Patogénesis Microbiana 105 (2017) 153 mi 165

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Patogénesis microbiana

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La aparición de resistencia a múltiples drogas entre las bacterias del suelo que exponen a los insecticidas

Kirubakaran Rangasamy un , Murugan Athiappan un , * , Natarajan Devarajan segundo , Javid A. Parray do

un Departamento de Microbiología de la Universidad de Periyar, Salem, Tamil Nadu, India

segundo Departamento de Biotecnología de la Universidad de Periyar, Salem, Tamil Nadu, India

do Centro de Investigación para el Desarrollo, Universidad de Cachemira, J & K, India

información del artículo abstracto

Articulo de historia: Impactos de la exposición a los pesticidas en el microbiana del suelo Florida Ora y resistencia cruzada a los antibióticos no han sido bien
Recibido 31 de enero de 2.017 documentados. Desarrollo de resistencia a los antibióticos es un problema común entre las bacterias del suelo que se está exponiendo a los
Recibido en forma 3 revisión febrero
plaguicidas de forma continua a una concentración sub-letal. El presente estudio se centró para evaluar la correlación entre la exposición a los
de 2.017
pesticidas y la evolución de la resistencia a múltiples fármacos entre los aislados recogidos de suciedad aplicada con insecticidas. Veinte fi ve
Aceptada 7 de febrero de 2017 Disponible en Internet el
insecticida (monocrotofos) bacterias degradantes fueron aislados de suelo agrícola contaminada. Los aislados bacterianos Bacilo sps,
10 de febrero de 2017

Bacillus cereus, Bacillus fi UDA y bacilo turingiensico se encontró que eran resistentes contra los antibióticos cloranfenicol, monocrotofos,
palabras clave:
ampicilina, cefotaxima, estreptomicina y tetraciclina usado. Participación de plásmido en drogas, así como resistentes a los insecticidas fue con fi
Las bacterias del suelo

insecticidas
rma través de plásmido de curado entre las cepas bacterianas seleccionadas. Bacilo Sps (MK-07), Bacillus cereus ( MK-11), Bacilo fi UDA ( MK-13)

Aparición de resistencia a múltiples fármacos resistencia y Bacilo turingiensico ( MK-24) perdió su resistente contra los insecticidas y antibióticos una vez después de la eliminación del plásmido
cruzada mediante la exposición a 2% de sulfato dodecil de sodio. El plásmido se transforma de nuevo a las bacterias que producen derivados similares
cuando se cultivan en medio de sal mínima (pH 7,0) suplementado con 0,4% de insecticida. modelado por homología se utiliza para demostrar
que hidrolasa organofosforados y capaz de metabolizar todos los antibióticos mostró una interacción positiva con alta puntuación de
acoplamiento. El presente estudio reveló que la persistencia de los insecticidas en el suelo agrícola puede conducir a aumentar el desarrollo de
resistencia a múltiples fármacos entre las bacterias del suelo.

© 2017 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción
El uso continuo de plaguicidas ha sistemas de agua del suelo y subterráneas muy
Estos son lo suficientemente tóxico para matar los organismos objetivo, pero al mismo tiempo
afectan a los organismos no objetivo [82] . Por desgracia, los ecosistemas acuáticos y terrestres están
contaminados con pesticidas debido severamente para lixiviar el formulario de la agricultura fi
[59] . contaminación de plaguicidas resultantes de la introducción directa o indirecta puede causar
cambios en todos los niveles de organización biológica [38] . Diferentes pesticidas como el glifosato,
clorpirifós, paratión, metil paratión, diazinon, cumafos, monocrotofos, fenamifos y forato se están
utilizando en la India desde 1952 [62] .
Se espera que los pesticidas en el Florida influir en la vía metabólica de
* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: amuruganpu@gmail.com (M. Athiappan).
indígena Florida Ora y las poblaciones que son capaces de metabolizar estas sustancias químicas.
Por lo tanto, los genes metabólicos evolucionan de manera capaz de metabolizar los plaguicidas y
contaminada. conseguir enriquecido debido a la persistencia de los plaguicidas [18,39] . Tal alteración de las
comunidades nativas finalmente conduce a alterar el ecosistema del suelo y la pérdida de fertilidad
del suelo
campos [66,15] .
Diferentes microorganismos han sido conocidos para transformar plaguicidas para sus
necesidades de energía. Las bacterias del suelo como Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter,
Pseudomonas mendocina, Bacillus megaterium, Arthrobacter atrocyaneus, Pseudomonas aeruginosa
F10B y ichiganense Clavibacterm SBL11 son comunes entre los suelos contaminados con
monocrotofos [10,53,54] . Los microorganismos del suelo que se están continuamente expuestos a
los pesticidas desarrollan resistencia al fármaco lentamente. Los pesticidas pueden inducir una
resistencia cruzada cuando no destinados exposición. relación común entre la entrada y la expansión
de pesticidas resistencia sigue siendo materia de debate. El desarrollo de antibióticos y la resistencia
a los pesticidas a menudo se presenta como ejemplo una moderna de la evolución por mutaciones y
como una clara evidencia de

http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2017.02.011
0882-4010 / © 2017 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
154 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165
darvinismo [5] . Otro problema creado por el uso excesivo de antibióticos en la acuicultura es la
presencia de antibióticos residuales en los productos acuáticos comercializados.
Desarrollo de resistencia a los antibióticos considerado como riesgos más graves para la salud
humana. Se ha observado que las múltiples resistencias a antibióticos se incrementaron por la
exposición de pesticidas [35,53,54,64] . Los plásmidos recuperados a partir de diferentes aislados
bacterianos de muestras clínicas encontrado que tienen fenotipos resistentes a una variedad de
antibióticos [55] . Por lo tanto, el uso indiscriminado de la contaminación pesticidas ha encontrado para
crear una resistencia a múltiples fármacos entre la población bacteriana filtrada. Las bacterias y los
insectos adquieren resistencia, ya sea a través de la selección natural a través de una única
mutación. En muchos casos, el organismo pasa a más de producir una enzima que descompone los
plaguicidas y otros derivados. El presente estudio se ha enfocado al estudio de la evolución de
bacterias resistentes a múltiples fármacos aislados de tierras de cultivo contaminadas.
2. Materiales y métodos
2.1. materiales
Comercialmente disponible de grado monocrotofos (36% de pureza) se adquirió de comerciante
de pesticidas local desde Namakkal, Tamil Nadu, India. antibióticos estándar como ampicilina (Amp 10),
Estreptomicina (HLS 100), Neomicina (N 30), Cephatoxime (Ce 30), Oxacilina (Ox), Sulfadiazina (Sz
100),
(T 30), Ni Florida oxaci (Nx 10), Cefozolin (CZ 30) y cloranfenicol (C 30) se obtuvieron de los Laboratorios Hola
Medios Pvt. Ltd, Mumbai.
2.2. Recogida de muestras y estudios de enriquecimiento
Hay tres tipos de muestras de suelos agrícolas (control, más de fi cinco años y, más de diez
años) se utilizaron en este estudio para el aislamiento de microorganismos de plaguicidas
degradantes. Las muestras de suelo se recogieron a partir de 5 cm de capa superior a partir de
diferentes plaguicidas contaminados sitios agrícolas de Salem y el distrito de Namakkal (11,7794
78,2034 N E y 11,47 N 78,17 E), Tamil Nadu, India. Las muestras recogidas se almacenaron a 4 C
hasta el análisis adicional.
2.3. Aislamiento de monocrotofos bacterias degradantes por cultivo de enriquecimiento
medio mínimo que contenía (por litro) 8,8 g de Na 2 HPO 4 $ 2H2O,
3,0 g de KH 2 correos 4, 1,0 g de NH 4 Cl, 0,5 g de NaCl, 1,0 ml de 1 M MgSO 4 durante 30 min a 100 V (unidad de electroforesis Tarson). El tamaño de los fragmentos se
y 2,5 ml de una solución de elementos traza (por litro) 23 mg de MnCl 2$ 2H 2 O, 30 mg de MnCl 4 $
2 O, 31 mg de H 3 BO 3, 36 mg de CoCl 2 $ 6H 2 O, 10 mg de CuCl 2 $ 2H 2 O, 20 mg de NiCl 2 $ 6H 2 O, 30 mg
de Na 2 Mugir 4 $ 2H 2 O y 50 mg de ZnCl 2 ( pH 7,0). Alrededor de 50 ml de MSM se preparó
suplementando con 0,1% de insecticida y se sembró con 1 g de muestra de suelo y se incubaron
37 C durante 48 h. Después de la incubación, los cultivos se agitaron vigorosamente con incubadora
con agitador durante 1 h para dispensar las bacterias de las partículas del suelo. Pesticidas degradar
las poblaciones bacterianas se enriquecieron durante otras 48 h con 0,4% de insecticida.
2.3.1. Enumeración de bacterias de plaguicidas degradar
0,5 g de suelo samplewas tomada en cónica Florida pedir que contiene 50 ml de agua destilada
estéril y se mezcla a fondo por agitación a 150 rpm durante 1 h. La suspensión se diluyó en serie
hasta 10 2 a 10 8
dilución. Una cantidad de 0,1 ml de cada dilución se extendió sobre agar sal mínimo suplementado
con placas monocrotofos 0,4% por triplicado y se incubaron en condiciones aerobias a 37ºC durante
48 h y colonias discretas fueron recogidas para el análisis experimental [57] . Las colonias resultantes
fueron repetidamente sub cultivaron en el mismo medio (MSM con 0,4% de monocrotofos) para
conformar
sus monocrotofos la utilización de la capacidad. Todas las colonias se transfirieron a medio estéril
fresco para obtener un cultivo puro. Se seleccionaron las cepas que poseían la más alta capacidad
de degradación para una mayor investigación experimental.
2.3.2. prueba de tolerancia y análisis de datos Los insecticidas
tolerancia bacteriana a diversas concentraciones de los pesticidas se realizó en caldo de sal
mínimo. 5 ml de caldo se preparó en agua destilada esterilizada para alcanzar concentraciones que
van desde
se tomaron 0,1% a 1,0% de insecticidas. El crecimiento bacteriano se midió a través de los rayos UV
Spectrophometry a 600 nm para detectar el crecimiento bacteriano. Los valores anteriores son la
media de la 10 réplica y las desviaciones estándar de acuerdo con el procedimiento descrito por Ref. [26]
.
2.3.3. resistencia a los antibacterianos
Aislamientos (MK-01 TomK-25) se ensayaron para determinar su susceptibilidad para diferentes
antibióticos por el método de difusión en disco en agar Mueller Hinton (MHA) placas [4,16,49,51,50] .
Las placas se incubaron a 37 se observaron C durante 24 h y por su zona de inhibición.
2.4. La degradación de insecticida
Las muestras bacterianas inoculadas con Erlenmeyer pre-esterilizado
Tetraciclina
Florida pide sal containingMinimal caldo supplementedwith insecticida
0,4% se incubaron a 37 C durante 48 h. muestras de células libre de caldo se tomaron
periódicamente y se ensayaron para el análisis insecticida residual usando GC-MS mediante la
extracción de los derivados utilizando dos veces acetato de etilo y se evaporaron en condiciones de
vacío hasta sequedad [28] . Se usó Agilent Cromatógrafo de gases (Modelo 7820A Series EE.UU.)
equipado con un detector de ionización de llama para el análisis de la degradación de insecticida.
2.5. identi fi cación de aislados bacterianos utilizando 16S rRNA secuenciación de genes
DNAwas bacterianas aisladas siguiendo protocolos estándar [63]
ampli fi ed usando 16S rRNA cebadores universales: 27f (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492r
(TACGGYTACCTTGTTACGACTT). Las mezclas de PCR (50 metro l) contenía 10 metro M de cada
cebador, PCR Invitrogen Master Mix (tampón PCR, 5 U de Taq polimerasa, BSA 10 metro M y 2 metrol
de ADN). Las condiciones de termociclado incluyeron una etapa de desnaturalización a 94 C durante
3 min, 34 ampli fi ciclos de cationes de 94 C durante 1 min, 55 C durante 30 s y 72ºC durante 1 min y fi polimerización
nal para 8min con Eppendorf termociclador (Eppendorf AG 22331). La electroforesis se continuó
determinó
MARIDOpor comparación con 1 marcador kb (Fermentas) 1500 pb. Los productos de PCR se visualizaron en
a
1,0% de gel de agarosa con la documentación de gel (Mediccare H6Z081). el Puri fi productos ed PCR
fueron secuenciados en Euro fi ns Pvt Ltd, Bangalore, India. Las secuencias de nucleótidos obtenidas
se analizaron utilizando BLAST-n (Centro Nacional de Información de Biotecnología Bases de datos).
Un árbol filogenético fue construido con el MEGA explorador 7.0 de alineación (Molecular
Evolutionary filogenético Análisis árbol) basado en secuencias completas o casi completas de 16S
ADNr alineadas [1,34] .
2.6. Bacterial plásmido pro fi análisis le
Todos los aislados se utilizaron para el enriquecimiento de ADN plasmídico mediante el uso de
(MSM) suplementado con 0,4% de monocrotofos durante 48 h. El ADN plásmido se aisló usando
métodos estándar de procedimiento bacterianas [9] . Después del aislamiento del ADN plásmido fue
con fi rma en la electroforesis en gel horizontal (aparato electroforético Tarson) usando 0,8% de
agarosa.
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2.6.1. oph parcial y mdr ampli gen fi catión
ADN plásmido bacteriano se aisló siguiendo protocolos estándar métodos procedimiento
bacterianas [9] secuencia génica era recuperar de NCBI (AY043245.2 y GU591496.1) basándose en
la especificidad del gen secuencia fi cebadores C fue diseño de imprimación neto (Premier Biosoft):
organofosforados
hidrolasa MK: oph-FP: ATCGGCA-
CAGGCGATCGG, MK: oph-RP: CATGACGCCCGCAAGGTCGG y resistentes a múltiples fármacos
MK gen: mdr-FP: AAAACAAAGTATGGTAAAATACAGGAA, MK: mdr-RP:
ATAATTACCATATAATTGACCACAAGC. Las mezclas de PCR (50 metro l) contenía 10 metro M de
cada cebador, PCR Invitrogen Master Mix (tampón PCR, 5 U de Taq polimerasa, BSA 10 metro M y
2 metro l de ADN). Las condiciones de termociclado incluyeron una etapa de desnaturalización a 94 C
durante 3 min, 34 ampli fi ciclos de cationes de 94 C durante 1 min, 54 C durante 30 s y 72 C durante
1 min y fi polimerización final durante 8 min con Eppendorf termociclador (Eppendorf AG 22331). La
electroforesis se continuó durante 30 min a 100 V (unidad de electroforesis Tarson). El tamaño de los
fragmentos se determinó por comparación con 1 marcador kb (NEB) 1400 pb. Los productos de PCR
se visualizaron en gel de agarosa al 1,0% con la documentación de gel (Mediccare H6Z081). el Puri fi producpteoqsueña moléculas de ligando y una molécula de receptor más grande. estructuras Obtenido fueron
ed PCR fueron secuenciados en Euro fi ns Pvt Ltd, Bangalore, India. Las secuencias de nucleótidos
obtenidas se analizaron utilizando BLAST-n (Centro Nacional de Información de Biotecnología Bases
de datos).
2.7. resistencia cruzada
El plásmido a partir de bacterias insecticidas degradar fue curado por los standardmethods [23] .
Plasmidwas curados fromMK-07, MK-11, MK13 y MK-24 mediante la inoculación del cultivo con 2%
de agentes de curado (SDS). Además, estas cepas de plásmidos curado se ensayaron para
determinar su capacidad para degradar insecticidas. Los cultivos se incubaron a continuación a 37 C
en un agitador orbital a 150 rpm durante 48 h. Después de la incubación, se cambió el cultivo de
caldo. El cultivo en placa de intercambio proyectó por su sensibilidad hacia los antibióticos estándar
tales asAmpicillin, (Amp 10), Estreptomicina (HLS 100), Neomicina (N 30), Cephatoxime (Ce 30), Oxacilina (Ox 1), continuamente expuestos a los pesticidas. la teoría de la evolución darwiniana afirma que el
Sulfadiazina (SZ 100), Tetraciclina (T 30),
Ni Florida oxaci (Nx 10), Cefozolin (CZ 30) y cloranfenicol (C 30). Los discos de antibióticos estándar se
colocaron sobre la superficie del agar agar andMSM contenía placas de 0,4% de insecticida
(monocrotofos) con bacterias curados y no curados eran simples rayada. Las placas se incubaron a
37 C durante 24 h y se observó para el crecimiento bacteriano. Las muestras bacterianas no curadas
mostraron crecimiento en agar normal de MSM (0,4% y diferentes concentraciones de disco
antibiótico) pero las cepas bacterianas curados fracasado para crecer en agar MSM suplementado
con insecticida y antibióticos.
2.8. análisis estadístico
Los insecticidas concentraciones inhibitorias mínimas se llevaron a cabo por duplicado. Un
modelo de ANOVA de una sola vía [sesenta y cinco] se utilizó para determinar la significación
estadística fi cance de la biorremediación por los aislados en diferentes condiciones de entorno.
2.9. Docking análisis para comprender hidrolasa organofosforado proporciona resistencia a
múltiples fármacos
2.9.1. La recuperación de la estructura de proteínas
La estructura cristalina de hidrolasa de organofósforo de
Geobacillus ( AP ID: 3F4C) fue recuperado de Protein Data Bank (PDB) ( http://www.rcsb.org/pdb ).
2.9.2. Recuperación de ligandos
Estructura molecular de monocrotofos, estreptomicina, ampicilina, cefotaxima, cloranfenicol y
tetraciclina ( Tabla S4 ) Se realizaron búsquedas en la base de datos contra PubChem ( http:
//www.ncbi.nlm.nih.
155
gov / pccompound ) Y estas estructuras 2D se convierten en estructuras 3D. Las estructuras 3D
obtenidos se reducen al mínimo para detectar los sitios activos. Implementación de algoritmos
evolutivos centra en simulaciones de acoplamiento molecular. Docking estaba realizando presentó
con todos los potenciales sitios activos detectados en enzima hidrolasa organofosforado. Durante el
acoplamiento, en fi primero se prepararon las moléculas y bonos, órdenes de enlace, hidrógenos
explícitas, cargos y
Florida torsiones flexibles fueron asignados con tanto la proteína y los ligandos. El modelo fue
calibrado usando un conjunto de datos de estructuralmente diversos complejos de la base de datos
PDB se unen con conocido AF de unión
fi nidades expresado en kJ / mol [72] .
2.9.3. Las proteínas y ligandos de los estudios de inhibición
Interacción análisis se realizó usando el paquete de software de acoplamiento ( http://www.schrodinger.com/
). búsquedas de acoplamiento para las interacciones favorables entre uno o más típicamente
sometidas a eliminación de agua hasta 5 distancias A, la asignación de átomo de par de electrones
solitario utilizando el asistente preparación de proteína. La rejilla receptor se creó y generó para
especificar el bolsillo de unión en el que el ligando se une con el panel de receptor de generación de
rejilla. acoplamiento molecular de la proteína preparada y el ligando se lleva a cabo utilizando de
acoplamiento [43] .
3. Resultados y discusión
3.1. Aislamiento de monocrotofos bacterias degradantes
Veinte fi cinco diferentes microorganismos se aislaron de los plaguicidas aplicados suelo y se
encontraron para degradar el insecticida. Las cepas como MK-07, MK-11, MK-13 y MK-24 se
eligieron para estudios adicionales en base a las propiedades resistentes a múltiples fármacos. Se
supo que el desarrollo de resistente a los medicamentos es común entre las bacterias del suelo
desarrollo de los antibióticos y resistentes a los pesticidas es una evidencia de moléculas para el
hombre teoría de la evolución [5] . Persistencia de pesticidas entre las bacterias del suelo es un
proceso de evolución por una selección natural, donde una contaminación de pesticidas sensibles se
hizo resistente [17] . poblaciones resistencia a los insecticidas han aumentado de 5,0
10 2 a 7,8 10 3 ( CFU / g) entre el suelo continuamente
expuestos a pesticidas durante un período de más de diez años ( Tabla S1 ).
3.2. tolerancia Insecticida de bacterias
medio de sal mínimo que contenía diferentes concentraciones de pesticidas se utilizó para
comprobar su resistencia a pesticidas [8,42,80] . Las bacterias desarrollan resistencia como un
fenómeno de la selección natural
[24] . Con el fin de evaluar la resistencia bacteriana 0,1 mi se utilizó 1,0% de insecticida
(monocrotofos). El crecimiento máximo 0,55 ± 0,02,
0.57 ± 0,02, 0,56 ± 0,02 y 0,55 ± 0.03 ( Tabla S2 ) Se observaron en
0,4% de pesticidas con MK-07, MK-11, MK-13 y MK-24 cepas, respectivamente, cuando se midió
espectrofotométricamente utilizando 620 nm.
3.3. Resistencia antibiótica
De los 25 aislamientos, 4 cepas como MK-07, MK-11, MK-13, MK-24 se encontró que eran
altamente resistencia a 5 diferentes antibióticos como la ampicilina (Amp 10), Estreptomicina (HLS 100), Cephatoxim
(Ce 30),
Tetraciclina (T 30) y cloranfenicol (DO 30) respectivamente
( Tabla S3 ; Figura 1 ). Mientras MK-02 encuentra para ser sensible a todos los fármacos utilizados en
el experimento. Sin embargo, las cepas como MK-01, MK
03, MK-05, MK-06, MK-08, MK-09, MK-12, MK-14, MK-15, MK-16, MK-17, MK-18, MK-19, MK-20,
MK-21, MK-22, MK-23 y MK-25 resultó ser intermitente resistentes a varios fármacos. formaciones
156 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165
Fig. 1. Las placas que muestran patrón de sensibilidad de antibióticos con diferentes antibióticos.
(Plate-I a, Bacilo sp., b. Bacillus cereus, do. Bacilo fi UDA y d. bacilo turingiensico con probado con ampicilina, estreptomicina, cephatoxime, cloranfenicol y tetraciclina. Plate-II. e F G H. bacterias curar con antibióticos respectivo ampicilina,
estreptomicina, cephatoxime, cloranfenicol y tetraciclina).
de drogas mutantes resistentes son bastante comunes donde el uso indiscriminado de insecticidas o
antibióticos (Dzidic, 2007; [52] . La incidencia de resistencia a los medicamentos son muy comunes
debido a las bacterias que residen en el entorno pueden transferir los genes de resistencia tanto
vertical como horizontalmente [18] .
3.4. La degradación de insecticida
insecticidas organofosforados son amenaza para problemas de salud humana [67] . Diferentes
tipos de bacterias presentes en el suelo son capaces de degradingmany plaguicidas persistentes y
su hidrolizado fácilmente a residuos de plaguicidas degradables [14] Pesticidas degradadores
capaces de convertir metabolitos de monocrotofos como fuente de carbono como la energía también.
análisis metabólico de la degradación de pesticidas han revelado ciclohexanona, isoxazol, indol 3
piridina, fenol, 6Methyl-4-fenil-quinazolina, pro-piophenone, benzo [h] quinolina) los principales
productos. Comparativamente MK-07 encontrado para degradar la mayoría de los derivados como 11
compuestos más de 19 compuestos. Mientras MK-11, MK-13 y MK-24 fueron capaces de degradar
10, 9 y 5 residuos, respectivamente ( tabla 1 y Figura 2 ).
3.5. identi filogenético fi cación de los aislados
Los cultivos fueron identi fi ed basado en las similitudes en la secuencia de 16S rRNA. ampli fi cación
de ADN bacteriano por 16S rRNA PCR fue seguido con cebadores universales (27f y 1492).
Mediante la secuenciación de los genes 16S rRNA de MK-07, MK-11, MK-13 y MK-24 y
comparándolas con las secuencias del gen 16S rRNA previamente publicados. La secuencia se
presentan identidad (> 90%) con el 16S rRNA de homología de secuencia ( Fig. 3 ) Fueron identi fi ed
como miembro de la
Bacilo Sps (KU510395). Bacillus cereus ( KU510396), Bacilo fi UDA
(KU510397) y Bacillus thuringiensis ( KU510398) y la secuencia se presentaron con el GenBank. El
análisis filogenético basado gen 16S rRNA se realizó por el MEGA - Explorador de software 7.0 de
alineación como se describe [1,34] .
3.6. pro ADN de plásmido fi Le
bacterias de Plaguicidas degradar paradoxus Alcaligenes y Alcaligenes eutrophus contiene
plásmidos como pJP3, PJP4, pJP5 y pJP7 que tienen masa molecular de 51 MDa (Don y Prmberton, [21]
. IncP plásmido identi fi ed y caracteriza la resistencia confiere a una antibióticos de espectro bordo y
metales pesados (Popowska y Balska, [56] . agresiones químicas aumentan la frecuencia de las
respuestas de plásmido de ADN de las poblaciones de bacterias dentro de la estresado
químicamente comunidades del suelo [78] . En este estudio, el plásmido de ADN pro fi les de los
aislados pRS11, pRS12 y pRS13 gama la acogida de 8 kb, 6 kb y 3 kb [41] . Insecticida degradar
poblaciones expuestas a bajo nivel de pesticida han enriquecido el plásmido número de copias sobre
son las poblaciones que no fueron expuestos a plaguicidas. Pro plásmido fi Le análisis expositoras
aumentos en el número de copias de plásmidos están involucrados en la degradación de plaguicidas
( Fig. 4 ).
3.7. oph parcial y mdr ampli gen fi análisis de cationes y la comparación
Gen se identificó fi ed basado en ampli fi cación de ADN plásmido bacteriano por el gen especí fi cebadores
c (gen OPH era MK: oph-FP, MK: oph-RP y el gen mdr fue MK: mdr-FP, MK: mdr-RP). El tamaño de
los fragmentos se determinó por comparación con 1 marcador kb (NEB) 1400 pb ( Fig. 6 ). métodos de
secuenciación de Sanger analizaron parcialmente (secuencia Forward). Por especí aislado fi genes c
de oph y mdr de MK-07 ( Bacilo Sps) bacterias y secuenciación en comparación con las secuencias
de genes previamente publicado (explosiva-N). La secuencia de ORF identidad se presentan (> 60%)
con el unpredicted bacilo
proteína de homología de secuencia se identificaron fi secuencias oph ed y mdr (KY420134 KY420133
y) se presentaron en GenBank. herramienta de alineamiento por pares (Clustal-w) entre estos genes
similitud oph y mdr (> 40%), por lo tanto, la similitud de secuencia podría interactuar posible
microbiana pesticida sistema acto gen de resistencia como una resistencia a los antibióticos.
aplicación de pesticidas continua y
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tabla 1
Screening resultados de la prueba para la degradación de insecticida mediante GC-MS.

Sin pico producción metabólica (0,4% monocrotofos) Control

MK-07 MK-11 MK-13 MK-24

1 ciclohexanona þ þ þ þ
2 Ácido fosfórico þ þ þ þ
3 Ácido benzoico þ þ þ þ
4 2-metanol mi þ þ þ
5 Fenol mi þ þ þ
6 etilparabeno mi mi mi

7 Fenol mi mi þ þ
8 ciclohexanona mi þ þ þ
9 monocrotofos, mi þ mi mi

10 Ácido benzoico mi þ mi þ
11 Dietil 4,4'-bifenil dicarboxilato mi mi mi þ
12 3-isoxazolamina þ þ þ þ
13 piridina þ þ þ þ
14 4-cianobenzofenona mi mi mi mi

15 Benzamida mi mi mi mi

dieciséis Fenol þ mi mi mi

17 Piridin-3-il-bencenosulfonamida þ þ þ þ
18 pirazina þ mi mi mi

19 Benceno-1,4-diamina þ mi mi mi

“-” no indica presente, “ þ ” indica presente.

perseverancia de pesticida puede causar un aumento de la resistencia a múltiples drogas entre las
bacterias del suelo por la evolución [73] .
3.8. resistencia cruzada
La ruptura paralela abajo de antibióticos / pesticidas por parte de las bacterias se debe a la
modificación del comportamiento fi de cationes y la creación de refugios [25] . Esta podría ser la razón
para la mayoría de la población resistente al insecticida que se puede utilizar como paralelo
resistente a múltiples fármacos a muchas otras drogas. Los aislados recogidos de suelo aluvial
también resultaron ser resistentes tanto a los antibióticos y pesticidas [1] . Una resistencia en paralelo
también puede ser debido a un cambio de comportamiento como resultado de los seres humanos
cambiar su entorno [45] . Themultidrug resistencia entre bacterias del suelo es un proceso de
selección natural, donde las bacterias se adaptan al nuevo entorno.
la adaptación de los microorganismos a estos sub concentraciones y, posiblemente, el desarrollo de
la verdadera resistencia. El mecanismo principal de resistencia de adaptación es la formación de
materiales mucilaginosos (glicocalix) o bio fi LMS por los microorganismos. Por lo tanto, los agentes
activos están excluidos de la célula microbiana o se inhibe su penetración a los loci de la destrucción.
La aplicación prolongada de desinfectantes en concentraciones subóptimas provoca la adaptación de
los microorganismos a las concentraciones sub y, posiblemente, el desarrollo de la verdadera
resistencia. La pérdida de proteínas porin que puede facilitar la penetración de moléculas a través de
la membrana celular parece contribuir a la resistencia [48] . Además de la exclusión de materiales
tóxicos, su secreción activa es otra manera mediante la cual las células vivas a protegerse de
envenenamiento. El plásmido es transferible a y aislado de, diferentes géneros de la

Enterobacteriaceae dando así una fuerte evidencia de la dispersión de la resistencia. La enzima es

La selección natural dicta la presión de selección de uso de antibióticos es la causa de la
cantidad de resistencia a los medicamentos. El gen resistente a múltiples fármacos puede existir en
ADN cromosómico, ADN de plásmido y elementos transponibles como saltar genes. resistencia a
múltiples fármacos entre bacteria del suelo han llevado a la transferencia de plásmido, la reserva
genética bacteriana existente que porta el gen para la enzima que puede destruir o antibióticos
inactivos [11] . Se ha demostrado en este estudio que el curado del plásmido en bacterias restaurar el
patrón de sensibilidad de pesticidas y antibióticos ( Las tablas 2 y 3 ), ( Higos. 1 y 5 ). Se puede
entender a partir del estudio anterior de que los genes cromosómicos adicionales como
transposones, plásmidos contribuirían resistente a múltiples fármacos, ya sea mediante la
degradación de los antibióticos o modificación de parte crítica de la estructura molecular.
La aplicación continua y la persistencia de los pesticidas pueden causar aumento de la
resistencia a múltiples drogas entre las bacterias del suelo por la evolución de la degradación de la
vía innovadora de pesticidas, así mutación genética [33,73] . Las resistencias de pesticidas
desarrollaron entre el suelo Florida ora contribuir la resistencia a los medicamentos como un
mecanismo de resistencia cruzada. Refs. [45,68] han demostrado la presencia de pesticida para
seleccionar la población que una resistencia tanto para pesticidas y antibióticos. Por lo tanto, la
exposición continua a los pesticidas contribuiría presión constante entre el gen su mediante el
desarrollo de resistencia a los medicamentos. Las bacterias requieren a menudo la resistencia,
incluso por una sola mutación [40,3] . Sin embargo, a veces la tolerancia natural de los organismos a
los biocidas puede exceder esta variación biológica [27] . La aplicación prolongada de desinfectantes
en concentraciones subóptimas provoca
inespecífico fi c para aldehídos de bajo peso molecular y esto puede explicar la resistencia cruzada a
otros aldehídos y esto puede explicar la resistencia cruzada a otros aldehídos o compuestos que
liberan formaldehído.
Las bacterias también suponen resistencia a múltiples fármacos mediante la producción de
mayores copias de moléculas diana de modo que la concentración de antibióticos anterior ya no es
suf fi ciente para proceso metabólico. La mera transferencia de elementos transponibles o plásmido
simplemente estiró citoplasma y ha contribuido resistencia a múltiples fármacos a muchas otras
bacterias en habituar a la atmósfera del suelo. Esto ha sido demostrado en el presente estudio que
las cepas que se han tratados con SDS (plásmido agente de curado) fueron capaces de volver
sensibilidad antibióticos. Estudios similares se citan una comparación directa entre el plásmido que
contiene y las células plásmido curado demostrado la pérdida de resistencia a los medicamentos
entre plásmido curado células bacterianas [81] . poblaciones resistentes a múltiples fármacos estaban
tranquilos común entre el suelo degradación del pesticida Florida ora debido a un gen transportado en
genes de auto-transmisible que puede saltar entre el plásmido y los cromosomas Walkup [74] .
casetes de genes de resistencia se han encontrado para la mayoría de clases de plaguicidas y
los productos de los genes están involucrados en diversos resistancemechanisms.
Integronsmovements permiten la transferencia del gen de resistencia asociado agrupación de genes
de un replicón de ADN a otro. La transferencia horizontal de genes de resistencia se puede lograr
cuando un integrones se incorpora gama amplia puesto de plásmidos

[22] . El gen que codifica el gen de resistencia a establecer un gen de resistencia

 ....._

.... ..... ... ... Y• o

--- • 7

-- •• ••

••
 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165
Fig 3. posición filogenética de los cuatro insecticidas y antibióticos degradador basado en 16s completas secuencias de ADNr alineadas por MEGA -. Explorer 7.0 de alineación.
(Figura muestra las cepas marcadas con un degradador de insecticidas y antibióticos. GenBank números de acceso se indican entre paréntesis. Los aislados mostraron identidad a Bacilo sp. (MK
07), Bacillus cereus ( MK-11), Bacilo fi UDA ( MK-13) y Bacilo turingiensico ( MK-24).
racimos, lo que representa una fuente potencial para la transferencia horizontal de genes entre
bacterias. La transferencia horizontal de genes entre dentro de las especies bacterianas tales como
genes de resistencia a pesticidas o elementos transponibles.
La aplicación continua / acumulación de pesticidas en la agricultura fi ELD, incluso a un bajo nivel
podría ejercer una presión selectiva hacia la selección de bacterias. Las bacterias se desarrollan
lentamente resistentes a los antibióticos Esto ha sido demostrado en nuestro estudio transversal
mediante la eliminación de plásmido a partir de los aislados seleccionados perdieron la capacidad de
crecer / usar los pesticidas. Transferencia del plásmido de nuevo a los organismos reanudó tanto
resistencia a los medicamentos y la capacidad de pesticidas degradantes. El informe similar
[75] poblaciones resistentes triclosán certificado eran predominante entre las cepas expuestas a los
pesticidas. Estudios similares se han realizado sobre una amplia bene genérica fi t y la supervivencia a
los antimicrobianos de la mutación entre las bacterias que exponen a los pesticidas / antibióticos a
niveles bajos (Bernier y Surette [6] ).
3.9. la interacción proteína-ligando
La hidrolasa de organofosforados Geobacillus sp. se acopló con monocrotofos y antibióticos,
tales como estreptomicina, cloranfenicol, ampicilina y cephatoxime. la identi fi cationes de antibióticos
que fi t a hidrolasa se identificaron fi ed basado en la puntuación de acoplamiento y el número de
enlaces de hidrógeno que muestra alta
159
gama de interacción en cloranfenicol ( Tabla 4 y Higos. 7 mi 11 ). Además de probar la resistencia a
plaguicidas oferta cruz resistentes a los antibióticos. otro estudio similar mostró que sub
concentración letal de herbicidas resultaría en el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos entre
las bacterias del suelo [35] .
resistencias paralelas de pesticidas son debido a las múltiples mutaciones que se produjeron en
varios genes implicados en la degradación de pesticidas. Sobre la base de la toxicidad de bacterias
de plaguicidas desarrolla resistencia permitir que las bacterias adoptan verdades de tales
componentes [77] . Una bacteria resistencia a múltiples fármacos se desarrolla místicamente
resistencia por que presenta un tipo de transportador que ef Florida UX antibióticos de la célula y sigue
su camino convertirse resistencia a múltiples fármacos. Una observación similar de este estudio han
demostrado hidrolasa organofosforado fueron capaces de unirse con cloranfenicol y se hidroliza en
una sustancia no tóxico.
análisis de acoplamiento usando ( http://www.schrodinger.com/ ) demostrado
organofosforado hidrolasa su capacidad para unirse con monocrotofos, estreptomicina, cloranfenicol,
ampicilina y cephatoxime con alta af fi nidad esto indicaba que la enzima degradante de pesticidas
también puede degradar los antibióticos excepto la tetraciclina ( Tabla 4
y Higos. 7 mi 11 ). Persistencia / acumulación de pesticidas en el entorno de crear un ambiente
selectivo para los microbios a evolucionar en una fi uno ttest [77] . El uso excesivo de pesticidas resultó
en la acumulación de residuos de pesticidas en los cultivos, los suelos y la biosfera
160 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165

Fig. 4. Pérdida de antibióticos que utilizan propiedades debido a plásmido de curado.

(A: El ADN del plásmido de Carril 1 mi La figura 4 muestra las cuatro cepas, el carril 5 muestra 1 escalera kb (Fermentas). B: I con el plásmido de ADN sin curar como Bacilo sp., Bacillus cereus, Bacillus fi UDA y Bacilo turingiensico. II con ADN de plásmido curado - no
hay bandas apareció. C. I era insecticida expuesto 0,4% de ADN plásmido bacteriano. II. Controlar plásmidos muestra).

Tabla 2
patrones de sensibilidad de insecticidas después de plásmido de curado.

Cultura La concentración de insecticida (%)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Tolerancia insecticida (valor de la DO a 600 nm)

Bacilo sp., Curado 0.2 ± 0.02 0.10 ± 0.02 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.02 0.09 ± 0.02
sin curar 0.53 ± 0.02 0.55 ± 0.02 0.47 ± 0.01 0.49 ± 0.02 0.32 ± 0.02
Bacillus cereus Curado 0.12 ± 0.02 0.05 ± 0.02 0.04 ± 0,010 0.08 ± 0.03 0.08 ± 0.03
sin curar 0.51 ± 0.02 0.57 ± 0.02 0.4 ± 0,010 0.38 ± 0.03 0.35 ± 0.03
Bacilo fi UDA Curado 0.23 ± 0.03 0.04 ± 0.01 0.06 ± 0.04 0.06 ± 0.03 0.08 ± 0.05
sin curar 0.53 ± 0.03 0.56 ± 0.01 0.47 ± 0.04 0.42 ± 0.03 0.42 ± 0.05
bacilo turingiensico Curado 0.24 ± 0.06 0.04 ± 0.03 0.08 ± 0.00 0.08 ± 0.05 0.09 ± 0.00
sin curar 0.59 ± 0.06 0.54 ± 0.03 0.45 ± 0.00 0.37 ± 0.05 0.39 ± 0.00

Tabla 3
patrón de sensibilidad a los antibióticos después de plásmido de curado.

Son Bacilo sp. Bacillus cereus Bacilo fi UDA bacilo turingiensico

Los antibióticos ampicilina

(Amp 10) R (R) S (R) S (R) S (R)

Estreptomicina (S 10) S (R) S (R) S (R) S (R)
Cephatoxime (CE30) S (R) S (R) S (R) S (R)
Cloranfenicol (C 30) S (R) S (R) S (R) S (R)
Tetraciclina (T 30) S (R) S (R) S (R) S (R)

* Dentro de () sin curar la cultura.

creando una tensión ecológica [58] . No había ni una secuencia idéntica a disposición ni el vecino enlace con la cadena lateral ( Fig. 7 un).

más cercano en el análisis explosión. Por lo tanto un método alternativo para fi Nding la proteína
homóloga
[43] . Otros estudios sobre la mutación contribuyendo resistencia a múltiples fármacos revelaron que
los fenómenos evolutivos son resistentes paralelo a ambos antibióticos e insecticidas. Este estudio,
dos interacción estructura de la dimensión de hidrolasa de organofósforo con cloranfenicol línea de
puntos de color rosa representa el hidrógeno
vista de la superficie de la hidrolasa organofosforado con complejo de cloranfenicol ( Fig. 7 segundo).
Gris representa la representación de la superficie de la hidrolasa organofosforados. Cloranfenicol es
highlightedwith verde. Interacción de hidrolasa organofosforado con cloranfenicol con una puntuación
de Glide 4.612 ( Fig. 7 do). Esta interacción formó dos enlaces hidroxilo entre átomo de hidrógeno de
cloranfenicol con HIE 304 y un átomo de hidrógeno de
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Fig. 5. La pérdida de propiedades que utilizan insecticidas después de plásmido de curado.

(Plate-I muestra una. Bacilo sp., b. Bacillus cereus, do. Bacilo fi UDA y d. bacilo turingiensico plásmido sin curar (A) y bacterias curados (B)).

cloranfenicol con GLN 278 distancia de 2,173 Å y 1,749 Å. Dos dimensión interacción estructura de
hidrolasa de organofósforo con monocrotofos línea de puntos de color rosa representa el enlace de
hidrógeno con la cadena lateral ( Fig. 8 un). vista de la superficie del complejo organofosforados
hydrolasewithmonochrotophos ( Fig. 8 segundo). Gris representa la representación de la superficie de
la hidrolasa organofosforados. Monocrotofos se destaca con verde. Interacción de hidrolasa
organofosforado con monocrotofos con una puntuación de Glide 3.356 ( Fig. 8 do). Esta interacción
formó dos enlaces hidroxilo entre un átomo de oxígeno del monocrotofos con TYR 128 y un átomo de
hidrógeno de monocrotofos con TYR 128 distancia de

1,948 Å y 1,797 Å. Dos dimensión interacción estructura de hidrolasa de organofósforo con la línea
de ampicilina rosada punteada representa el enlace con la cadena lateral ( Fig. 9 un). vista de la
superficie de hidrolasa de organofósforo con complejo de ampicilina ( Fig. 9 segundo). Gris representa
la representación de la superficie de la hidrolasa organofosforados. La ampicilina se destaca con
verde. Interacción de hidrolasa organofosforado con ampicilina con una puntuación de Glide 3.088 ( Fig.
9 do).

No hay enlace de hidrógeno formado entre hidrolasa de organofósforo y ampicilina. Dos

dimensión interacción estructura de hidrolasa de organofósforo con la línea de cefotaxima rosa de
puntos representa el enlace de hidrógeno con la cadena lateral ( La Fig. 10 un). vista de la superficie
de la hidrolasa organofosforado con complejo de cefotaxima ( La Fig. 10 segundo). Gris representa la
representación de la superficie de la hidrolasa organofosforados. La cefotaxima se destaca con
verde. Interacción de hidrolasa organofosforado con cefotaxima con una puntuación de Glide 2.711 ( La
Fig. 10 do). Esta interacción formó dos enlaces hidroxilo entre átomo de hidrógeno de cefotaxima con
ARG 328 distancia de 2,002 Å y 1,980 Å. Dos dimensión interacción estructura de hidrolasa de
organofósforo con estreptomicina. línea de puntos Pink representa el enlace de hidrógeno con la
cadena lateral y la línea recta de color rosa representa el enlace de hidrógeno interactúa con hueso
posterior ( La Fig. 11 un). vista de la superficie de la hidrolasa organofosforado con complejo de
monocrotofos ( La Fig. 11 segundo). Gris representa la representación de la superficie de la hidrolasa
organofosforados. La estreptomicina es

Fig. 6. PCR-ampli fi cación de oph y el gen mdr en el plásmido de ADN (MK-07).

(Carril 1. Muestra 1 kb escalera (New England Biolabs). Carril 2. gen de oph bacilo sps plásmido de ADN. Carril forma
gen 3. Mdr bacilo sps plásmido de ADN).
162 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165

Tabla 4
in silico análisis estructural y de unión de hidrolasa de organofósforo de Geobacillus sp., con cloranfenicol, monocrotofos, ampicilina, cephatoxime, streptomycinand tetraciclina.

S. No se inhibidores puntuación de acoplamiento Kcal / molde No. de enlaces de hidrógeno Amino ácido interactuar a ligando

1. cloranfenicol 4.612 2 HIE 304, 278 GLN

2. monocrotofos 3,356 2 TYR 128
3. ampicilina 3,088 mi mi

4. cefotaxima 2,711 2 ARG 328

5. Estreptomicina 0,0218 2 VAL 335, 201 GLU
6. tetraciclina 0.00 mi mi

Fig. 7. Interacción de hidrolasa organofosforado con cloranfenicol.

Fig. 8. Interacción de hidrolasa organofosforado con monocrotofos.

highlightedwith verde. Interacción de hidrolasa de organofósforo con estreptomicina con una 4. Conclusión
puntuación Glide de 0,0218 ( La Fig. 11 do). Esta interacción formó dos enlaces hidroxilo entre átomo
de oxígeno de la estreptomicina con VAL 335 y un átomo de oxígeno de la estreptomicina con GLU Se ha demostrado que la agricultura fi ELD expuestos a pesticidas en Florida influenciadas las
201 distancia de 1,952 Å y 1,901 Å. cepas como Bacilo sps, Bacillus cereus, Bacillus fi UDA y Bacillus thuringiensis una resistente a
múltiples fármacos
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Fig. 9. Interacción de hidrolasa de organofósforo con ampicilina.

Fig. 10. Interacción de hidrolasa organofosforado con cefotaxima.

Fig. 11. Interacción de hidrolasa de organofósforo con estreptomicina.

164 K. Rangasamy et al. / Patogénesis microbiana 105 (2017) 153 mi 165
población. Se puede extrapolarse a partir de las observaciones anteriores organismos están en
continua evolución con el en Florida influencia del microambiente. Sin embargo, los resultados que se
muestran en este documento se basan en experimentos de laboratorio y se necesitan más
investigaciones para verificar estos datos en el mundo real fi experimento de campo. se requieren
investigaciones adicionales para determinar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo
de resistencia a los antibióticos.
Estafa Florida ictos de interés
Todos los autores declaran que no tienen ni aire Florida icto de intereses.
Expresiones de gratitud
Los autores reconocen S. Gopinath Investigación Académico, Universidad Bharathiar, Tamil
Nadu, India para el análisis de acoplamiento. Los autores también reconocen la Universidad de
Periyar, Salem de la Universidad beca de investigación.
Apéndice A. Los datos complementarios
Los datos suplementarios relacionados con este artículo se pueden encontrar en http: //
dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2017.02.011 .
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