cubre objetos. * Agua destilada.

* Lamina excavada. * Mechero.

* Alcohol- cetona * Microscopio.

* Safranina. * Muestras

* Lugol. * Aguja de Kolle.

*Cultivo puro

*Aceite de inmersión
 B) PROCEDIMIENTOS:

- Realizar la técnica de la gota pendiente

Método de la gota pendiente

1. Se colocó 1 gota de agua destilada con ayuda de la aza de
Kolle.
2. Con la ayuda de la aguja de Kolle se llevó una gota del
cultivo (Escherichia coli) y se depositó en un cubre-objeto
limpio.
3. En las esquinas del cubre-objeto con el cultivo se colocó
sobre ella vaselina solida o parafina.
4. Con ayuda de un portaobjeto excavado se cubrió para que
quede pegada compactamente.
5. Luego la preparación fue observada en el microscopio
pudiendo determinar su morfología (bacilo) al igual que la
movilidad.

II. Realizar la técnica de coloración Gram

1. Preparación de un Frotis:

1. Se limpió un porta-objeto con ayuda de

algodón y alcohol, esperar a que este
seco para luego utilizarlo.

Fig. 7: Preparación del frotis

2. Se colocó 1 gota de H2O destilada y luego

se suspendió el m.o (Escherichia coli).

Fig. 8: Preparación del frotis

 3. Luego con el mismo instrumento de
siembra se tuvo que extender 1 cm de ancho
y largo.

Fig. 8 y 9: Preparación del frotis

4. Con ayuda de un mechero se procedió a

secar la gota de la preparación, la cual
tuvimos que controlar la temperatura con la
palma de la mano. (Fijación por acción del
calor)

Luego de la preparación del Frotis se prosiguió a la tinción con las soluciones

Fig. 10: Adición de la Sol. Cristal violeta

5. Se añadió 1 gota de solución de Cristal

Violeta y se dejó reposar por 1 minuto, luego
se lavó con agua corriente.

Fig. 11: Adición de la Sol de Lugol

6. Se añadió 1 gota de solución de Lugol y

se dejó reposar por 1 minuto, luego se lavó
con agua corriente.
 Fig. 12: Adición de la Sol. Alcohol- cetona

7. Se añadió 1 gota de solución de Alcohol-

cetona y se dejó reposar por 1 minuto, luego
lavar con agua corriente.

Fig. 13. Adición de safranina

8. Se añadió 1 gota de solución de

contracolor Safranina y se dejó reposar por
30 segundos, luego lavar con agua corriente.

En la observación microscópica las bacterias Gram-

positivas aparecen teñidas de color violeta, y las
Gram-negativas de rosa.

V. RESULTADOS
I. Realizar la técnica de la gota pendiente

Escherichia coli

No se logró apreciar el método de

gota pendiente puesto que el
microscopio que se utilizó no
estaba en condiciones óptimas.
II. Realizar la técnica de coloración Gram

Escherichia coli

OBSERVACION:

Se logró apreciar que el cultivo utilizado (Escherichia coli) no retienen el

colorante (cristal-violeta) quedando incoloras hasta la tinción de contraste con
el colorante rojo (safranina).

VI. DISCUSIONES

 Tórtora, G. en su libro: Introducción a la Microbiología, señala que: “… La

Escherichia coli tiñe de color rosado en la tinción Gram, por tanto es un
microorganismo Gram-negativo, no esporógeno.”

Estamos de acuerdo con el autor puesto que al realizar la coloración Gram, pudimos
observar a través del microscopio que nuestra muestra se tiñó de rosado, esto es
porque los microorganismos Gram-negativos no retienen el colorante (cristal-violeta)
quedando incoloras hasta la tinción de contraste con el colorante rojo (safranina).

 Geneser, F. en su libro: Histología microbiana, señala que: “Al tratar los preparados
con cristal violeta y Yodo, se forman agregados entre el colorante y el mordiente
que durante el proceso de decoloración, no pueden ser extraídos de las bacterias
Gram positivas debido a la gruesa capa de peptidoglicano. En las bacterias Gram
 negativas, la mezcla decolorante puede atravesar fácilmente la capa de lípidos de
la membrana externa y la delgadez de la capa de peptidoglicano presente,
permite la extracción de los agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al
ser tratadas con fucsina o safranina, las bacterias Gram negativas tomarán el color
del contra colorante”

Concordando con el autor, esto explicaría por qué nuestro microorganismo obtuvo una
coloración final rosácea, clasificándola así dentro de bacterias Gram negativas, esto
es debido a la delgada capa de peptidoglicano que la rodea.

 García, P. en su libro: Microbiología clínica práctica, señala que: “Para el frotis es

muy importante que se limpie la lámina portaobjetos con alcohol debido a que el
practicante no experto puede confundir los microorganismos con suciedad.”

En la práctica realizada, se corroboró lo citado por el autor, ya que, pese a haber

limpiado las láminas portaobjetos con alcohol, al realizar por primera vez esta prueba
fue difícil no confundir a los microorganismos con la suciedad propia del lente del
microscopio, y en algunos casos al no haber limpiado correctamente el portaobjeto se
confundió a las bacterias con suciedad.

VII. CONCLUSIONES
 Se aprendió a usar las técnicas microscópicas para diferenciar a las bacterias tanto
morfológicamente como tintorialmente.

 Las bacterias se pueden clasificar debido a su movimiento: si es real o browniano o

por su coloración: Si es Gram positiva o Gram negativa.

 Se necesitan instrumentos absolutamente limpios para poder realizar las pruebas

de Gota pendiente y Coloración Gram, ya que de no ser así se confundirán con
agentes externos (suciedad).

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

- García, P. et al (1994): Microbiología clínica práctica. Servicio publicaciones UCA.

España.

- Geneser, F.(1986). Histología microbiana. Editorial Médica Panamericana, Buenos

Aires.

- Tórtora, G. (1993): Introducción a la Mirobiología. Editorial: Acribia, España.