BSR: INTERPRETACION Y CONTEO DE CALDOS DE CULTIVO

ADAPTACIÓN DE NORMA API RP 38

Alcance del método

Esta metodología se aplica solamente para el conteo de BACTERIAS

SULFATO REDUCTORAS PLANCTONICAS.

Principio del método

La biocorrosion es un proceso de corrosión provocada o acelerada por agentes

biológicos.
Dentro de estos agentes se encuentran las denominadas bacterias sulfato
reductoras.
La implementación de medidas de prevención y control de la corrosión
microbiológica exige contar con una metodología para su conteo.
En la industria petrolera el método mas usado es el de dilución serial a
extinción.consiste en inocular 1 ml de agua de formación a evaluar en un medio
de cultivo liquido (caldos de cultivo BSR) y realizar diluciones seriales del mismo.
Este medio de cultivo liquido (caldo inoculado) durante el transcurso del tiempo
de incubación se colorea de negro (precipitado de FeS) lo que indica la presencia
de bacterias BSR en el medio de cultivo.
Los medios de cultivo deben ser de una salinidad similar al agua del sistema que
se va a evaluar.

Es importante conocer la definición de los siguientes términos:

 Planctónicos: Son los microorganismos que flotan o deambulan en una
corriente de agua.
 Sésiles: Son los microorganismos adheridos a una superficie.
 Anaerobios: Son los microorganismos capaces de crecer en ausencia de
oxígeno.

Muestreo

Para obtener resultados significativos la inoculación de los caldos de cultivo debe

realizarse obligatoriamente in situ y es aconsejable realizar como mínimo 2
muestreos o cultivos.
En casos que la inoculación no pueda realizarse in situ se deberá recoger la
muestra en envases de vidrio o plástico previamente esterilizados, y llenados en
su totalidad y tapados cuidando de no dejar cámara de aire. (considerando que
las BSR son organismos anaerobios).
Lo conveniente es inocular los caldos cuando antes sea posible. La inoculación
no debe exceder las 24 horas entre el muestreo y el cultivo de los caldos.
Equipos, materiales y reactivos

- Estufa de cultivo.
- Caldos de cultivo (similares a la salinidad del agua a evaluar).
- Jeringas descartables estériles de 1 ml con aguja.

PROCEDIMIENTO

1- INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1.1 Enumerar los caldos necesarios para cuantificar el número de bacterias que
se espera encontrar en el medio a evaluar.

1.2 Con una jeringa tomar 1 ml del agua del sistema a evaluar (el muestreo debe
realizarse con mucho cuidado, evitando corrientes turbulentas y el aireado de la
muestra). Con pequeños golpes sobre la jeringa desplazar todas las burbujas de
aire hacia la parte superior (aguja) y evacuar el aire.

1.3 Inocular el primer caldo de cultivo y agitar (tener precaución de no introducir

aire a través de la inoculación, ya que esto oxidaría el medio y no podríamos
apreciar el crecimiento de las BSR, es aconsejable realizar la inoculación en
forma lenta y con el caldo boca abajo suspendido sobre la aguja de la jeringa).

1.4 Descartar la jeringa utilizada para esta primera inoculación.

1.5 Con otra jeringa estéril extraer 1 ml del caldo cultivado anteriormente (caldo
Nº1)

1.6 Inocular el caldo de cultivo Nº2 y agitar.

1.7 Descartar la jeringa utilizada para esta segunda inoculación.

1.8 Con otra jeringa estéril extraer 1 ml del caldo cultivado anteriormente (caldo
Nº2)

1.9 Inocular el caldo de cultivo Nº3 y agitar.

1.10 Descartar la jeringa utilizada para esta tercera inoculación.

1.11 Repetir esta dilución de medios de cultivo hasta la inoculación del ultimo
caldo de cultivo.
2- INCUBACION

Los caldos de cultivo son incubados en estufa de cultivo. La diferencia de la

temperatura de incubación no debe variar de los 5 ºC respecto de la temperatura
del sistema que se está evaluando.
Experiencias anteriores indican que a una temperatura de incubación de 37-38
ºC arroja resultados legítimos y representativos para la evaluación de un sistema.
El tiempo de incubación es de 28 días, aunque dependiendo de los medios de
cultivo a utilizar dentro de los 10-14 días podemos obtener valores positivos que
se mantienen hasta el final del periodo de incubación.

Sin embargo, es recomendado completar la incubación de 28 días para ver si

hay caldos que den positivo de forma tardía.

3- Lectura de los caldos

Serán considerados positivos todos aquellos caldos que presenten una clara
formación del precipitado o floc negro.
Los caldos que dentro de las 2 horas de inoculación presentaran el
precipitado/floc negro no deben ser considerados positivos, puesto que ello se
debe a la presencia de sulfuros en la muestra.
Los caldos positivos se informaran de la siguiente forma:

UFC/ml de BSR: Unidad Formadora de Colonias de Bacterias Sulfato Reductora

por ml de muestra.

A modo de ejemplo, de acuerdo al numero de caldos que den positivo se

informara:
 INTERPRETACIÓN Y LECTURA CORRECTA DE CALDOS BSR

Introducción:
A diario se presentan problemas que hacen confundir la correcta lectura de los
caldos inoculados.
A continuación, realizaremos preguntas frecuentes y daremos su respuesta para
cada situación.

1-¿ Cuando se considera POSITIVO un caldo al realizar la lectura del

mismo?
Cuando en los caldos a leer se observe un precipitado/floc negro, ya sea
adherido a las paredes del frasco de vidrio o al clavo en el interior del caldo. Esto
esta dado por la formación de un biofilm. Esto es por la consecuencia de que las
bacterias BSR producen sulfuro de hidrógeno (S2H), reaccionando con el Fe
presente en el medio de cultivo, dando como resultado SFe que es el que
presenta el color negro.

2-¿ Cuando se considera NEGATIVO un caldo al realizar la lectura del

mismo?
Cuando los caldos inoculados no presenten un claro precipitado/floc
negro.Cuando se agita el caldo y el medio de cultivo liquido presenta algunas
partículas negras en suspensión que no tiñen el liquido y no precipitan.

3-¿Qué lectura se hace cuando los caldos de cultivo presentan turbidez?

Cuando se observa turbidez en el medio de cultivo, esta se debe a la presencia
de otras bacterias que no corresponden a las BSR, y que igualmente pueden
desarrollarse en este medio. Por lo tanto la lectura de BSR en el caldo se informar
NEGATIVA.

4-¿Si los caldos presentan una coloración amarilla, que lectura se debe
hacer?
La presencia del color amarillo en el medio de cultivo indica que durante la
inoculación de la muestra se a incorporado oxigeno y por ello se ha producido la
oxidación del medio, por cuanto no hay desarrollo de bacterias BSR.
Si luego del caldo oxidado (coloración amarilla) no hay caldos que den positivo
no se tendrá en cuenta la inoculación por ser dudosa.

5-¿Qué lectura se hace si el 1º o 2º caldo dan negativo y los sucesivos dan

positivo?
La lectura de los primeros caldos negativos seguidos de caldos positivos que un
claro precipitado/floc negro, puede ser debido a que hay un resto de
bactericida/biocida el cual no permite el desarrollo bacteriano.
Por cuanto se deberá tomar como lectura POSITIVO hasta el último caldo que
presente precipitado/floc negro o adherencia en las paredes del frasco o clavo.

6-¿Qué lectura se realiza si hay caldos negativos en medio de caldos

positivos?
En este caso se procede de acuerdo al punto anterior, por cuanto se deberá
tomar como lectura POSITIVO hasta el ultimo caldo que presente precipitado/floc
negro o adherencia en las paredes del frasco o clavo.

7-¿Qué lectura se hace si todos los caldos presentan turbidez amarilla (por
oxidación)?
La lectura es dudosa puesto que no se sabe si los caldos no presentan desarrollo
bacteriano o las bacterias no pudieron crecer debido a la oxidación del medio.
Por lo que se recomienda volver a realizar la inoculación con la precaución de
no ingresar oxigeno en el medio de cultivo liquido.

Ing. Willian Amaya Avila

Cip 107042