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UNAD
Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.
Antes de la escritura del libro del Génesis, se disfrutaba del vino en el Cercano
Oriente: recuérdese que, según la Biblia, Noé "sufrió" (o disfrutó)
accidentalmente los efectos de la fermentación espontánea del mosto de la uva
(primera borrachera con vino)
Se podría afirmar que esta era pre-científica termina en el siglo XVIII cuando
cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia
inanimada, es decir, usando el método experimental, con lo que se inicia el lento
declive de las ideas vitalistas (creencias erróneas de que "la vida depende de un
principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que aún darían sus
últimos estertores casi al final del siglo XIX.
Segunda época
El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y
Hooke (siglo XVII), facilitó un par de siglos más tarde, la comprensión, de la
verdadera importancia de las células procarióticas y eucarióticas, en procesos
relacionados con la fermentación y en el origen de las enfermedades infecciosas.
Tercera época
En la historia de la biotecnología se caracteriza por desarrollos en cierto sentido
opuestos, ya que por un lado la expansión vertiginosa de la industria
petroquímica tiende a desplazar los procesos biotecnológicos de la fermentación,
Aunque estos tres grupos se complementan entre sí, existe una diferencia
fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el
conocimiento de las características y comportamiento de los microorganismos y
en el uso deliberado de estas características (de cada organismo en particular),
para el logro de objetivos específicos como la obtención de nuevos productos o
procesos. La enorme potencialidad del último grupo se deriva de la capacidad de
manipular, las características estructurales y funcionales de los organismos y de
aplicación práctica de esta capacidad para superar ciertos límites naturales en el
desarrollo de nuevos productos o procesos.
Existen tres áreas diferentes en las cuales la biotecnología puede influir sobre la
producción animal:
Biotecnología Humana Las técnicas del ADN están siendo utilizadas para
determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para confrontar
donantes de órganos con receptores en programas de trasplante, unir
sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen (biotecnología
forense).
El primer tratamiento exitoso en terapia génica fue en 1990, cuando se trató una
enfermedad del sistema inmune de niños llamada "Deficiencia de ADA". Células
sanguíneas con los genes correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del
paciente donde produjeron suficientes células normales que permitieron mejorar
el sistema inmune.
En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del
tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y biofiltros,
métodos de descontaminación de los derramamientos de petróleo mediante el
uso de microorganismos nativos o transformados genéticamente. Algunos
trabajos de investigación científica se están realizando sobre biodigestores de
alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todavía
discreto.
Algunos descubrimientos útiles serán una consecuencia directa del uso de las
técnicas de ingeniería genética que logren transferir determinados genes (a veces
incluso genes humanos) a un determinado microorganismo apropiado, para hacer
el producto que es precisamente requerido en el mercado. Determinadas
proteínas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se conseguirán de
esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, serán el resultado de la
fabricación mediante técnicas de fermentación, de anticuerpos específicos para,
fines analíticos y terapéuticos. Estos anticuerpos monoclonales se producirán
mediante el uso de microorganismos en grandes fermentadores, como por
ejemplo la producción de antibióticos como la penicilina.
Habrá que llegar a un diálogo racional entre los diversos actores (científicos,
empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto
empleo de estas tecnologías, que por un lado no impida aplicaciones benéficas
sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos ámbitos donde las dudas
razonables hagan recomendables más restricciones. El ideal sería permitir todo
aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en
buena parte imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presión que pueden
esconder agendas políticas ocultas.
CAPITULO 2 BIOTECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES
Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con
fines energéticos o plásticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso,
los nutrientes deben suministrase en los diferentes medios de cultivo.
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que
son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de
crecimiento que lo son solamente en pequeñas cantidades. Empezaremos por los
macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrógeno.
1.1 Macronutrientes:
Prácticamente la totalidad de la masa celular está formada por sustancias con
cuatro tipos de átomos: Carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Estos cuatro
elementos constituyen el esqueleto de las macromoléculas así como las
moléculas orgánicas pequeñas.
Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de
oxidación – reducción que implican compuestos orgánicos, pueden contemplarse
en dos grandes grupos: (1) Fermentación, en que los procesos de oxido –
reducción ocurren en ausencia de aceptores terminales de electrones añadidos; y
(2) respiración, en que el oxígeno molecular u otros oxidantes sirven como
aceptores terminales de electrones.
Glucosa
2 lactatos +2 H+
Nótese que ésta es una reacción balanceada y que los productos, lactato más
protones, tienen la misma proporción de átomos de hidrógeno y oxígeno que la
glucosa. Esta reacción puede analizarse desde tres puntos de vista:
Termodinámicamente, por la energía de enlace y por el metabolismo
intermediario.
Cada una de estas vías tiene funciones y unidades específicas para los
microorganismos. Las dos primeras vías son comunes tanto a organismos
respiratorios como fermentativos, procariontes o eucariontes. La tercera se halla
restringida a procariontes. Al existir diferentes vías de fermentación se obtienen
también diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentación se
observan en la siguiente tabla
Tabla 1. Productos derivados de la fermentación
El valor del tiempo de generación (g) depende de: composición del medio,
temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), entre otros.
En los organismos unicelulares la célula se divide por fisión binaria dando lugar a
dos células hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos
células nuevas, por lo que en cada periodo e división la población se duplica. Esta
multiplicación representa una progresión geométrica en la cual hay una relación
directa entre el número de células iniciales y la cantidad de células en otro
tiempo determinado. La expresión matempática que representa esta relación es:
N = No2n Donde:
N= numero final de células,
No = número inicial de células
n = número de generaciones
donde,
de donde:
ln X1 –= ln Xo + µt
µt
X1 = Xoe
Considerando que después de un tiempo la población se duplica (td) entonces:
X1 = 2Xo por tanto, la duplicación de la población celular se puede expresar así:
entonces:
µ = 0.693/td
Ejemplo explicativo:
Tiempo(hr) N
Número de
células /ml
0 2x107
1 3x107
2 4 x107
3 6 x107
4 8 x107
5 1 x108
N= N2n
Donde N = numero final de células, No= numero inicial de células y n = numero
de generaciones, por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que
n= ( logN-logNo) / log 2
G = t/n
G= 5hr/2.32 generaciones
G= 2.15 horas
µ = ln 2 /td
µ= 0.6931/ 2.15
µ = 0.3223
1/S sobre el eje X. Se obtendrá una línea recta que corta al eje Y, y el valor en el
conoce µmáx se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy bajos
3) Fermentación continua.
En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva
estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de
solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca
simultáneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones
continuas pueden ser distinguidos dos tipos básicos:
A velocidad más baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las
células (S O). La concentración de células es entonces X = So/Y. Si D aumenta,
X desciende lentamente, al principio en forma lineal y luego a D = µm cae
bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al principio y se aproxima a So a D
= µm. Cuando X es cero en la ecuación que explica el sustrato (S), se alcanza el
punto de lavado Dm.
Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo es
sólo ligeramente más baja que D" el sistema es muy sensible a las influencias
externas. Pequeñas desviaciones en la alimentación pueden originar cambios
extremos en la biomasa o en la separación de las células. La Figura 4 muestra la
interdependencia de la velocidad de flujo, la concentración de substrato, la
concentración de células y la velocidad de formación de células (µm = 1 h-1 Ks =
0,2 g/l Y = 0,5).
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energía
de las células (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros
coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente designados, como
muestra;
3.4.1 Biorreactores
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología
industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal
que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las
"tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:
a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo
a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.
b) Mantener constante y homogénea la temperatura.
c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo
el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo
deseado.
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté
provisto de un sistema de agitación, a demás para el punto d) se requiere de un
sistema que inyecte aire en el cultivo.
El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona
que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale
de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose
de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2
hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis
deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que
imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y
mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua,
lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó 2000
litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que
circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a
medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor
generado, por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los
tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y
posterior
esterilización.
4.4.2Transferencia de O2
Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio
a un proceso industrial son las siguientes:
1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera
indicación que es posible un proceso de interés industrial.
3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000
litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no
es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es
deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo
que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador
industrial.
• E+S ES E+P
OXIDORREDUCTASAS
Catalizan las reacciones de oxidorreducción: transferencia de hidrógeno o de
electrón(es) de un donador, que está oxidado, a un receptor, que está redu-
cido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas
llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas.
Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshi-
drogenasa" o "receptor: reductasa". El término oxidasa no se ha conservado
salvo cuando el receptor es el oxígeno.
TRANSFERASAS
Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos
(metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.).
Fig. 4: TRANSFERASAS se
encargan de transferir grupos
funcionales
HIDROLASAS
Provocan la hidrólisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osídico), amida
(peptídico), (Fig. 7)
Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es
hidrolizado.
Fig.5: HIDROLASAS..Reacciones
de hidrólisis, transforman polímetro
en monómeros
LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algún otro, por medios
diferentes a la hidrólisis o a, la oxidación, con formación de un doble enlace en
alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas actúan en sentido inverso -
condensación de dos moléculas con desaparición de un doble enlace se les
designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases
precisan la identidad de la fracción eliminada: CO2, aldehído, amoniaco, etc.
El nombre sistemático se forma de acuerdo al modelo, substrato: fracción
eliminada-liasa.
Fig. 7: Ejemplo de
Isomerización
LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reacción de unión de dos moléculas, acopladas a la
ruptura, sin intervención del agua, de un enlace pirofosfórico en el ATP o
eventualmente en un nucleótido trifosfórico del mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - °, C - S, C -
N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del producto formado
(amida, péptido, etc.) o a la reacción que es catalizada.
El nombre sistemático es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando
ADP), X Y, son los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir
del nucleótido trifosfórico implicado .en la reacción (ADP o AMP) se indica entre
paréntesis.
Para darle nombre común se utiliza, en general, el nombre del producto formado
seguido del término "sintetasa".
Fig. 8: Ligazas
Capitulo 3: CINETICA ENZIMATICA
Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales
de la cinética enzimática son:
a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario
transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la estructura
entre el sitio activo de la enzima y la molécula del substrato.
c) Por otra parte, para una concentración dada de substrato, el estudio de las
variaciones de la velocidad inicial de reacción en función de la concentración
de enzima (fig. 10) muestra que esta variación no es lineal. La curva presenta
un trazo hiperbólico correspondiente al hecho de que para una cierta
concentración de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma
de complejo enzima-substrato;
Fig. 10. Curva que representa
la velocidad enzimática en
función de la concentración de
la enzima
Figura 11 : Representaciòn
gráfica de Michaelis-
Menten
Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden
decreciente de interés tecnológico, una de las más importantes enzimas
vegetales de uso industrial se encuentran: la papaína que proviene de una planta
ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extraída de la pifia (Ananas
comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).
Los métodos de aislamiento que se utilizan son los métodos clásicos, el más
importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un
medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato de la enzima es la única
fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el almidón como única
fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.
Las técnicas de difusión en agar se han desarrollado para la detección de la
actividad enzimática. Esta prueba, en las condiciones estándar, puede dar
información de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea retenida
definitivamente debe presentar algunas características, de acuerdo a Aunstrup y
col. (1979) y Sicart (1980):
5. Inmovilización de enzimas
Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilización entraña con
frecuencia una pérdida de actividad, muy variable según sea la naturaleza de la
enzima y el modo de fijación; pero también se han señalado algunos casos en los
que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podrían
explicarse por una modificación estérica del sitio activo de la enzima bajo el
efecto de un cambio de conformación de la cadena polipeptídica.
La estructura y función básica de los genes se conocía desde finales de los años
sesenta. Más aún, la labor de los bioquímicos había producido un gran cúmulo de
conocimientos respecto de los conjuntos de reacciones químicas que ocurren
dentro de los seres vivos. Las vías metabólicas fundamentales para la generación
de energía y la biosíntesis de la mayoría de los compuestos esenciales para la
vida ya estaban establecidos. (Saberon , 1997)
El producto de la digestión del ADN con endonucleasas de restricción está constituido por muchos
fragmentos específicos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros. Estos
fragmentos se ligan después a un segmento especial de ADN, el vehículo de donación
(usualmente un plásmido), que fue cortado con la misma enzima. Las moléculas recombinantes
resultantes contienen un ADN vehículo o vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva
molécula circular continua.
Plásmidos:
Todos los plásmidos que se usan como vectores poseen tres características
comunes:
1. Un sitio replicador
2. Un marcador de selección
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)
1. Sitio replicador:
2. Marcadores de Selección:
Los marcadores de selección más usados sobre todo en bacteria son genes
que codifican para la resistencia a determinados antibióticos. Los
antibióticos son sustancias químicas que producen la muerte de los
microrganismos pero son relativamente poco tóxicos a las células
eucarióticas.
MUTAGENESIS
El procedimiento completo de
mutagenesis dirigida, ha sido modificado
continuamente, encaminadas a
incrementar la tasa de mutantes
obtenido, se debe empezar con el gen de
interés clonado en un ADN
monocaternario. Un vector ampliamente
utilizado para la mutagénesis dirigida es
el bacteriófago M13que tiene
propiedades utiles en la tecnología del
ADFN recombinante. El AFN diana se
clona en M13. Como las células
infectadas con este fago permanece viva,
se dispone de una fuente continua de
ADN
Sin lugar a dudas, estas técnicas han revolucionado la forma obtener productos y
su comercialización, sin embargo existen todavía muchos inconvenientes de
costos y éticos que aun no se han resuelto. Una de las mayores controversias se
ha suscitado ha raíz de la obtención de animales y vegetales transgenicos con
fines terapéuticos y /o alimenticios.
Lección 4: Animales Transgénicos
Actividad:
- Investigue un tipo de alimento gm que se este comercializando en Colombia
explique la técnica de ingenieria genética utilizada en la producción.
- Organice un foro con sus compañeros sobre las ventajas y desventajas de los
alimentos gm en la alimentación mundial, saque las conclusiones
correspondientes y preséntelas en un informe: Para ello tenga en cuenta:
definición, tipos de alimentos gm, técnicas que se utilizan, ventajas y
desventajas.
UNIDAD 3: PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS DE INTERES ALIMENTARIO
Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los
alimentos, y tanto éstos como las bebidas fermentadas constituyen un sector
primario y extremadamente importante de la industria aumentaría. En este ca-
pitulo se describirán algunos procesos para la obtención de compuestos derivados
del metabolismo energético (fermentación), metabolismo intermedio y biosíntesis
Lección 3: Condiciones de la
fermentación
En la fermentación las levaduras utilizadas para la elaboración de cerveza (S.
cerevisiae) utilizan los azúcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este
orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el
espacio periplásmico extracelular. Los azúcares son transportados a través de la
membrana celular por transporte activo o pasivo mediado por permeasas
producidas constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son
hidrolizadas intracelularmente por la α-glucosidasa, Saccharomyces uvarum (S.
car/sbergensis) se distingue taxonómicamente del S. cerevisiae en que también
Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y Kluyveromyces lactis, que a
diferencia de S: cerevisiae pueden fermentar la lactosa, tienen un sistema
lactosa-permeasa para transportar la lactosa dentro de la célula, donde se hi-
droliza a glucosa y galactosa, que entran en la glicólisis. Excepto los Saccha-
romyces diasraucus, que no son adecuadas para la elaboración de cerveza todas
las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almidón y las
dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en almidón para
la fermentación alcohólica requieren la acción de enzimas exógenos como las α y
β-amilasas de la malta o enzimas microbianos como a-amilasa, amiloglucosidasa
(glucoamilasa) y pululanasa. Los azúcares mayoritarios del mosto son la glucosa
y la fructosa y puesto que el S. cerevisiae metaboliza preferencialmente la
glucosa; el azúcar no fermentado que permanece en el vino resultante es la
fructosa. Por el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la fruc-
tosa más rápidamente que la glucosa.
El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19 aminoácidos además
de otros nutrientes. Estos aminoácldos son asimilados a distintas velocidades
durante la fermentación. Un aminoácido permeasa general (GAP puede
transportar todos los aminoácidos básicos y neutros excepto la prolina. En las
levaduras existen al menos otros 11 sistemas de transpone de aminoácidos más
específicos. La prolín permeasa es inhibida por otros aminoácidos: por el
amoníaco.
El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el cre-
cimiento de las bacterias del ácido acético y del ácido láctico, aunque la super-
vivencia de !as primeras sea usualmente corta debido a las propiedades reducto-
ras del medio. Las bacterias lácticas del vino son anaerobias facultativas u orga-
nismos microfílicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos
Lactobacillus producen ácido láctico a partir de glucosa) y heterofermentivos
(todos los Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen ácido láctico, etanol y
CO2 a partir de la glucosa). Las bacterias lácticas pueden metabolizar los ácidos
málico y tartárico presentes en el vino a concentraciones elevadas, así como al
ácido cítrico, presente en cantidades más bajas. Existen métodos químicos para
reducir la acidez. La reducción de los ácidos puede impedir el deterioro de los
vinos de pH elevado. A pH 3,3-3,4, los Leuconostocoenus fermentan el ácido
málico aunque los Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los
pH bajos y generalmente se prefieren siempre que se desee una fermentación
malo-Iáctica. Una fermentación malo-láctica por Pediococcus va con frecuencia
acompañada de la formación de diacetilo e histamina, indeseables.
Lección 7: Vinagre
C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O
La materia prima de la fermentación del vinagre de alcohol (white spirit) consiste
usualmente en etanol purificado diluido. Los vinagres de vino, sidra, malta y
arroz se obtienen por fermentación alcohólica de zumos de uva, manzana,
cebada malteada y arroz, respectivamente. La fermentación del vinagre requiere
también una fuente de nitrógeno y una combinación apropiada de minerales y
con frecuencia es necesaria la suplementación con nutrientes. Las modernas
fermentaciones de vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El
acetator Frings (Fig. 7.8), muy utilizado en la producción comercial de vinagre,
es un fermentador provisto de deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de
cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya rotación hace que el aire sea
succionado a través del rotar hueco y se distribuya radialmente a lo largo de toda
la sección trasversal del fermentador.
Los procesos comerciales típicos, que producen ácido acético del 12 al 15 OJo, se
llevan a cabo de forma semicontinua. Las concentraciones de alcohol y de ácido
acético al comienzo del ciclo son del 7-10 % y del 5 1110 respectivamente;
la fermentación se efectúa entre 27 y 32 °e hasta que la concentración de alcohol
desciende al 0,1-0,3 %, momento en el cual se descarga una parte del vinagre
(aproximadamente la tercera parte) y el recipiente se vuelve a llenar con una
mezcla que contiene del O al 2 % de ácido acético y del 12 al 15 % de etanol y el
ciclo se repite. Un alcalógrafo mide la concentración de etanol y hace que las
operaciones de descarga y llenado se puedan llevar a cabo automáticameme, sin
interrupción del proceso de aireación/mezclado de forma que impida el ago-
tamiento total del etanol en el caldo de fermentación. El mezclado rápido conti-
nuo es esencial para minimizar los gradientes de concentración. Los tiempos del
ciclo varían de 24 a 48 horas.
Las bacterias acidoacéticas, que oxidan el etanol a ácido acético y pueden existir
a valores bajos de pH, pertenecen a los géneros Acetobacter y Gluconobacter,
estrechamente relacionados. Los cultivos puros de estos organismos se
caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las fermentaciones industriales
se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de cultivos
puros. Los cultivos industriales se seleccionan en función de que toleren una
acidez elevada y de que las velocidades de producción de acetato sean altas.
Estas bacterias son extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de
oxígeno y etanol y también resultan dañadas a gradientes de concentración de
etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxígeno aumenta a medida que lo
hace la concentración total de ácido acético más etanol. No obstante, con una
aireación suficiente, puede conseguirse una utilización del 80 % de oxígeno sin
producir efectos adversos en la fermentación. La sobreoxidación, esto es la
conversión de ácido acético en CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la
concentración de ácido acético por encima del 6 % e impidiendo el agotamiento
total del etanol.
Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente
está sujeta a una gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel in-
dustrial el substituirlos por polisacáridos similares obtenidos por fermentación,
por ejemplo el polisacárido de Azotobacter vinelandii. Entre otros polisacáridos
microbianos de interés comercial se incluyen el pululano, producido por
Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium
y el gelano, producido por Pseudomonas elodea.
Los procesos destinados a la producción de exopolisacáridos microbianos se
caracterizan por la elevada viscosidad del medio de fermentación. Las bajas
concentraciones de producto obtenidas y los cambios conformacionales del
polímero ocurridos durante la fermentación. El control de los constituyentes del
medio así como de otros parárnetros de la fermentación es crítico para conseguir
las velocidades de síntesis deseadas. Los estudios limitados realizados indican
que la modificación del exopolisacárido mediante manipulación del medio de
cultivo parece influir en el grado de polimerización más que en la estructura real
y en la composición de la unidad repetitiva.
Entre los mecanismos por los cuales actúan estas bacterias se pueden
mencionar: primero, la transformación de la lactosa en ácido láctico, este último
compuesto funciona como un antiséptico del sistema digestivo, segundo, el ácido
láctico facilita la absorción del calcio y fósforo contenido en la leche, tercero, el
aumento de la población bacteriana benéfica suministrada en alimentos,
incrementa la producción de vitamina B6 potenciando y fortaleciendo el sistema
inmunológico. Cuarto, Al mismo tiempo minimizan la proliferación de agentes
patógenos peligrosos responsables de graves enfermedades seguidas de muerte
compitiendo por alojamiento o espacio físico en las paredes intestinales. Quinto,
los microorganismos prebióticos pueden sintetizar bacteriocinas, las cuales son
sustancias que inhiben el crecimiento de bacterias patógenas.
Un producto para que sea considerado como probiótico debe reunir las siguientes
características:
- Fructooligosacáridos-Suntory(Japón),
Isomaltooligosacárido, ShowaSangyo(Japón)
- Oligomate(galactooligosacáridos) -
Yakult(Japón)
- Palatinosa-Südzucker(Alemania)
- polidextrosa
.
Actividades:
Materiales:
Cajas petri con Agar saboreau 20
Asas de argolla 20)
Caldo de fermentación
Sacarosa 20 g
Extracto de levadura 5g
K2HPO4 1g
Bisulfito de Sodio 150 ppm,
H2O d 1000 ml
Equipos:
Espectofotometro uv-visible, balanza y baño maría, incubadora,
Procedimientos
Con asas de argolla colectar una muestra del sustrato fermentado (guarapo) y
sembrar por estría la cajas petri con Agar saboreau, incubar a 30 OC durante 48
horas Describir la morfología de las colonias (Color, forma, borde, apariencia,
elevación)
Y compararlas entre sí identificando por cada sustrato el tipo de colonia.
Seleccionar varias colonias del mismo morfotipo e inocularlo en 200ml del caldo
de fermentación. Incubar a temperatura ambiente por ocho días.
Con una asa estéril tomar una muestra del sustrato fermentado y hacer siembra
por estría en cajas petri e incubar a 30° C durante 48 horas.
Lecturas: Evaluar al tiempo cero y a los ocho días, la concentración de azúcar por
el método de orto-toluidina (Ver anexo) con el fin de evaluar el consumo de
azúcar en los procesos de fermentación.
Compare entre todas las cepas cual es más eficiente en el consumo de azúcar.
Materiales
Equipos:
Espectofotometro uv-visible, balanza y baño maría, incubadora,
Procedimiento.
Prepare una suspensión del microorganismo a cultivar por lavado de un tubo con
agar-saboreau de 24 h de incubación con 5 mL de agua destilada estéril.
Calcule:
Biomasa (X) por gravimetría inicial y final
Azúcar inicial y final por orto-toluidina
Las condiciones físicas y químicas óptimas para la multiplicación celular son muy
distintas de las que favorecen la fermentación de los hidratos de carbono, por
ejemplo en la fermentación alcohólica. En efecto, para obtener una multiplicación
rápida y una alto rendimiento, la velocidad de disolución de oxígeno debe ser
superior a la velocidad de consumo del mismo y en cambio la concentración de
los nutrientes, especialmente los hidratos de carbono, debe ser baja sin llegar a
cero, con lo que evita la fermentación (alcohólica) de los hidratos de carbono,
fermentación que de ocurrir, disminuiría el rendimiento de células por gramo de
azúcar colocado.
Procedimiento
Realice al menos dos lecturas por día, para lo cual colecte muestras por triplicado
para cada una de las mediciones:
Determinacion de azúcares.
INTRODUCCION
Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen
preferencia por un tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles
para algunas cepas de una especie en particular.
Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las
cepas de un organismo, y puede ser medida como la variación en la velocidad de
crecimiento, consumo de sustrato o generación de producto.
EQUIPOS Y MATERIALES
8 x 2 g de levadura seca o húmeda de cerveza o de
panadería. Preferiblemente 3 grupos de laboratorio deben trabajar con el
mismo tipo de levadura.
200 cm3 de solución de fructosa 0.2M
200 cm3 de solución de galactosa 0.2M
200 cm3 de solución de glucosa 0.2M
200 cm3 de solución de lactosa 0.2M
200 cm3 de solución de maltosa 0.2M
200 cm3 de solución de rafinosa 0.2M
200 cm3 de solución de sucrosa 0.2M
8 x 0.5g de ortofosfato dihidrogeno de amonio
8 x 0.5g de sulfato de amonio
(Alternativamente puede emplearse 1g de nutriente de levadura disponible
comercialmente, para reemplazar las dos sales de amonio)
8 x 250 cm3 erlenmeyers
8 x tapones de caucho con dos orificios
Varillas de vidrios
Bureta de 50 cm3
Jeringas aforadas de 25 cm3 o equivalentes para
muestreo
8 x 100 cm3 erlenmeyers para titulación
Solución de hidróxido de sodio 0.1M (alrededor de
400cm3)
Solución indicadora de fenolftaleina y gotero.
METODOLOGIA
1. Debes desarrollar el laboratorio de la manera más aséptica posible. Sin
embargo para evitar problemas asociados a la contaminación vas a emplear un
1
inoculo de gran tamaño (2g de levadura por fermentador) y un periodo de
incubación corto (24 horas).
3. Para preparar una solución de azúcar 0.2 M adiciona las siguientes cantidades
de azúcar y llévalo hasta 200 cm3.
Fructosa 7.2g Galactosa 7.2g
Glucosa 7.2g Lactosa 14.4g
Maltosa 14.4g Rafinosa 23.8g
Sucrosa 13.6g
BIBLIOGRAFIA
1
Schollar, J. and Watmore, B. Practical Fermentation. Technical Guide. National
Centre for Biotechnology Education, The Society for General Microbiology,
London, 1999. page 7
1) Conjugación
Material biológico:
Plásmido: se utilizará el plásmido pUT (5.2 kpb). Este plásmido contiene el origen
de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la
proteína p desde un bacteriofago lisogénico l (lpir), y el origen de transferencia
del plásmido conjugativo RP4. El plásmido contiene también el gen de la
transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O
de recombinación (transferible mediante la actividad transposasa). Como
elemento de selección del plásmido, también lleva un gen de resistencia a
Ampicilina (una b-lactamasa, bla). Para que sea transferido, este plásmido
requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E.
coli S17-1lpir. El mapa de restricción del plásmido se presenta a continuación:
1
Cepas de E.coli: se emplearán las cepas de E.coli CC118lpir y S17-1lpir
transformadas con el plásmido pUT. Sólo la cepa S17-1lpir posee la capacidad de
transferir el plásmido a otras cepas, pues contiene en el cromosoma genes de
RP4 necesarios para la conjugación. La cepa CC118lpir será empleada como
control negativo en la transferencia.
Procedimiento:
2) Sobre una placa de agar común, depositar dos filtros estériles de nitrocelulosa
separados (actuarán de soporte sólido para la conjugación). Marcad en las placas
debajo de cada filtro CC118 y S17. Añadir 10 ml de la suspensión de Salmonella
en cada uno de ellos, dejar que absorba el líquido y añadir sobre uno de los
filtros 10 ml de la suspensión de E.coli CC118lpir, y sobre el otro 10 ml de la de
S17-1lpir. Incubar toda la noche a 37ºC.
3) Al día siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de
esterilidad), introducirlo en sendos tubos estériles. Añadir 5 ml de SO4Mg 10 mM,
agitar intensamente y extender 100 ml en dos placas de selección (Rifampicina
80, Kanamicina 10). Dejar crecer a 37ºC durante toda la noche.
2) Transformación
1
introducir plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento
químico de éstas.
Materiales:
Material no biológico:
Dos placas de agar lactosado de McConkey con 100 mg/ml de ampicilina (Agar
Mc de selección)
Procedimiento:
2) Tras esta incubación, distribuir las células tratadas con el Cl2Ca en dos tubos
con 100 ml cada uno. Añadir 10 ml de la mezcla de plásmidos a uno de ellos,
dejando el otro sin DNA (control negativo). Incubar ambos en hielo durante 20
min. Someterlos posteriormente a un choque térmico a 42 ºC durante 90
segundos exactamente en un baño de agua previamente estabilizado a esta
temperatura. Volver a enfriar en hielo (2 minutos), añadir 800 ml de caldo
común e incubarlos en la estufa de 37 ºC durante 30 min para que se exprese el
1
gen de resistencia al antibiótico. Tras ese tiempo, extender 100 ml de cada tubo
sobre sendas placas de agar Mc de selección e incubarlas a 37ºC durante 24 h
3) Observar la cantidad y tipo de colonias que aparecen sobre cada una de las
placas.
INTRODUCCIÓN
a) Material vegetal
b) Protocolo experimental
b.2.) Siembra
1
Cortar discos de hojas de 1 cm de diámetro sobre una superfície estéril (placa de
Petri o vidrio autoclavados) dispuesta dentro del gabinete de flujo laminar.
Disponerlos con la cara abaxial de la lámina en contacto con el medio sintético de
cultivo. Repicar los explantos a medio fresco cada 15-20 días.
b.4.) Rusticación
c) Medios de cultivo
Macronutrientes mg/L
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O 370
Micronutrientes mg/L
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4.H2O 22.3
ZnSO4.7H2O 8.6
Na2MoO4.2H2O 0.25
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
1
FeSo4.7H2O 27.8
Vitaminas mg/L
Myo-inositol 100
Piridoxina-HCl 0.5
Tiamina-HCl 0.1
Glicina 2.0
pH 5.7