HUBUNGAN LAMA PENYIMPANAN SAMPEL ARSIP JARINGAN DALAM

BLOK PARAFIN TERFIKSASI FORMALIN DENGAN KUALITAS HASIL

EKSTRAKSI DNA MITOKONDRIA JARINGAN
Siti Shalihah RN1, Zen Hafy2, Lusia Hayati3

1. Program Studi Pendidikan Dokter,Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Jln. Dr. Moh. Ali Komplek RSUP Dr.
Mohammad Hoesin Km 3,5, Palembang, 30126, Indonesia
2. Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Jln. Dr. Moh. Ali Komplek RSUP Dr.
Mohammad Hoesin Km 3,5, Palembang, 30126, Indonesia

E-mail: shalinovizar@yahoo.co.id

Abstrak

Sampel arsip jaringan formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) menyediakan sumber materi biologis yang
melimpah dalam studi molekuler saat ini. Kualitas asam nukelat, terutama mtDNA yang diekstraksi dari jaringan
FFPE dapat dipengaruhi oleh waktu penyimpanan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah lama waktu
penyimpanan jaringan FFPE mempengaruhi kualitas hasil ekstraksi mtDNA di Bagian Patologi Anatomi RSUP
Dr. Mohammad Hoesin Palembang. DNA diekstraksi dari 16 sampel arsip FFPE yang diambil secara acak dari
Laboratorium Patologi Anatomi RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang. Sampel tersebut dibagi menjadi dua
kelompok berdasarkan lama waktu penyimpanan (kurang dari 1 tahun dan 1 sampai 5 tahun). Isolat DNA dari
kedua grup diamplifikasi menggunakan PCR dengan dua primer mitokondria spesifik yaitu, Mito ND (320 pb) dan
Mito In (142 pb). Visualisasi hasil PCR dilakukan dengan metode elektroforesis. Tidak ada sampel dari kedua
kelompok lama waktu penyimpanan yang dapat diamplifikasi dengan menggunakan primer Mito ND. Namun,
hasil PCR menggunakan primer Mito In menunjukkan hasil yang positif pada semua sampel dari kedua kelompok
lama waktu penyimpanan. Penelitian ini menunjukkan bahwa lama waktu penyimpanan tidak mempengaruhi
kualitas MtDNA yang diisolasi dari sampel arsip FFPE di Bagian Patologi Anatomi RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang. Labih lanjut, penelitian ini menunjukkan bahwa mtDNA yang diekstraksi dari sampel arsip FFPE
sudah terdegradasi sehingga tidak cocok digunakan untuk penelitan tingkat genetik yang membutuhkan amplikon
mtDNA yang panjang.

Kata kunci: FFPE, mtDNA, Mito In, Mito ND

Abstract

The Association of Formalin-Fixed Paraffin Embedded Archival Tissue’s Storage Time with The Quality of
Tissue’s Extracted Mitochondrial DNA. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) archival tissue presents a readily
available resource in molecular study nowadays. The quality of nucleid acid, especially mtDNA extracted from FFPE
tissue could be affected by the storage time. Thus, this study investigated if the FFPE tissue’s storage time had an effect
on the quality of the extracted mtDNA at Department of Pathology RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang. DNA was
extracted from 16 randomly selected archival FFPE tissues in Laboratory of Pathology Anatomy, RSUP dr. Mohammad
Hoesin Palembang. The samples were grouped based on their storage time (less than 1 year and 1 to 5 yrs.’ old). The
isolated DNA from each group was amplified using PCR with two specific mitochondrial primers, Mito ND (320 bp)
and Mito In (142 bp). The PCR products were visualized by electrophoresis method. None of the samples from both
groups could be amplified witht the Mito ND primers. However, the PCR result of the Mito In primers showed positive
for all of the samples from each study group. The study indicated that the storage time does not affect the quality of
mtDNA isolated from the FFPE samples archived in Department of Pathology RSUP Dr. Mohammad Hoesin
 Palembang. Furthermore, the study showed that the mtDNA extracted from FFPE tissue has been degraded, therefore,
the samples are not suitable for genetic studies require a long mtDNA amplicon.
Keywords: FFPE, mtDNA, Mito In, Mito ND
1. Pendahuluan
Formalin-fixed paraffin-embedded tissue atau
jaringan FFPE telah secara luas dan puluhan
tahun digunakan dalam studi-studi
imunohistokimia. Jaringan FFPE tidak hanya
merupakan sediaan sampel jaringan yang bisa
bertahan lama, tapi juga merupakan sumber
material biologis berlimpah yang mudah
didapat dan memiliki biaya rendah untuk
penggunaan skala besar.(ludyga)
Meningkatnya minat para peneliti untuk
mempelajari penyakit atau kelainan-kelainan
genetik sampai di tingkat asam nukleat
menyebabkan tingginya nilai manfaat dari
jaringan FFPE sebagai arsip sampel biologis
tersimpan (Kokkat)
Berbagai teknik ekstraksi mtDNA telah
dikembangkan untuk mendapatkan isolat
mtDNA dari jaringan FFPE agar bisa dianalisis
lebih lanjut. Namun, untuk mendapatkan hasil
ekstraksi mtDNA dari FFPE yang cukup baik
secara kualitas dan integritas agar bisa
dianalisis lebih lanjut masih merupakan
tantangan tersendiri bagi para peneliti di
bidang molekular. Umur atau lama waktu arsip
jaringan blok parafin tersebut tersimpan
diyakini memengaruhi kualitas dan integritas
mtDNA hasil ekstraksi dari FFPE (Font)
Beberapa penelitian yang menghubungkan
lama waktu penyimpanan dengan kualitas
hasil ekstraksi DNA dari FFPE telah banyak
dilakukan. Terdapat level mtDNA yang sama
ditemukan di jaringan beku dan sampel arsip
FFPE dan tidak terdapat perbedaan yang
signifikan pada kualitas dan kuantitas DNA
antara DNA arsip beberapa tahun lalu dengan
arsip jaringan FFPE yang baru tesimpan
selama 1–2 bulan.(Font Kokkat)
Selain umur atau lama waktu
penyimpanan, terdapat faktor lain yang dapat
memengaruhi kualitas DNA dalam FFPE
yaitu, kondisi ketika dilakukan fiksasi formalin
pada proses pembuatan, iklim, pH, suhu dan
kelembapan lingkungan penyimpanan
FFPE.(Font) Kondisi lingkungan penyimpanan
yang berbeda memengaruhi kualitas DNA di
dalam FFPE. Berdasarkan hal tersebut, maka
penelitian ini dilakukan di kota Palembang,
karena RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang mempunyai faktor lingkungan
penyimpanan FFPE tersendiri.
Penelitian ini dilakukan untuk
membandingkan dengan hasil penelitian
sebelumnya di negara yang berbeda. Penelitian
ini juga dilakukan untuk membandingkan
kualitas mtDNA yang diambil dari sampel
arsip FFPE (Formalin-fixed paraffin-
embedded tissue) dengan lama waktu
penyimpanan kurang dari 1 tahun dan lebih
dari 1 tahun di RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang.
2. Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis
penelitian observasional analitik dengan
desain pengambilan data cross-sectional.
Sampel penelitian ini adalah 16 jaringan arsip
FFPE yang tersimpan kurang dari 5 tahun di
Bagian Patologi Anatomi RSUP Dr.
Mohammad Hoesin Palembang. Sampel
penelitian ini dipilih secara acak dan telah
memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
Jaringan FFPE dengan konsistensi yang
kurang baik sehingga akan menyulitkan
pemotongannya dieksklusikan dari penelitian
ini. Semua sampel diketahui telah difiksasi
dalam larutan formalin dan direndam dalam
parafin dengan prosedur yang sama. Sampel
tersebut dibagi menjadi dua kelompok
berdasarkan lama waktu penyimpanan, yaitu 8
sampel dengan lama penyimpanan kurang dari
1 tahun dan 8 sampel dengan lama
penyimpanan lebih dari 1 tahun.
 Setiap blok sampel dipotong secara seri 2 2016 0.265 0.234 1.132
sebanyak 10 potongan dengan ketebalan 8-10
3 2016 0.252 0.224 1.125
mikrometer setiap potongannya dan
dimasukkan ke dalam mikrotube 1.5ml. 4 2016 0.284 0.240 1.183
Sampel kemudian dideparafinasi terlebih
1.225
dahulu dan dilanjutkan dengan proses isolasi 5 2016 0.349 0.285
DNA untuk mendapatkan isolat DNA dari 1.122
6 2016 0.258 0.230
jaringan FFPE. Setelah dideparafinisasi dan
dilakukan isolasi DNA, isolat DNA kemudian 7 2016 0.443 0.325 1.363
diuji dengan spektrofotmetri untuk mengetahui 1.096
kemurnian DNA. Kemurnian DNA dinyatakan 8 2016 0.229 0.209
dengan membandingkan panjang gelombang 9 2015 0.293 0.259 1.131
260 nm dan 280 nm (A260/A280).
10 2015 0.266 0.242 1.099
Isolat DNA dari kedua grup diamplifikasi
menggunakan PCR dengan dua primer 11 2014 0.285 0.240 1.188
mitokondria spesifik yaitu, Mito ND (320 pb)
1.143
dan Mito In (142 pb). Sampel di PCR 12 2014 0.280 0.245
menggunakan 2 jenis primer guna 1.127
13 2013 0.257 0.228
mengidentifikasi adanya mtDNA yang
berkaitan dengan hubungan lama waktu 14 2013 0.235 0.215 1.093
penyimpanan arsip jaringan FFPE dengan 1.119
15 2012 0.244 0.218
kualitas ekstrak mtDNA dan untuk melihat
seberapa besar fragmentasi molekul-molekul 16 2012 0.243 0.217 1.120
DNA yang umumnya mengalami degradasi
akibat proses parafinisasi dan fiksasi dengan
Nilai rata-rata pengukuran hasil
formalin. Visualisasi hasil PCR dilakukan
spektrofotometri yang membandingkan
dengan metode elektroforesis gel agarose.
panjang gelombang A260/A280 pada
Kualitas mtDNA hasil isolasi dinilai
kelompok sampel dengan lama penyimpanan
dengan melihat positif atau tidaknya gambaran
kurang dari satu tahun adalah 1.172 dan pada
pita DNA di dalam gel hasil elektroforesis
kelompok sampel dengan lama penyimpanan
menggunakan sinar Ultra Violet (UV),
kurang dari satu tahun adalah 1.127. Secara
sehingga data yang akan dikumpulkan adalah
keseluruhan rata-rata hasil spektrofotometri
data nominal. Analisis data pada penelitian ini
antara dua kelompok sampel mempunyai hasil
menggunakan analisis korelasi Fisher Exact
yang tidak jauh berbeda, namun kelompok
Test.
sampel dengan lama penyimpanan diatas satu
tahun sedikit lebih tinggi.
3. Hasil
Hasil Spektrofotometri Tabel 4. Nilai Rata- Rata Hasil Spektrofotometri
Kualitas DNA dinilai melalui kemurnian DNA Subjek Usia penyimpanan FFPE
yang dinilai dengan membandingkan
pembacaan DNA pada panjang gelombang <1 tahun >1 tahun
260 nm dan 280 nm (A260/A280). A260 0.32250 0.26288
A280 0.27363 0.23300
Tabel 3. Hasil spektrofotometri
No. 260/280 Rasio A260/280 1.17212 1.12750
Tahun 260 280
Sampel
1 2016 0.500 0.442 1.131
Hasil Elektroforesis Menggunakan Mito
ND
Visualisasi hasil PCR dengan primer Mito ND
menggunakan elektroforesis tidak berhasil
mendapatkan hasil amplifikasi PCR sepanjang
320 bp pada semua sampel. Hasil visualisasi
hanya terlihat berupa sebaran DNA dan
fragmen-fragmen DNA yang tidak spesifik.
Gambar 8a. Hasil elektroforesis menggunakan primer
Mito In menunjukkan hasil positif pada seluruh
sampel pada ketinggian band 142 bp. M = DNA
Marker 50 bp. KP merupakan Kontrol Positif dan
KN merupakan Kontrol Negatif

Gambar 7. Hasil elektroforesis menggunakan primer

Mito ND menunjukkan hasil negatif pada seluruh
sampel pada ketinggian band 320 bp. M = DNA Gambar 8b. Hasil elektroforesis menggunakan primer
Marker 50 bp. M adalah Marker dan KP adalah Mito In menunjukkan hasil positif pada seluruh
Kontrol Positif sampel pada ketinggian band 142 bp. M = DNA
Marker 50 bp.
Tabel 5. Distribusi mtDNA Sampel menggunakan
primer Mito ND Tabel 5. Distribusi mtDNA Sampel menggunakan
primer Mito In
Positif Negatif N
Variabel
Positif Negatif N
n % n % Variabel
< 1 tahun 0 0% 8 100% 8 n % n %
mtDNA < 1 tahun 8 100% 0 0% 8
> 1 tahun 0 0% 8 100% 8 mtDNA
Total 0 16 16 > 1 tahun 8 100% 0 0% 8
Total 16 0 16
Berdasarkan hasil elektroforesis seperti
terlihat pada tabel diatas, didapatkan data yang Berdasarkan hasil elektroforesis seperti
konstan, sehingga analisis bivariat untuk terlihat pada tabel diatas, didapatkan data yang
mengetahui hubungan antara dua variabel konstan, sehingga analisis bivariat untuk
untuk membuktikan hipotesis penelitian mengetahui hubungan antara dua variabel
dengan menggunakan Fisher Exact Test tidak untuk membuktikan hipotesis penelitian
dapat dilakukan. dengan menggunakan Fisher Exact Test tidak
dapat dilakukan.
Hasil Elektroforesis Menggunakan Primer
Mito In 4. Pembahasan
Visualisasi hasil PCR dengan primer Mito In Formalin fixation and paraffin embedding
menggunakan elektroforesis berhasil (FFPE) merupakan salah satu metode
mendapatkan hasil amplifikasi PCR sepanjang penyimpanan sampel arsip yang dapat
142 bp pada semua sampel. digunakan untuk menyimpan sampel arsip
dalam jangka waktu lama di bagian patologi
anatomi. Penyimpanan dalam bentuk blok
FFPE ini memungkinkan suatu sampel
jaringan dapat disimpan selama bertahun-
tahun. Blok FFPE di RSUP Dr. Mohammad
Hoesin Palembang menyimpan sampel-sampel
jaringan dengan penyakit degeneratif yang
sangat banyak dan dapat menjadi sumber ilmu
pengetahuan yang melimpah, sehingga sangat
penting untuk mengetahui kualitas DNA dari
blok FFPE tersebut. Umur atau lama waktu
arsip jaringan blok parafin tersebut tersimpan
diyakini memengaruhi kualitas dan integritas
mtDNA hasil ekstraksi dari FFPE (Font et al., 2013).
Oleh karena itu, mengetahui hubungan lama
waku penyimpanan dengan kualitas mtDNA
hasil ekstraksi dari FFPE di bagian Patologi
Anatomi RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang merupakan suatu hal yang esensial
bagi penelitian di bidang biologi molekuler.
Untuk dapat menganalisis isolat DNA dari
blok FFPE perlu dilakukan proses ekstraksi
DNA berupa deparafinisasi dan isolasi DNA.
Setelah dideparafinisasi dan dilakukan isolasi
DNA, isolat DNA kemudian diuji dengan
spektrofotmetri untuk mengetahui kemurnian
DNA. Kemurnian DNA dinyatakan dengan
membandingkan panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm (A260/A280). Dari hasil
spektrofotometri yang dilakukan pada 16
sampel FFPE, diketaui bahwa seluruh sampel
mempunyai kemurnian yang kurang baik
karena tidak mencapai rasio 1.6-2.0 yang
berarti terdapat kontaminasi protein dan
molekul lain. Tetapi, jika dilihat melalui hasil
rata-rata, isolat DNA dari FFPE yang disimpan
dibawah satu tahun memiliki kemurnian yang
lebih tinggi dibandingkan dengan yang
disimpan lebih dari satu tahun. Nilai rata-rata
rasio A260/A280 dibawah 1.6 menunjukan
masih adanya kontaminasi protein dan zat-zat
lainnya di dalam isolat DNA tersebut.
Kemurnian isolat DNA dari blok FFPE
dapat dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti
proses fiksasi dengan formalin, teknik isolasi
dan purifikasi DNA yang belum sempurna,
dan beberapa faktor teknis lainnya. Proses
fiksasi dengan formalin membuat crosslinking
antara asam nukleat dan protein. Semakin lama
waktu penyimpanan maka akan semakin kuat
crosslink yang terjadi. Selain itu, teknik isolasi
dan purifikasi yang kurang tepat dan tidak
sempurna juga mempengaruhi tingkat
pelepasan crosslinking antara asam nukleat
dan protein.
Isolat DNA kemudian juga dilakukan
amplifikasi dengan teknik PCR yang
menggunakan 2 jenis primer, yaitu primer
Mito ND (320 bp) dan Mito In (149 bp).
Pertama dilakukan PCR dengan menggunakan
primer Mito ND yang mempunyai amplikon
yang lebih panjang. Visualisasi hasil PCR
dilakukan dengan menggunakan
elektroforesis. Dari visualisasi elektroforesis
didapatkan hasil negatif di semua sampel baik
dengan lama waktu penyimpanan kurang dari
1 tahun maupun lebih dari 1 tahun. Analisis
bivariat dengan menggunakan Fisher Exact
Test tidak dapat dilakukan karena memeroleh
hasil yang konstan, sehingga hubungan antara
lama waktu penyimpanan blok FFPE dengan
kualitas isolat mtDNA tidak dapat dicari.
Isolat DNA lalu dilakukan amplifikasi
dengan PCR menggunakan primer Mito In
yang mempunyai amplikon lebih pendek.
Visualisasi hasil PCR dilakukan dengan
menggunakan elektroforesis. Dari visualisasi
elektroforesis didapatkan hasil positif di semua
sampel baik dengan lama waktu penyimpanan
kurang dari 1 tahun maupun lebih dari 1 tahun.
Analisis bivariat dengan menggunakan Fisher
Exact Test tidak dapat dilakukan karena
memeroleh hasil yang konstan, sehingga
hubungan antara lama waktu penyimpanan
blok FFPE dengan kualitas isolat mtDNA tidak
dapat dicari.
Hasil yang terbaca positif ini sesuai dengan
penelitian yang telah dilakukan sebelumnya di
Negara berbeda. Menurut penelitan lain, tidak
terdapat perbedaan yang signifikan pada
kualitas DNA antara DNA arsip beberapa
tahun lalu dengan arsip jaringan FFPE yang
baru tesimpan selama 1–2 bulan. kokat). DNA
dari sampel arsip FFPE usia 40 tahun relatif
sangat dapat dibandingkan dengan sampel
arsip FFPE usia 10 tahun. (ludyga), Penelitian lain
juga menyimpulkan terdapat level mtDNA
yang sama ditemukan di jaringan beku dan
sampel arsip FFPE.(font) Walaupun hubungan
lama waktu penyimpanan dengan kualitas
hasil ekstraksi mtDNA dari FFPE tidak dapat
dicari, namun isolat mtDNA dengan lama
waktu penyimpanan lebih dari satu tahun dan
lebih dari satu tahun masing-masing masih
mempunyai kualitas yang sama baiknya
berdasarkan hasil visualisasi PCR
menggunakan primer amplikon pendek, yaitu
Mito In.
Hasil visualisasi mtDNA dengan UV
menunjukkan gambaran smear atau sebaran
DNA tidak jelas pada setiap sampel pada
ukuran 320 bp dan terbaca pada ukuran 142 bp
menunjukkan bahwa mtDNA pada seluruh
sampel telah terdegradasi dan mengalami
fragmentasi. Fragementasi DNA ini dapat
disebabkan oleh banyak faktor, Selain umur
atau lama waktu penyimpanan, terdapat faktor
lain yang dapat memengaruhi validitas hasil
penelitian kualitas DNA dalam FFPE yaitu,
kondisi ketika dilakukan fiksasi formalin pada
proses pembuatan, iklim, pH, suhu dan
kelembapan lingkungan penyimpanan FFPE
(Font et al., 2013).
Ada 3 faktor yang dapat
menyebabkan DNA terfragmentasi di dalam
FFPE, yaitu faktor pra-fiksasi, faktor fiksasi
dan parafinisasi, dan faktor post-fiksasi. Selain
proses fiksasi, proses ekstraksi juga dapat
mempengaruhi terjadinya degradasi DNA
seperti faktor Pre-treatment, faktor metode
ekstraksi, dan faktor manipulasi DNA post-
ekstraksi.(gilbert)
Penelitian lain menyimpulkan bahwa dari
seluruh sampel yang diuji dari tahun
penyimpanan yang berbeda hanya dapat
diamplifikasi secara efektif sampai 191bp,
sehingga kualitas DNA tidak berhubungan
dengan lama waktu penyimpanan. Isolat DNA
dari FFPE hanya baik untuk analisis tingkat
genetik yang hanya membutuhkan molekul
DNA yang pendek, seperti Single Nucleotide
Polymorphism, Micosatelite, dan methylation
status analyses).(Lin) Hasil penelitian yang
pernah dilakukan sebelumnya sesuai dengan
penelitian ini yaitu, tidak terbacanya DNA
pada ukuran 320 bp dan terbaca dengan jelas
pada ukuran 142 bp.
Secara keseluruhan dari penelitian ini
diketahui bahwa hubungan kualitas mtDNA
lama waktu penyimpanan sampel FFPE tidak
dapat dicari. Namun jika dilihat dari hasil
visualisasi amplifikasi PCR melalui
elektroforesis, dapat diketahui bahwa sampel
DNA dari jaringan FFPE kurang baik
digunakan untuk analisis molekul DNA
dengan fragmen panjang dan lebih cocok
untuk analisis tingkat genetik yang hanya
membutuhkan molekul DNA yang berfragmen
pendek atau analisis molekuler yang
membutuhkan gen spesifik dengan pasang
basa yang kecil.
Kesimpulan
Berdasarkan data hasil penelitian dan
pembahasan mengenai kualitas isolat mtDNA
hasil ekstraksi dari blok FFPE, dapat dibuat
kesimpulan sebagai berikut:
1. Berdasarkan hasil visualisasi PCR
menggunakan primer Mito In, isolat
mtDNA dengan kedua lama waktu
penyimpanan mempunyai kualitas yang
sama baiknya. Namun, mtDNA hasil
isolasi telah mengalami fragmentasi
karena hanya dapat diamplifikasi
hingga142 bp.
2. Hubungan lama waktu penyimpanan
sampel arsip FFPE dengan kualitas hasil
ekstraksi DNA mitokondria jaringan tidak
dapat diketahui karena data menunjukkan
hasil yang konstan.
DAFTAR ACUAN
1. AAOS. 2013. Plantar Fasciitis.
(http://orthoinfo.aaos.org/PDFs/A0014
9.pdf, Diakses pada 10 Desember
2016).
2. Capodaglio, P., Castelnuovo, G.,
Brunani, A., dan Vismara, L. 2010.
Functional Limitations and
Occupational Issues in Obesity 16 (4),
507–523,
 (http://archiwum.ciop.pl/40476,
Diakses pada 13 Juni 2016).
3. CDC. 2009. BMI for Practitioners.
(http://www.cdc.gov/obesity/downloa
d, Diakses pada 29 Juni 2016).
4. Department of Social and Health
Services. 2014. Range of Joint
Evaluation Chart, Washington, hal 1-2.
(http://www.dshs.wa.gov/sites/default/
files, Diakses 27 Juni 2016).
5. Departemen Kesehatan. 2011.
Pedoman dan Penanggulangan
Kegemukan dan Obesitas pada Anak
Sekolah. Jakarta, hal 1.
6. Forhan, M., Gill, S. 2013. Obesity,
Functional Mobility and Quality of
Life. 27, 129-137.
(www.elsevier.com/locate/beem,
Diakses 2 Agustus 2016).
7. Graff, V.D. 2001. Human Anatomy.
6th ed. McGrawHill Company, hal
204-205.
8. Hills, A.P., Bryne, N.M. 2002. The
Biomechanics of Adiposity – Structure
functional limitations of obesity and
implications for movement. 3, 35-43,
(https://www.researchgate.net/publicat
ion/11258536, Diakses 5 Agustus
2016).
9. Huerta, J.P., Garcia, J.M.A. 2007.
Effect of Gender, Age, and
Anthropometric Variables on Plantar
Fascia Thickness at Different
Locations in Asymptomatic Subjects.
62, 449-523.
(http://clinicadelpieembajadores.com,
Diakses pada 10 November 2016).
10. Huerta, J.P., Garcia, J.M.A. 2008.
Relationship of BMI, Ankle
Dorsiflexion and Foot Pronation on
Plantar Fascia Thickness in Healthy,
Asymptomatic Subjects. 5 (98), 379-
384, (www.japmaonline.org, Diakses
pada 5 Desember 2016).
11. Ikatan Dokter Anak Indonesia. 2014.
Diagnosis, Tatalaksana dan
Pencegahan Obesitas pada Anak dan
Remaja. 1-2. (www.idai.or.id, Diakses
13 Juni 2016).
12. Joao, S.M.A., Nishizaki, M.N.,
Yamamoto, C.H; Barbosa, L.V.P.,
Sauer, J.F. 2014. Obesity Effect on
Children Hip and Knee Range of
Motion 5, 490-497,
(http://file.scirp.org/pdf/IJCM_201404
2514562701.pdf, Diakses pada 13 Juni
2016).
13. Kosmahl, E. 2016. Goniometry.
Department of Physical Therapy
University of Cranton, Pennsylvannia,
USA.
14. Kuni, B., Ruhling, N.E., Wagner, F.
2015. Do Overweight Children Stand
on Valgus Knees. 66, 332-336,
(www.zeitschrift-sportmedizin.de,
Diakses 25 Oktober 2016.
15. Moore, K.L., Dalley, A.F., Agur,
A.M.R. 2010. Clinical Oriented
Anatomy. Lippincott Williams &
Wilkins, Philadelphia, USA, hal 26-28.
16. Norkin, C.C., White, D.J. 2003.
Measurement of Joint Motion A Guide
to Goniometry 3rd Edition. F.A Davis
Company, Philadelphia.
17. Palastanga, N., Soames, R. 2012.
Anatomy and Human Movement 6th
Edition. Elsevier, hal 122-123, 248-
251, 297-298.
18. Park, W., Ramachandran, J., Weisman,
P., Jung, E.S. 2010. Obesity Effect on
Male Active Joint Range of Motion. 52
(1), 102-108 (http://www.rmaoem.org,
Diakses 16 September 2016).
19. Reese, N.B., dan Bandy, W.D. 2016.
Joint Range of Motion Muscle Length
Testing 3rd Edition. Elsevier, hal 8-10.
20. Richey, R. 2015. Goniometric
Assesment, (http://www.nasm.org,
Diakses 28 Juni 2016).
21. Roy, S.H., Wolf, S.L., Scalzitti, D.A.
2012. The Rehabilitation Specialist’s
Handbook. F.A Davis Company,
Philadelphia, hal 122.
22. Snell, R.S. 2006. Anatomi Klinik.
EGC, Jakarta, Indonesia, hal 15-17.
 23. Putz, R., Pabst, R. 2003. Atlas Anatomi
Manusia Sobotta Edisi 21. EGC,
Jakarta.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih
kepada dr. Tri Suciati, M.Kes dan dr. Budi
Santoso, M.Kes atas bimbingan selama
penelitian. Kepada para penguji skripsi yaitu
dr. Indri Seta Septadina, M.Kes dan dr.
Liniyanti D Oswari, M.Sc saya mengucapkan
terima kasih atas saran-saran yang diberikan
untuk menyempurnakan penelitian ini.
Terakhir peneliti mengucapkan terima kasih
kepada Wakil Kepala Sekolah, Nuraini, S,Pd
berserta staf guru SMA Plus Negeri 17
Palembang yang telah memberikan izin dan
dukungan selama pengambilan data.