SISTEMA DE CULTIVO SIN CÁSCARA PARA EMBRIONES DE POLLO

USANDO PAPEL FILM Y PLÁSTICO.

El desarrollo de métodos de cultivo sin envoltura para embriones de aves con

alta eclosión sería útil para Generación eficiente de pollos transgénicos,
manipulación de embriones, ingeniería de tejidos y estudios medicina
regenerativa. Hasta la fecha, los estudios de métodos de cultivo para
embriones de aves incluyen el cultivo de embriones Cáscaras de huevo con
ventana estrecha, cáscaras de huevo sustitutivas y un recipiente artificial
usando una membrana permeable a los gases. Sin embargo, No hay informes
que alcancen una elevada eclosión de > 50% utilizando recipientes
completamente artificiales. Establecer una Método para cultivar embriones de
pollo con alta incubabilidad, se examinaron diversas condiciones de cultivo,
incluyendo Métodos para la suplementación del calcio y la aireación del
oxígeno. En los cultivos de embriones donde los embriones fueron trans-
Después de 55 - 56h de incubación, más del 90% de los embriones
sobrevivieron hasta el día 17 cuando Se utilizó una película de
polimetilpenteno como recipiente de cultivo con suplementos de lactato de
calcio y agua destilada. Los La aireación de oxígeno puro a los embriones
supervivientes a partir del día 17 produjo una incubabilidad del 57,1% (8 de
14). Así, nosotros lograron con éxito una incubabilidad elevada con este
método en el cultivo de embriones de pollo utilizando un recipiente artificial.

INTRODUCCIÓN

Un cultivo sin cáscara, donde se extrae un embrión de pollo Una cáscara de

huevo y cultivada en un ambiente artificial, es Técnica importante para la
generación de pollos transgénicos Que producen sustancias útiles en sus
huevos, así como Diversas manipulaciones embrionarias (Kamihira et al., 2005;
Kyogoku et al., 2008). Además, esta técnica podría Útil para la conservación de
las aves raras, si se puede aplicar Para ahorrar huevos dañados. Sin embargo,
el Cáscara de huevo para facilitar la introducción de genes y otras
manipulaciones Reduce significativamente la eclosión (Andacht et al., 2004). La
técnica de cultivo sin cáscara para embriones de pollo También desempeña un
papel importante en la educación de los Escolares en ciencias de la vida, a
través de la observación directa Del desarrollo embrionario. Perry (1988)
informó un método de cultivo para embriones de pollo Utilizando una cáscara
de huevo sustitutiva como recipiente de cultivo para el ex ovo Cultivo de un
óvulo fecundado de una sola célula tomado delOviducto materno. Este método
se compone de tres Sistemas: el sistema I para embriones de la fase de una
sola La etapa de blastodermo, el sistema II para los embriones después del
blastodermo Estadio hasta el día 3, y el sistema III para embriones de Día 3
hasta la eclosión. El embrión se cultivó en los tres Y transferidos de un buque a
otro. Un gran Se utilizó cáscara de huevo de pollo como recipiente de cultivo en
el sistema III. Sin embargo, la incubabilidad fue aproximadamente 7% con este
Método, que fue mejorado a aproximadamente el 50% por Naito Et al. (1990).
Algunos métodos de cultivo utilizando Se han descrito cáscaras de huevo para
codornices (Ono et al., 1994; Kamihira et al., 1998; Ono et al., 2005; Kato et al.,
2013). Kamihira et al. (1998) informaron un método de cultivo sin envoltura

Para los embriones de codornices que utilizan un recipiente artificial fabricado

de un gaspermeable Membrana de politetrafluoroetileno (PTFE). En

Su método, más del 43% de los embriones de codorniz Se suplementó el

lactato de calcio en el cultivo. Esta Sistema de Perry III y la cultura

Método también se aplicó a los embriones de pollo (Kamihira et al.,

2004). Diversas mejoras en el cultivo de embriones de pollo ha sido reportado.

Sin embargo, muchos de estos métodos La sustitución de las cáscaras de
huevo sustitutivas Diferentes especies de aves que ponen huevos
relativamente grandes, como Aigamo pato y pavo (Borwornpinyo et al., 2005).

Sin embargo, los métodos de cultivo que utilizan Desventajas como la

preparación de cáscaras de huevo, diferencias Entre lotes de cáscaras de
huevo, la incapacidad de reciclar el uso, Y la baja operatividad durante la
manipulación del embrión.

Fig 1. Procesamiento de la película de polimetilpenteno. Preparar una cultura Los lados

derecho e izquierdo de una película cuadrada de aproximadamente 30 cm Se mantuvieron y se
extendieron en la forma apropiada (A). Además, los lados Que se mantuvieron flojas se
mantuvieron y la película se estiró de la misma manera
(SEGUNDO). Se creó una forma ovalada para ser aproximadamente del mismo tamaño Como
un huevo. La película debe entonces ser aspirada usando un aspirador equipado Con una copa
de plástico, que tiene el mismo diámetro que el recipiente artificial. Esto también evitó arrugas
de la película cuando se instaló en el Recipiente de cultivo (C).

Para establecer un método de cultivo simple con una elevada eclosión,

Desarrollamos un recipiente artificial utilizando un Conveniente película de
plástico transparente en lugar de huevos sustitutivos, Y se examinaron
condiciones de cultivo como el calcio Y suplementos de agua y aireación de
oxígeno.
Materiales y métodos

Huevos de gallina

Todos los huevos fertilizados utilizados en este estudio fueron Dekalb

Los huevos de color marrón, que se obtuvieron de un supermercado

(Yamagishism Jikkenchi, Mie, Japón).

Buques de cultivo

Se utilizó una copa de plástico de plástico de 430 ml como vaina para El

recipiente de cultivo. Se realizó un agujero de 1-1,5 cm de diámetro El lado de
la copa aproximadamente a 2 cm del fondo, y El orificio se tapó con una
compresa de algodón como filtro. A 2 Mm de diámetro tubo de plástico (Atom
Multiuso Tube, Atom Médico, Tokio, Japón) se insertó a través del espacio

Entre el empaque y el orificio para proporcionar un oxígeno suministro. Una

solución acuosa (40 ml) de benzalconio al 0,01% Cloruro (OSUBAN - S, Nihon
Pharmaceutical, Tokyo, Japón; Diluido con agua destilada) a la taza.

Fig 2. Vasija de cultivo artificial utilizada para embriones de pollo Culturas. En esta
figura, el cloruro de benzalconio no fue Añadido (antes de la transferencia de
embriones; A). La cultura artificial Para los pollos (inmediatamente después de que el
embrión Transferidos; SEGUNDO). Barra, 1 cm.

Una película de polimetilpenteno (FOR-WRAP, Riken Technos, Tokio, Japón)

se formó en una forma cóncava, cuidadosamente Evitando las arrugas (Fig. 1)
e instaladas como una cultura artificial Recipiente en la vaina (Figuras 2A y 3).
Un plástico de poliestireno La tapa se colocó en la parte superior del recipiente
de cultivo.

Cultura de embriones

Los huevos de pollo fertilizados se preincubaron durante 48-50 h (Grupo A) o

55-56 h (Grupo B) a 38 ℃ y 60% de humedad En una incubadora (BITEC-300,
Shimadzu RIKA Co., Tokio, Japón). Para la preparación del cultivo de
embriones, 250-300 mg Lactato de calcio pentahidratado en polvo (Showa
Chemical Co., Tokio, Japón) a los recipientes de cultivo. Después, 2,5-3 ml de
agua destilada esterilizada (Otsuka Pharmaceutical Co., Tokio, Japón) se
añadió suavemente al Vasos de cultivo. Cada concha de huevo se limpió
usando etanol al 70% Agrietado sin usar un taladro, y el contenido de huevo
entero Se transfirieron al recipiente de cultivo (figura 2B). Si está roto Trozos de
cáscara de huevo dentro del recipiente de cultivo, Las piezas se retiraron
cuidadosamente con pinzas esterilizadas. Además, hicimos 10 orificios de
ventilación con un diámetro De 5-8 mm sobre la superficie superior del
polimetilpenteno Película, con la cual los embriones no entraron en contacto
directo. Los orificios se crearon fundiendo la película usando una varilla de
vidrio. El recipiente de cultivo se cubrió con un plástico de poliestireno Tapa
para que la humedad dentro del recipiente permanezca Aproximadamente el
100%. El recipiente de cultivo se mantuvo en 38 ℃ y 80% de humedad en una
incubadora. El recipiente de cultivo

Se colocó con un ángulo de aproximadamente 8º y se giró con 120º en el

sentido de las agujas del reloj, dos veces al día. A partir del día 17 del período
de cultivo hasta la eclosión, Se suministró oxígeno a un caudal de
aproximadamente 500 Ml / h a través del tubo de plástico instalado
previamente. Si el embrión no pudiera romper las células corioalantoicas

Membrana por sí misma en los días 19 ó 20 del período de cultivo,

Cuidadosamente una incisión de 5 mm en la membrana El pico sin hemorragia
grave en la membrana. Higo. 4 Muestra el horario para el cultivo de embriones
de pollo. Intacto Huevos fertilizados sin manipulación fueron incubados como
Controles (n = 10). Se incubaron a 38 ℃ y 80% De humedad en un incubador,
y se gira con 120 ° en el sentido de las agujas del reloj, Dos veces al día hasta
el día 18. Los pollos fueron dados a los nuevos dueños y criados para
Maduración como animales de compañía.

Fig 3. Los dibujos esquemáticos del recipiente de cultivo artificial

Cultivo de embriones de pollo.
 Fig 4. Horario de cultivo para embriones de pollo.

Análisis estadístico

La viabilidad de embriones cultivados durante la incubación Período hasta el

día 17 del cultivo fue determinado por De los embriones viables, donde la
viabilidad del 100% Definido como el número de embriones viables en el día
Inicio de la cultura ex ovo. La eclosión en el Presencia o ausencia de oxígeno
se determinó contando Embriones, donde el número de embriones en el día 17,
en la Comienzo de la aireación, se definió como 100%. Los datos fueron
Analizado utilizando la prueba de probabilidad exacta de Fisher. Un valor P de
<0,01 se consideró estadísticamente significativo.

Períodos de Preincubación

Para los embriones que se transfirieron al recipiente de cultivo Antes de 50 h

de incubación (Grupo A, Etapa 12-15, Hamburguesa Y Hamilton, 1951), ningún
embrión sobrevivió hasta el día 8. Cuando los embriones se transfirieron al
recipiente de cultivo 55-56 h de incubación (Grupo B, Etapa 16), la viabilidad en
el día 8 del período de cultivo fue significativamente mayor que el grupo A (P
<0,01, Tabla 1, Fig. 5), y la viabilidad en el día 17 de la Período de cultivo fue
del 92% (23 de 25).

Suministro de oxígeno

Durante el cultivo en el vaso artificial aproximadamente Día 17 del período de

cultivo (Etapa 43-44), el tono de color de Corriente sanguínea en las venas de
la membrana corioalantoide Cambiado a rojo oscuro, lo que sugiere una
deficiencia de oxígeno Suministro de los embriones. Por lo tanto, se aireó
oxígeno puro A aproximadamente 500 ml / h a través del tubo de plástico
insertado En el recipiente artificial. Como resultado, en el Grupo B, el 57,1% (8

De 14) de embriones suministrados con oxígeno desarrollado para escotilla.

Por el contrario, no se desarrollaron embriones para Condiciones en las que no
se suministró oxígeno (Tabla 1, Figura 6). Por lo tanto, la aireación con oxígeno
aumentó significativamente la eclosión (P & lt; 0,01).
Crecimiento de polluelos después de la eclosión

Los pollitos que nacieron en este método estaban sanos, y Fueron criados a la
maduración sexual. Después de que los pollos fueron Apareamiento, obtuvimos
descendencia sana.

Control de Huevo Intacto

La incubabilidad de los embriones de control intactos fue del 70% (7 De 10) y

no se observaron anormalidades. Dos huevos Estaban muertos con huevos
pipped, y otro huevo estaba muerto en Eclosión debido al daño en el saco
vitelino.

Cuadro 1. Resumen de los cultivos de

embriones de pollo Película de plástico como
recipientes de cultivo

Fig 5. Efecto del período de preincubación

antes de la transferencia Sobre la viabilidad de
los embriones hasta el día 17. Los huevos
fueron preincubados Durante 48 - 50 h
(círculos abiertos, Grupo A) o durante 55 - 56 h
(Círculos cerrados, grupo B). Una diferencia
significativa en la viabilidad En los días 8 y 17
entre los dos grupos se observó (P & lt; 0,01).

Fig. 6 Viabilidad e incubabilidad de embriones cultivados Con o sin aireación con

oxígeno puro a partir del día 17. Viabilidad
Durante el período de cultivo de los días 17-21 y
se contó el número de embriones incubados.
Durante este período, los embriones se
cultivaron con (cerrado Círculos) o sin (círculos
abiertos) aireación de oxígeno. Un significante
Diferencia en la eclosión en el día 21 entre Y sin
aireación de oxígeno (P <0,01).
Discusión

En el presente estudio, hemos desarrollado un shell-menos la cultura Para

embriones de pollo utilizando una película de plástico como vasos de cultivo, y
examinamos las condiciones Hatching mediante la comparación de factores
tales como la adición De lactato de calcio y la presencia o ausencia de un
oxígeno suministro. En lugar de una membrana de PTFE permeable a los
gases, Envolturas de alimentos usadas, que son baratas, fáciles de procesar y
Fácil de obtener como vasos de cultivo. Aunque hemos probado varias
Envolturas, incluyendo polietileno y cloruro de polivinilideno, Preferimos utilizar
una película de polimetilpenteno debido a su Alta permeabilidad al oxígeno (8,0
× 10 - 10 mol / m2 sPa; Riken Technos). Es importante eliminar las arrugas
cuando Produciendo un recipiente de cultivo porque la presencia de película
Arrugas conduce a tasas de supervivencia más bajas (datos no mostrados). En
nuestro estudio, los embriones se preincubaron dentro de la Cáscara de huevo
hasta el día 3 y la cáscara del huevo se agrietó Transferir los embriones al vaso
artificial, correspondiendo a El sistema de Perry III. El período de preincubación
hasta la La transferencia de embriones al recipiente de cultivo influyó Viabilidad
en el día 8 de cultivo así como la transferencia exitosa de embriones al
recipiente de cultivo. La transferencia de embriones a la Cultivo se consideró
óptimo el día 3 (Rowlett y Simkiss, 1987, Borwornpinyo et al., 2005). En El
presente estudio, diferentes períodos de preincubación de huevo Entre 48 h y
56 h mostraron efectos variables sobre la viabilidad. La viabilidad
significativamente más alta obtenida con 55-56 h de Preincubación (Etapa 16).
En nuestro experimento preliminar, el Membrana vitelina se dañaba a menudo
cuando el embrión Se transfirió al recipiente de cultivo después de 56 h (etapa
17).

Fig 7. Un polluelo recién nacido de un recipiente

artificial.

Después de 60 h, fue difícil transferir el embrión a la Recipiente de cultivo al

agrietar la cáscara del huevo debido al Daño a la membrana vitelina (datos no
mostrados). Un estudio previo de Kamihira et al. (1998) utilizando codornices
Mencionó que el lactato de calcio era altamente efectivo en Cultivos exitosos
de embriones aviares. En nuestro sistema de La adición de lactato de calcio fue
también efectiva para Desarrollo y la viabilidad de los embriones se convirtió en
Mayor cuando se añadieron 250-300 mg de lactato de calcio (datos no
mostrada). Así, la suplementación de calcio a los embriones es
Esencial para las culturas sin cáscara, porque el pollo normal Embriones dentro
de las cáscaras de los huevos se proporcionan la mayoría de calcio De la
cáscara del huevo durante el desarrollo embrionario a la escotilla (Rowlett y
Simkiss, 1987, Kamihira et al., 1998). Nosotros Creen que la cantidad de
lactato de calcio suministrada al Embriones en el cultivo era suficiente para el
requisito mínimo Para el desarrollo embrionario, aunque Son necesarios
estudios adicionales para comprender el estado embrionario Disponibilidad de
calcio.

Nos preocupa que la aireación del recipiente artificial Puede causar la pérdida
de humedad de los embriones por transpiración. Por consiguiente, primero se
añadieron 2,5-3 ml de solución destilada esterilizada Agua al recipiente de
cultivo. Además, cuando el lactato de calcio En suspensión en agua destilada
se añadió al recipiente, la viabilidad De embriones cultivados (datos no
mostrados), sugiriendo Que esto puede ser causado por un desequilibrio
electrolítico o Hipercalcemia. Por lo tanto, se agregó lactato de calcio en polvo
Al recipiente de cultivo primero, antes de añadir suavemente agua destilada
Porque esto podría facilitar la absorción más lenta de calcio Lactato por el
embrión

Buque artificial hecho de una "película adherida" eran hipóxicos y Hipocapnico

Kamihira et al. (1998) también señaló la Importancia del suministro de oxígeno
en la etapa posterior del embrión Cultura usando cáscara de huevo sustituta.
Por lo tanto, examinamos La aireación de oxígeno en la última mitad del
período de cultivo. La aireación de oxígeno durante la fase inicial del cultivo
puede Reducir la viabilidad debido al efecto tóxico del oxígeno. En el Presente
estudio, el color del torrente sanguíneo en el corioalantoico La membrana
parecía ser normal durante las etapas iniciales El período de cultivo. Por lo
tanto, para los embriones que sobrevivieron Hasta el día 17 (estadio 43-44), se
aireó oxígeno puro desde Día 17 para prevenir la deficiencia de oxígeno en las
etapas posteriores. Como un Resultado, el tono de color de la corriente
sanguínea se volvió normal y 8 14 embriones desarrollados para eclosionar, lo
que demuestra que Suministro de oxígeno en la etapa posterior es
extremadamente importante Durante el cultivo sin cáscara utilizando un
recipiente artificial. En los días 19-20 del período de cultivo (Etapa 45), el
Embriones comenzaron a rasgar las membranas corioalantoides y Sus
sistemas de respiración pulmonar fueron activados. Cuando Los embriones no
podían rasgar la membrana corioalantoidea, una Se realizó una incisión de 5
mm alrededor del pico para eclosión. Esto puede corresponder a la muerte en
huevos pipped, Que se produce a una velocidad constante cuando los huevos
son cultivados Sin agrietamiento y tratamiento de la carcasa. Los resultados
revelaron que el uso del recipiente de cultivo descrito En el presente estudio, se
logró la mayor eclosión Con 55-56 h de preincubación de huevo, la adición de
250-300 mg Lactato cálcico, se añadieron 2,5-3 ml de solución destilada
esterilizada Agua, aireación de oxígeno puro a aproximadamente 500 ml / h
Desde el día 17 de cultivo (Etapa 43-44). La eclosión de Embriones cultivados
en estas condiciones fue del 57,1% (8 14) al tomar el número de embriones
supervivientes al día 17 Como 100%. Borwornpinyo et al. (2005) informaron
que el embrión de pollo Método de cultivo utilizando cáscaras de pavo y Handi-
Wrap como Antes de la transición al Sistema III de Perry Exhibieron 81,1% de
eclosión cuando el número de sobrevivientes Embriones al día 3 se tomó como
100%. Aunque nuestra cultura Método no utiliza cáscaras de huevo
sustitutivas, una alta De más del 50%. Este método no Requieren operaciones
complicadas, materiales especiales o Técnicas. También elimina las
incertidumbres como la disponibilidad Calidad de las cáscaras de huevo, que
con frecuencia Causó problemas en métodos anteriores usando cáscaras de
huevo sustitutivas. Además, el uso de una película de plástico transparente
Permite no sólo una fácil observación de la morfología embrionaria Desde
todos los ángulos, sino también fácil acceso al embrión para Manipulación
mediante la retirada de la cubierta de plástico. En el presente, Se está
intentando seguir mejorando el método de cultivo Para aumentar la eclosión. Si
podemos obtener una incubabilidad estable, este método podría Facilitar la
generación de pollos transgénicos y otros Manipulaciones embrionarias, que
son necesarias para Estudios en medicina regenerativa. También podría
Cultivos, estudios con células madre embrionarias de aves y Producción en
masa de huevos de pollo como biorreactores vivos.

Descripción del proceso que se va a investigar.

Definición del problema.

Definición de la(s) variable(s) de respuesta

Definición de factores controlables

Definición de factores no controlables

Definición de factores de estudio

Características de unidades experimentales

Matriz de diseño

Metodología del experimento (Se debe explicar cómo será realizado el

experimento)

Presupuesto (detallar los diferentes rubros y valores en dólares en los

que incurrirá el proyecto)

Referencias bibliográficas en formato apa