Cromatografia Líquida de Alta

Resolución (HPLC)
A ¿Que es HPLC?
A Tipos de separaciones
A Columnas y Fases estacionarias
A Fases móviles
A Inyección en HPLC
A Detección en HPLC
A Variantes del HPLC tradicional
g
ACromatografía Iónica ((IC))
ACromatografía de Exclusión Molecular
 ¿Que es HPLC?
A High Performance Liquid Chromatography

A High Priced Liquid Chromatography

A HPLC es en realidad la automatización de la Cromatografía

Líquida tradicional bajo ciertas condiciones que ofrecen
separaciones más efectivas en tiempos de análisis menores.
menores

A Probablemente sea la técnica cromatográfica de análisis

cuantitativo
tit ti más
á utilizada
tili d hoy
h dí dado
día, d d lal gran variedad
i d d de
d
moléculas que pueden analizarse con ella.
Esquema
sque a de un
u HPLC
C
Inyector

Mezclador

Bombas

Columna

Detector

Deshecho
Fase móvil
 Esquema de un HPLC
Reservorio disolventes
F
Fase móvil
ó il

Desgasificador

Bombas

Muestreadorr Volumen inyección

Compartimento columna
Temperatura columna

Deector Longitud onda, ...

Separación
Inyector
La separación se basa en una
dif
diferente
t migración
i ió entre
t la
l
Mezclador
r
fase estacionaria y fase móvil

Bombas
Fase Móvil – arrastra la muestra
Fase estacionaria
a través de la fase- estacionaria
la fase
que permanece fija
fij en la
l
Columna columna, p.ej. C18, Silica

Detector

Deshecho
Fase móvil

HPLC
El Cromatograma
to – tiempo retención pico no retenido
tR- tiempo retención – determina identidad compuesto
tR

tR
mAU Area es proporcional a
la concentración analito.

to

Inyección tiempo
 Tipos de Separaciones por HPLC
A Fase Normal: Separación de analitos polares por partición
entre una fase estacionaria enlazada polar y una fase móvil
apolar.
A Fase Reversa: Separación de analitos de polaridad media/baja
mediante partición en una fase estacionaria no polar.
polar
A Adsorción: Es una forma de separación intermedia entre fase
normal y reversa. Separación de analitos de polaridad
moderada mediante adsorción en una fase estacionaria pura
(p.ej. Sílice o Alúmina).
A Cromatografía Iónica: Separación de iones orgánicos e
inorgánicos mediante partición entre fases estacionarias
enlazadas polares soportadas.
A Exclusión Molecular: Separación de moléculas más o menos
“grandes” basadas en la facilidad dedifusión de las mismas a
través de un entramado de túneles que forman la fase
estacionaria.
Esquema
q selección cromatografía
g HPLC(1)
( )
Esquema
q selección cromatografía
g HPLC(2)
( )
Esquema selección cromatografía HPLC(3)
 Esquema selección tipo HPLC

Tipo de compuestos Modo HPLC Fase Fase móvil

estacionaria
Neutros
Acidos débiles Fase reversa C18, C8, C4 Agua/modificadores
Bases débiles ciano, amino orgánicos

Iónicos, ácidos, bases Par iónico C-18, C-8 Agua/Orgánicos

Reactivo par iónico
Compuestos no Sílice, amino
Sílice amino,
solubles en agua Fase normal ciano, diol Orgánicos

Iónicos, inorgánicos Intercambio Resinas de

ió i
iónicos ió i
iónico i t
intercambio
bi B ff acuosos
Buffer
aniónico/catiónico
Comp alto peso Permeación geles
molecular Exclusión por Poliestireno acuoso
Polímeros tamaño Silice Permeación geles
orgánico
Columnas y Fases Estacionarias
A HPLC utiliza
tili fundamentalmente
f d t l t columnas
l empaquetadas
t d
A Actualmente disponibilidad de columnas microbore y
capilares.
A Fase estacionaria: partículas (1 a 20 µm diámetro)
A En Cromatografía de Adsorción, no existe una fase
estacionaria adicional aparte de las partículas (silice,
alúmina, Florisil...).
A En Cromatografía Partición, la fase estacionaria recubre
(a menudo mediante enlaces químicos) un soporte
sólido (sílice, alúmina, resinas de divinilbenceno...)
Esquema de una Columna HPLC
Columnas HPLC
INYECCIÓN

UJO
FLU
CROMATOGRAMA

señall

tiempo
 Partículas de Fase Estacionaria

SEM Soporte
S t Sílice
Síli SEM Soporte
S t Sílice
Síli recubierto
bi t C18
Recubrimiento Fase Estacionaria
I fl
Influencia
i tamaño
ñ partícula
í l y flujo
fl j fase
f móvil
ó il en la
l Altura
Al de
d Plato
Pl Teórico
T ó i (H)
Mecanismo de Interacción en HPLC
 Fases Estacionarias
A Polares (Fase Normal):
A Sílica, alúmina
A Grupos ciano, amino o diol enlazados a un soporte
A No Polares (Fase Reversa)
A Grupos C4 a C18 enlazados a un soporte
A Grupos fenilo, fluorofenilo...
A Mezclas de diferentes grupos funcionales (selectividades
específicas)
A Las p
partículas empaquetadas
p q en las columnas de HPLC
requieren::
A Fritados a ambos lados de la misma para mantenerlas
libres
b es de pa
partículas
cu as
A Filtrado de las muestras que prevenga su obturación
A Bombas de alta presión
A El uso de
d guardacolumnas
d l (es
( muy aconsejable)
j bl )
F t
Factores que influyen
i fl en la
l separación
ió
Parámetros que afectan a eficiencia:
• Flujo
• Longitud columna
• Diámetro partícula
• Distribución tamaño partícula
Parametros que afectan al factor retención:
• Tipo eluyente
• Composición eluyente
• Tipo fase estacionaria
• Naturaleza analito
Parametros que afectan a selectividad:
• Tipo fase estacionaria
• Naturaleza analito
• Aditivos eluyente (pH, ...)
• Temperatura
• Composición eluyente
Fase Reversa. Principios
A Interacciones no-polares (no especificas) del analito con
una superficie
fi i adsorbente
d b t hidrofóbica
hid fóbi (C18,
(C18 C8,
C8 Phenyl,
Ph l
C4)
A Las diferentes afinidades de adsorción p
provocan la
separación cromatográfica:
AAnalitos más polares se retienen menos
AA lit con grandes
AAnalitos d estructuras
t t hidrofóbicas
hid fóbi son
los que más se retienen
ANo se p produce separación
p entre isómeros
estructurales
1.68

400

350

300

250
Response

200

9.84
9.05
2.23

150

100
5.94

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Retention Time (min)
Optimización Separaciones por HPLC
A Selección de la columna adecuada para p
obtener separaciones
A Selección de la fase móvil
A Composición de la fase móvil
AComposición constante = isocrático
AC i ió variable
AComposición i bl = gradiente
di t
A Selección flujo de fase móvil (generalmente es
constante)
A Temparatura de columna
A Esta variable influye en el equilibrio de la
separación cromatográfica
 La fase móvil en HPLC...
HPLC
A Debe realizar lo siguiente:
A Solvatación de las moléculas de analito y el disolvente en la
que van disueltas
A Capaz de “transportar” al analito a lo largo de la columna

A Debe ser:
A Compatible
p con el equipo
q p de HPLC ((bombas,, conectores,,
detector, etc)
A Compatible con la fase estacionaria
A Disponibilidad
p del mismo y p
precio ((a veces se utilizan litros/día)
/ )
A Adecuada pureza
AHPLC, HPLC-gradiente, HPLC-MS...
A No demasiado compresible (causa problemas con bombas y
flujo)
ALibre de gases (puede causar problemas de
p
compresibilidad))
Esquema Bomba Alta Presión
Esquema Bomba Alta Presión
Propiedades disolventes HPLC
Optimization polaridad fase móvil…
25

20

15

10
90% ACN
5

0
0 1 2 3 4 5 6 7

18

16

14

80% ACN
12

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7

16

14

12

10
70% ACN
8

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

12

10
60% ACN
8

0
0 2 4 6 8 10 12
Elución isocrática vs gradiente
A El
Elución
ió isocrática:
i áti mantiene
ti constante
t t la
l composición
i ió de
d
la fase móvil
A Simplicidad: requiere una bomba de un solo canal y
no necesita cámara
á de mezcla
A Flexibilidad limitada
A Elución con gradiente: variación de la composición de la
fase móvil a lo largo del análisis
A Se necesita más de una bomba o una bomba
multicanal – Más caro
caro-
A Sistemas binarios, ternarios y cuaternarios
A La variación de la composición de fase móvil se
traduce en una modificación de la polaridad
APuede ser utilizada para eluir compuestos
previamente preconcentrados en la columna.
APermite análisis simultáneo de componentes de
muy diferente polaridad
ALa columna debe ser equilibrada
q con las
condiciones iniciales antes de cada análisis
(requiere un tiempo extra)
 Elución Isocrática

Elución isocrática de 6 esteroides con RP (254 nm)

(1) Prednisona, (2) cortisona, (3) hidrocortisona, (4) dexametasona, (5) corticosterona, (6)cortoexolona)
Elución
uc ó GGradiente
ad e e
Elución Gradiente

Análisis aminoácidos-OPA
I
Inyección
ió en HPLC
A Generalmente 5 a 1000 µL, directamente en la
columna
A Inyector manual: Válvulas 6 puertos
A Posibilidad de conexión on-line a sistemas de
preconcentración por SPE (ASPEC, Prospekt..)
A Termostatización de muestras
y
A Inyector automático: RSD volumen inyección
y <1%
A Full-loop
A Parcial loop
A Sandwich
S d i h
 Posición de carga
de muestra

Posición de inyeccion
y
de muestra
Detectores de HPLC
AUniversales
AResponden a todos los analitos
AEspecíficos
AResponden a determinadas propiedades
físico-químicas de los analitos
ANo destructivo
ACasi todos (UV-Vis,
(UV Vis FL,
FL IR)
ADestructivos
AELSD y MS.
Propiedades detectores HPLC
Detector Absorbancia UV-Vis
UV Vis
A Detectores UV-Vis
UV Vis de simple haz equipados con
celdas de bajo volumen muerto
A No destructivo y no universal
A No todos los compuestos absorben radiación UV-Vis
A Sensibilidad limitada en muchos casos (10 pg en
l mejores
los j casos))
A Rango lineal amplio (4 órdenes magnitud)
A Pueden
P d ttrabajar
b j a diferentes
dif t λ a lo
l largo
l del
d l
cromatograma
Esquema Detector UV-Vis
UV Vis

Columna

Deshecho
D t t UV-Vis:
Detector UV Vi λ disolventes
di l t
D t t Di
Detector Diodo
d Array
A (DAD)
A No destructivo,
destructivo no universal
A Gran versatilidad
A Identificación por Tr y confirmación por espectro
UV-Vis (determinación pureza pico)
A DAD permite realización de barridos de longitud
de onda (en cada punto del cromatograma
tenemos un espectro UV-Vis)
A Más caro que detector UV-Vis
UV Vis
 DAD

E
Espectros
t de
d absorción
b ió dde mezcla
l de
d 3 esteroides
t id
Esquema detector DAD
D t t Fluorescencia
Detector Fl i
A No destructivo,
destructivo no universal
A Responde a moléculas que presenten fluorescencia.
Muyy selectivo
A Identificación por Tr y en determinados equipos por
espectros de fluorescencia
A Gran sensibilidad (10 fg) y rango lineal elevado (5
órdenes magnitud)
A Detección de moléculas no fluoróforas mediante
reacciones pre o post-columna (DNPH-aldehidos,
OPA-aminas primarias...)
Aplicación FL: Análisis tocoferoles en pienso

α-Tocoferol 1.2 ppm

λexc: 292 nm
λem: 320 nm
MeOH/H2O 96/4
1.4 ml/min
C18 4.6x150 mm
Extracto pienso dil 1/15
 D t t IIndice
Detector di Refracción
R f ió
A No destructivo y universal
A Responde a los analitos al variar el IR de la fase móvil
A Requiere un flujo separado de fase móvil
móvil-referencia
referencia
A Requiere trabajar en modo isocrático
A Muyy sensible a la temperatura,
p ,ggeneralmente se
calefacta
A Sensible a cambios de Tª de +/- 0.01 ºC
A Baja
B j sensibilidad
ibilid d (1 ng)) y rango lineal
li l de
d 3 órdenes
ód
magnitud
A Es un detector con pocas aplicaciones
A Azúcares, triglicéridos, polialcoholes
Esquema detector IR
Aplicación IR: análisis azúcares

Patrón azúcares 1%
Muestra pastelería Columna amino 4.6x250 mm
1.4 ml/min ACN/H2O 80/20
 Detector ELSD (Evaporative Light
Scattering Detector)
A Universal y destructivo
A Especialmente
p útil p
para detección de moléculas de
elevado peso molecular → Rango lineal amplio
A Para moléculas pequeñas → Rango lineal pequeño
A Analitos son desolvatados en el detector (requiere
de un flujo de gas: Ar)
A Se mide la reducción de la intensidad de luz debida
al scattering producido por los analitos
A Cua
Cuantoo mayor
ayo es laa molécula
o écu a y su co
concentración,
ce ac ó ,
mayor es el scattering producido
Esquema
sque a de
detector
ec o ELSD
S
 D t t d
Detector de Conductividad
C d ti id d
A No
N destructivo
d t ti y selectivo
l ti (especies
( i iónicas)
ió i )
A Muy robusto
A La respuesta se basa en la conductividad que se crea
al pasar un analito con carga por una celda
electrolítica. Muy sencillos.
A Requiere que la fase móvil no contenga especies
cargadas (provocan un elevado ruido de fondo:
menor sensibilidad). Módulos supresión iónica
A Elevada sensibilidad (10 pg)
A Se aplica en análisis de cationes y aniones
inorgánicos y orgánicos (p. ej. ácidos orgánicos,
especies amonio cuaternario, glifosato...)
Aplicación IC: Análisis aniones en agua

Fase móvil: Buffer carbonato/bicarbonato Na, 0.7 ml/min

Detección fluoruros, cloruros, nitratos, nitritos, sulfatos, fosfatos,
bromatos..
bromatos
En una sola inyección cumplimiento LC RD 140 aguas para los aniones
Aplicación IC: Análisis aniones en agua
Aplicación
i ió IC: Análisis
á i i cationes
i en agua
 Cromatografía Exclusión
A Separa las moléculas por su tamaño (peso
molecular/radio
l l / di Stokes)
St k )
A Cromatografía en baja-media presión
A Se usa fundamentalmente en preparativa-clean-up
preparativa clean up
(p.ej. eliminación de grasa)
A Fase estacionaria: polímeros entrecruzados (p.ej.
estireno/DVB) INYECCIÓN

CROMATOGRAMA
 Cromatografía Intercambio Iónico
A Separa especies cargadas (iones)-atracciones
(iones) atracciones
electrostáticas
A Intercambio catiónico → pH bajos
A Intercambio aniónico → pH altos
A Resinas de ppoliestireno, intercambiadores iónicos de
celulosa, sílice porosa...
A Usada en análisis de iones, preconcentración traza
iones...
iones