UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CURSO: MICROBIOLOGÍA GENERAL – LABORATORIO
PRÁCTICA 3

TÍTULO: “TINCIÓN DIFERENCIAL ÁCIDO - RESISTENTE”

Integrantes:

· 20 Bolimbo Orellana, Cristhian

· 20141343 Candiotti Gamero, Franco
· 20130085 Chávez Corcuera, Gonzalo
· 20141359 Lázaro, Luis
· 20141362 Munguia Dionisio, Juan Manuel

MESA N°: 3

GRUPO: Jueves, 11am – 1 pm

 I. INTRODUCCIÓN

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las

endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y
localización son importantes criterios de clasificación taxonómica.
Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies
son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología
alimentaria y médica adquiere gran interés. (Ramos, 2004 )

El presente informe se enfoca en las técnicas de tinción de endosporas. Los géneros

de bacterias productoras de esporas son conocidas, por tanto uno de los usos de estas
técnicas puede ser la determinación e identificación del microorganismo. La técnica más
usada es la de Schaeffer y Fulton la cual se basa en la gran resistencia de las
endosporas a la decoloración una vez han sido coloreadas. Además usaremos la técnica
de Dörner que también tiñe endosporas usando el calor como fijador del colorante; la
diferencia entre ambas técnicas es que una usa alcohol ácido como decolorante para
luego contrastar mientras que la de Dörner se basa en la insolubilidad de la nigrosina
en agua.

II. OBJETIVOS

- Observar la estructura bacteriana especial, como la endospora con tinciones

selectivas.
- Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e
identificación de las bacterias.
III. MARCO TEÓRICO

La mayoría de las bacterias se colorean por tinción simple o por tinción de Gram, pero
existen algunas especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia que son resistentes
a estas coloraciones y pueden teñirse calentándolos con carbolfucsina. El calentamiento
permite la entrada del colorante dentro de las células (Tortora 2007)

Una vez que las mismas han tomado la carbolfucsina, resisten la decoloración aun
aplicando una mezcla de ácido-alcohol como agente decolorante. Como consecuencia
de esta propiedad, estos organismos se clasifican como ácido-alcohol resistentes y se
visualizan de color rojo, en tanto que, si el colorante puede ser extraído por el
decolorante, los microorganismos se clasifican como acido-alcohol no resistentes y
utilizando esta técnica aparecerán de un color diferente debido a la contra coloración
con otro colorante. Esta diferencia característica entre las mycobacterias y los otros
microorganismos se debe al alto contenido lipídico de la pared celular de las primeras,
en la que el peptidoglucano está unido mediante enlaces covalentes a un polímero de
ácido micólico- galactosa- arabinosa (Tortora 2007).

M.tuberculosis y M. leprae representan bacterias que son patogénicas para los

humanos, esta técnica es de vital importancia para el diagnóstico y la identificación de
estos organismos.

Tinción de esporas

Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas

esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de
pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables
de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser
favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas (Rodríguez
2006).

La detección de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para

la célula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la
esporulación de las bacterias (Rodríguez 2006).

La presencia de esporas en el ámbito clínico nos dirige hacia los géneros Clostridium y
Bacillus.

Técnicas para tinción de esporas

A) TÉCNICA SCHAEFFER-FULTON

Para realizar este método necesitamos utilizar un colorante primario, un agente

decolorante y un contrastante:

COLORANTE PRIMARIO: CARBOL FUCSINA: La carbol fucsina es un colorante

fenólico que es soluble en la cera de las paredes de las micobacterias, por lo tanto,
puede penetrarlas y permanecer retenida en ellas. La penetración de este colorante es
intensificada mediante tratamiento con calor. Todas las células aparecerán rojas.

AGENTE DECOLORANTE: ACIDO-ALCOHOL (HCl 3%-Etanol 95%): Antes de la

decoloración el extendido debe enfriarse, esto permite que la cera solidifique. Una vez
aplicado el agente decolorante, las células ácido-alcohol resistentes resisten la
decoloración, debido a que el colorante primario es más soluble en la cera de la pared
que en el agente decolorante. Por lo tanto, el colorante primario será retenido y las
micobacterias permanecerán rojas.

Este no será el caso con los organismos ácido-alcohol no resistentes los cuales carecen
de la pared de cera. El colorante primario será fácilmente removido y las células
quedarán incoloras.

CONTRACOLORANTE: VERDE MALAQUITA: Este colorante es utilizado como el

reactivo final que colorea a las células incoloras. Las células ácido-alcohol resistentes,
debido a la composición de su pared no serán teñidas por este colorante, estas se verán
color fucsia ya que previamente fueron teñidas con el colorante primario.

Es por esto que la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde.

B) TÉCNICA DE DORNER

Esta es una técnica muy similar a la anterior y los principios teóricos son los mismos.

En este caso se utiliza carbol fucsina como colorante primario, agua como decolorante
y nigrosina como contra colorante.

Las esporas se verán de color rojo, el resto de la bacteria incolora, sobre un fondo negro.

Ambas técnicas emplean el fenol y alta temperatura como agentes coadyuvantes para
lograr la penetración de la fucsina en la estructura de la espora.
VI. MATERIALES Y MÉTODO

4.1 MATERIALES

A. Tinción de Dörner
 Cultivos de 48 horas de Bacillus sp
 Aceite de inmersión (cedro)
 Asa de Kölle
 Láminas porta objeto
 Soluciones colorantes (fucsina y nigrosina)
 Agua destilada

B. Tinción de Schaeffer y Fulton

 Cultivos de 48 horas de Bacillus sp
 Aceite de inmersión
 Asa de Kölle
 Láminas porta objeto
 Mechero de alcohol
 Pinzas
 Colorantes (fucsina y verde malaquita)
 Solución decolorante (alcohol ácido)

4.2 MÉTODOS

A. Tinción de Dörner
 Colocar 1 mL de agua destilada en un tubo de ensayo
 Añadir la muestra de la cepa de Bacillus sp y disolver
 Añadir el mismo volumen de fucsina (1 mL)
 Llevar a baño María por 30 minutos
 Separar un poco de muestra en una lámina porta objeto
 Agregar la misma cantidad de nigrosina y luego diseminar a lo largo
de la lámina
 Esperar a que se seque al aire
 Agregar una gota de aceite de inmersión
 Observa y dibujar los resultados

B. Tinción de Schaeffer y Fulton

 Fijar la muestra de Bacillus sp
 Agregar fucsina
 Calentar con el mechero de alcohol por 3 minutos
 Decolorar con alcohol ácido
 Enjuagar con agua destilada
 Agregar verde de malaquita durante 30 segundos
 Lavara con agua destilada
 Secar
 Agregar aceite de inmersión de cedro, observar y dibujar
V. RESULTADOS
VI. DISCUSIONES

Al empezar agregarle carbol fucsina, sabemos que éste es un colorante fenólico que
es soluble en la cera de las paredes de algunas bacterias, por lo tanto puede penetrarlas
y permanecer retenida en ellas. La penetración de este colorante es intensificada
mediante tratamiento con calor. (UNQ, 2008).

Las endosporas son estructuras que no se tiñen fácilmente, pero una vez teñidas son
muy resistentes a las decoloraciones. De esta manera, si cambiamos el ácido alcohol
por otro decolorante como la solución de alcohol-acetona, la endospora seguirá
resistiendo a la decoloración.
La larga exposición (10 min) a altas temperaturas (100 °C, agua en ebullición) de la
muestra en la primera etapa de la técnica sirve para la fijación de la safranina. El calor
ayuda al tinte a penetrar en las relativamente impermeables capas de la endospora
(Sumbali, 2009).
Durante el proceso exposición a altas temperaturas la endospora y la célula vegetativa
son teñidas por la safranina, pero luego la célula vegetativa es decolorada por la difusión
de las moléculas de safranina hacia las de nigrosina (Prakash, 2014), colorante negro
insoluble en agua, que no penetra la célula vegetativa.

VII. CONCLUSIONES

- Se pudo observar las endosporas de las bacterias con dos técnicas distintas,
una con más claridad que otra.
- La distinción de estas bacterias que presentan dichas estructuras nos ayuda a
reconocer que tipo de bacterias son y, así prevenir ciertas enfermedades
ocasionas por estas mismas.
VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas

bacterianas? A qué le atribuye la diferencia.

Cuando se utilizó el método de Dörner se obtuvieron mejores resultados ya que las

estructuras bacterianas, en este caso las endosporas, eran más visibles que cuando se
utilizó la técnica de tinción de Schaeffer y Fulton.
En el método de Dörner, el calor, debido al baño maría que se aplica a la suspensión
del organismo con carbolfucsina, permeabiliza la endospora permitiendo que la fucsina
la tiña su estructura.
Por otro lado, en la técnica de Schaeffer y Fulton, a pesar de que se aprecia el
comportamiento ácido-resistente de la endospora, una sobre exposición a alcohol ácido
durante la decoloración podría causar una decoloración total de modo que
las endospora no se distinguirán de la parte vegetativa.

2. ¿Qué defecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante

como el alcohol cetona?

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga que
les confiere resistencia la decoloración por ácidos como el alcohol-ácido, el cual se
aplica después de la tinción con colorantes básicos.
El uso de otros decolorantes como el alcohol cetona, debido a su naturaleza
química, podría efectivamente decolorar las estructuras teñidas, de modo tal que no se
notará una diferenciación entre endospora y parte vegetativa. Por otro lado otros
decolorantes, a diferencia del alcohol ácido no son tan veloces.

3. ¿Qué otro género de bacterias pueden formar endosporas?

 1 Acetonema
 5. Alkalibacillus
 6. Ammoniphilus
 7. Amphibacillus
 8. Aneurinibacillus
 9. Anoxybacillus
 10. Bacillus
 11. Brevibacillus
 12. Caldanaerobacter
 13. Caloramator
 14. Caminicella
 15. Cerasibacillus
 16. Clostridium
 17. Clostridiisalibacter
 18. Cohnella
 19. Dendrosporobacter
 20. Desulfotomaculum
 21. Desulfosporomusa
 22. Desulfosporosinus
 23. Desulfovirgula
 24. Desulfunispora
 25. Desulfurispora
 26. Filifactor
 27. Filobacillus
 28. Gelria
  29. Geobacillus
 30. Geosporobacter
 31. Gracilibacillus
 32. Heliobacterium
 33. Heliophilum
 34. Lentibacillus
 35. Mahella
 36. Moorella
 37. Oceanobacillus
 38. Ornithinibacillus
 39. Oxalophagus
 40. Oxobacter
 41. Paenibacillus
 42. Paraliobacillus
 43. Pelospora
 44. Pelotomaculum
 45. Piscibacillus
 46. Pontibacillus
 47. Propionispora
 48. Salinibacillus
 49. Salsuginibacillus
 50. Sporacetigenium
 51. Sporoanaerobacter
 52. Sporobacter
 53. Sporobacterium
 54. Sporohalobacter
 55. Sporolactobacillus
 56. Sporomusa
 57. Sporosarcina
 58. Sporotalea
 59. Sporotomaculum
 60. Syntrophospora
 61. Tenuibacillus
 62. Tepidibacter
 63. Terribacillus
 64. Thalassobacillus
 65. Thermoacetogenium
 66. Thermoactinomyces
 67. Thermoalkalibacillus
 68. Thermoanaerobacter
 69. Thermoanaeromonas
 70. Thermobacillus
 71. Thermovenabulum
 72. Tuberibacillus
 73. Virgibacillus
 74. Vulcanobacillus

4. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las usadas en

este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.

Las otras técnicas de tinción de esporas también utilizan el calor para que el tinte
penetre la espora.
La técnica de Moeller

Utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear la espora.
La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contra colorea con azul de metileno.
Se observan las endosporas de color rojo y el resto de la bacteria azul.

Ventajas:
Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol ácido puede alterar los resultados.

El método de Ziehl-Neelsen (Baar)

Se utiliza para determinación de la presencia de bacterias de los géneros

Mycobacterium y Nocardia de trascendencia clínica para el diagnóstico y estudio
enfermedades. Se basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una
mezcla ácido-alcohol, se debe a la alta concentración de lípidos de su pared (ácidos
micólicos).
La única variante con el método de Schaeffer y Fulton es el del contrastante (verde
malaquita es reemplazada por azul de metileno)

Ventajas: es un diagnóstico preciso para la presencia de ciertas bacterias.

Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol ácido puede alterar los resultados.
IX. BIBLIOGRAFÍA

 Prakash, B. Microbial Staining. IK International. New Delhi. 2014 pp 139-155.

 RAMOS, M. d. (2004). Microbiología General. México D.F.: Universidad
Autónoma Metropolitana.
 RODRÍGUEZ, E. (2006). Bacteriología General: principios y prácticas de
laboratorio. 1ra Edición. Editorial EUCR. Costa Rica
 Sumbali, G; Mehrota, R. 2009. Principles of Microbiology. 1° Edición. Nueva
Delhi. Tata McGraw Hill Education.
 TORTORA (2007). Introducción a la Microbiología. 9na Edición. Editorial Médica
Panamericana. Argentina
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES. 2008. Microbiología general.
Departamento de Ciencia y Tecnología. Argentina. Consultado el 24 de
setiembre del 2015. (En línea). Disponible en
https://microbiologiaunq.files.wordpress.com/.../trabajospracticos-2008