Genes TEM y SHV en Klebsiella

pneumoniae aislados de las cucarachas y su

patrón de resistencia antimicrobiana
Abbas Doosti, Mohammad Pourabbas, [...] y Hamidreza Kabiri
Información adicional del artículo
Abstracto
Objetivos
Klebsiella pneumoniae es una bacteria con bacilos gramnegativos, una causa
conocida de neumonía bacteriana adquirida en la comunidad y es un importante
patógeno adquirido en el hospital que causa morbilidad y mortalidad graves. El
objetivo de este estudio fue identificar los genes TEM y SHV en K.
pneumoniae aislado de cucarachas obtenidas de hospitales.
Métodos
En este estudio, se recogieron 250 cucarachas de diferentes hospitales en la
provincia de Chaharmahal Va Bakhtiari, que se encuentra en el suroeste de
Irán. Las muestras se examinaron para detectar la presencia de K.
pneumoniae plaqueando en una combinación de medios de cultivo, y los
patrones de susceptibilidad antimicrobiana de K. pneumoniae aislado de las
muestras se evaluaron usando la prueba de difusión en disco. Además, a partir
del cultivo, se extrajo ADN bacteriano genómico y se amplificaron los objetivos
específicos de la secuencia (genes TEM y SHV) usando el método de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR).
Resultados
De las 250 muestras de cucarachas recolectadas en varios hospitales, 179
muestras (71.60%) fueron positivas para K. pneumoniae . La reacción de PCR
se realizó usando cebadores de oligonucleótidos específicos (TEM-F, TEM-R y
SHV-F, SHV-R) para la amplificación de cada gen, y los productos
amplificados se visualizaron en electroforesis en gel de agarosa al 1%. De todas
las muestras amplificadas por PCR en esta investigación, 32 muestras (17.87%)
fueron positivas para TEM y 15 muestras (8.37%) fueron positivas para SHV.
Conclusión
La detección de los genes TEM y SHV usando métodos moleculares y su patrón
de resistencia a los antimicrobianos puede proporcionar información útil sobre
la epidemiología y los factores de riesgo asociados con la infección por K.
pneumoniae .
Palabras clave: cucarachas, Klebsiella pneumoniae , PCR, SHV, TEM
1. Introducción
Los estudios realizados en la 19 ª siglo han demostrado que los insectos tienen
un papel importante en la transmisión de enfermedades a los seres humanos, una
de las cuales se encuentran las cucarachas [1] . La mayoría de las cucarachas
están infectadas con bacterias patógenas que causan lepra, disentería, peste
bubónica, granos, abscesos e intoxicación alimentaria. Las cucarachas también
tienen una relación simbiótica con más de 100 especies de bacterias, 60 especies
de levadura, 90 especies de protozoos y 45 especies de gusanos
parásitos [2] . Los portadores importantes de bacterias incluyen la cucaracha
alemana ( Blattella germanica ) y la cucaracha americana ( Periplaneta
americana ). Las cucarachas alemanas, una de las plagas más comunes que
transportan bacterias patógenas, se han reportado hace muchos años.[3] . La
bacteria contaminante podría ser del aire, agua, comida o contacto con vectores
que albergan los patógenos. Las cucarachas permanecen en entornos sucios en
hogares, tiendas e incluso hospitales donde se guardan muestras tanto clínicas
como ambientales [4,5] .
Además, la importancia médica de las cucarachas es bastante sustancial. Se
encuentran entre las plagas médicamente importantes en entornos urbanos que
causan graves problemas de salud pública, y se han asociado especialmente con
un brote de disentería [6] . La mayoría de las bacterias patógenas se han aislado
recientemente de cucarachas,
como Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp., Pseudomonas
aeruginosa y K. pneumoniae [7,8] .
Klebsiella fue descubierto por primera vez por Karl Friedlander en
1882 [9] . Klebsiella consta de siete tipos, de los cuales K. oxytoca y K.
rhinoscleromatis se han demostrado en muestras clínicas humanas. K.
pneumoniae es un bacilo gramnegativo, en forma de vara, fermento lactosa, no
móvil y encapsulado de la familia Enterobacteriaceae [10,11] . Es un patógeno
oportunista que se encuentra en el agua, el suelo y las plantas; también existe
como una flora normal en las superficies de la mucosa, como los intestinos, la
faringe, la boca y la piel en los mamíferos. Esta bacteria también fue reconocida
como un patógeno pulmonar adquirido en la comunidad, principalmente entre
pacientes con antecedentes de alcoholismo crónico.[10,12,13] . En los
humanos, K. pneumoniae puede colonizar el tracto gastrointestinal, el intestino,
la vejiga, la piel o la faringe, lo que puede causar diversos resultados clínicos,
como neumonía, tromboflebitis, bacteriemia e infección del tracto
urinario [13] . Se han descrito casi 160 variantes de las penicilinasas TEM-1 y
TEM-2, muchas de las cuales muestran actividad contra las cefalosporinas de
espectro extendido [14] . Las enzimas de clase A están codificadas
principalmente por plásmidos, y las primeras que se describieron a nivel de
secuencia de aminoácidos fueron las enzimas TEM-1 y TEM-2 [15] .
La familia SHV se ha derivado de Klebsiella spp. SHV-1 se encuentra
universalmente en K. pneumonia [16] , evolucionó como un gen cromosómico
en Klebsiella spp., Y más tarde se incorporó a un plásmido, que se ha extendido
a otras especies de enterobacterias [17] . Un total de 40 tipos de SHV ya han
sido reportados [18] .
En esta investigación, identificamos la presencia de genes TEM y SHV en K.
pneumoniae aislado de cucarachas de hospitales de Shahrekord utilizando la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su patrón de resistencia
a antibióticos.
2. Material y métodos
2.1. Muestreo
Las cucarachas fueron recolectadas aleatoriamente durante 6 meses (enero-junio
de 2013), de seis hospitales ubicados en la provincia de Chaharmahal Va
Bakhtiari (Kashani Shahrekord, Imam Ali Farrokhshahr, Shohada Farsan, Imam
Reza Lordegan y Valiasr Boroujen). Se recolectó un total de 250 cucarachas de
diferentes partes de los hospitales por parte de manipuladores que usaban
guantes estériles. Las muestras de cucarachas vivas se llevaron inmediatamente
al Centro de Investigación Biotecnológica de la Universidad Islámica de Azad y
se mataron utilizando algodón empapado en cloroformo. Los tubos que
contenían las muestras se llenaron con etanol al 70% durante 5 minutos para
descontaminar su superficie externa y luego se dejaron secar al aire. A
continuación, las cucarachas se lavaron con solución salina normal estéril para
eliminar el residuo de etanol. Finalmente, se extrajeron sus vísceras con pinzas
estériles bajo un microscopio de disección, y los instrumentos fueron
esterilizados después de cada disección. El intestino de la cucaracha se mantuvo
en 2 ml de solución salina normal estéril durante 5 minutos para producir una
muestra homogeneizada.
2.2. Aislamiento bacteriano
Después de que las muestras se aislaron y se colocaron en tubos de ensayo que
contenían solución salina normal, el homogeneizado intestinal se mantuvo en
agua de peptona tamponada, después de lo cual las muestras se inocularon en
agar sangre y agar Mac-Conkey (MCA) y luego se incubaron durante 24 horas a
37 ° DO. Para el crecimiento de bacterias gramnegativas como K. pneumonia ,
se utilizó BPW que se inoculó en siete medios primarios (agar sangre de oveja,
agar chocolate, Mac-conkey, agar citrato de desoxicolato, agar SS, agar de sal
de manitol y lisina de xilosa Deoxicolato). Además, la identificación de
bacterias gramnegativas se logró mediante el uso de métodos estándar (API
System, bioMerieux, Marcy-l'Étoile, Francia). Los reactivos bioquímicos y la
prueba utilizada para identificar K. pneumoniaeincluido agar de triple azúcar
hierro, citrato de Simmons, indol, ureasa, motilidad y H 2 S. Las características
bioquímicas de K. pneumoniae identificadas fueron las siguientes: prueba de
utilización de citrato positivo, prueba de rojo de metilo negativo, prueba de
indol negativo, prueba de ureasa positiva, prueba positiva de Voges-Proskauer,
sacarosa, ácido y abundante producción de gas a partir de pruebas de glucosa,
lactosa, manitol, fermentación de azúcar y maltosa.
2.3. Recogiendo el cultivo de la susceptibilidad
Los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana se determinaron utilizando el
método de dilución en agar Mueller-Hinton, de acuerdo con las directrices del
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Los agentes
antimicrobianos probados incluyeron ceftazidima, ácido nalidíxico, cefixima,
gentamicina, amikacina, cefalexina e imipenem. Los puntos de corte CLSI se
utilizaron para la interpretación de concentraciones mínimas inhibitorias (CLSI
2012). Los resultados se interpretaron después de 24 horas de incubación a 37 °
C, como sensibles, de sensibilidad intermedia y resistentes de acuerdo con el
diámetro de la zona alrededor de cada disco de antibiótico.
2.4. Extracción de ADN y PCR
El ADN genómico de K. pneumoniae se extrajo utilizando el kit de extracción
de ADN (kit DNP; CinnaGen, Teherán, Irán) según las recomendaciones del
fabricante. El ADN extraído se cuantificó con medición espectrofotométrica a
una longitud de onda de 260 nm de acuerdo con el método descrito por
Sambrook y Russell [19] .
Para detectar los genes TEM y SHV, las reacciones de PCR se realizaron en un
volumen total de 25 l que contenía 2 l de la muestra de ADN, 1? M de cada
cebador, cloruro de magnesio 2 mM (MgCl 2 ), 5 l de 10 × AMS tampón de
PCR , DNTP 200 μM y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (CinnaGen Co.,
Teherán, Irán). El ensayo de PCR se realizó a 95 ° C durante 5 minutos y luego
durante 32 ciclos de 94 ° C durante 1 minuto, 58 ° C durante 40 segundos, 72 °
C durante 40 segundos y una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos , con
una retención final a 10 ° C en un termociclador (gradiente Mastercycler,
Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Para las amplificaciones SHV, las
condiciones para el ciclo térmico permanecieron iguales a excepción de la
temperatura de recocido (55 ° C). Las secuencias de cebador para TEM y SHV
se muestran en la Tabla 1 .

tabla 1

Cebadores para la identificación de genes TEM y SHV de Klebsiella pneumoniae .

Los productos amplificados se corrieron en gel de agarosa al 1% y se tiñeron

con bromuro de etidio (0,5 mg / ml) en una habitación oscura. El tampón de
electrodo utilizado fue Tris-borato-EDTA (TBE), que consiste en Tris-base 10,8
g 89 mM, ácido bórico 5,5 g 2 mM, EDTA (pH 8,0) 4 ml de EDTA 0,5 M (pH
8,0) (todos los componentes se combinaron en suficiente H 2 O y se agitó para
disolver). Se usó un marcador de peso molecular en escalera de 100 pb (Roche,
New Jersey, EE. UU.) Para medir el peso molecular de los productos
amplificados. Se aplicaron alícuotas (14 μL) de productos de PCR al gel. Se usó
un voltaje constante de 84 V durante 20 minutos para la separación del
producto. Las imágenes de las bandas de ADN teñidas con bromuro de etidio se
digitalizaron utilizando un sistema de documentación UVItec (UVItec, Paisley,
Reino Unido).
2.5. análisis estadístico
Todos los datos se analizaron mediante el uso de MS Excel 2007 y el software
SPSS (Versión 17, SPSS Inc., Chicago, EE. UU.), Y el valor de p se calculó
utilizando las pruebas exactas de Chi-cuadrado y Fisher para encontrar una
relación significativa. Un valor p de <0.05 se consideró estadísticamente
significativo.
3. Resultados
La calidad del ADN extraído de las muestras se examinó mediante análisis
electroforético a través de un gel de agarosa al 1%. De las 250 muestras de
cucarachas recolectadas en varios hospitales iraníes, 179 muestras (71,60%)
fueron infectadas con K. pneumoniae . Los genes TEM y SHV se amplificaron
con éxito con los cebadores TEM-F y TEM-R y SHV-F y SHV-R. La
electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR para los
genes TEM y SHV se muestra en las Figuras 1 y 2 , respectivamente. De las
muestras que se analizaron mediante PCR en esta investigación, solo 32
muestras (17.87%) fueron positivas para el gen TEM y 15 muestras (8.37%)
fueron positivas para el gen SHV ( Tabla 2 ). Además, la Tabla 3 muestra el
patrón de susceptibilidad antimicrobiana de K. pneumoniaeGenes TEM y
SHV. La susceptibilidad global de cepas aisladas de K. pneumoniae a agentes
antimicrobianos fue del 64,3% para el ácido nalidíxico, 65,4% para cefalexina,
69,8% para cefixima, 73,50% para gentamicina, 83,2% para ceftazidima, 85,1%
para amikacina y 100% para imipenem. De acuerdo con estos resultados,
imipenem, amikacina y ceftazidima fueron los agentes más eficaces contra K.
pneumoniae aislado .

Figura 1

Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
pneumoniae TEM. Carril M: escalera de ADN de 100 pb (Fermentase, Leon-Rot, Alemania); carriles 1, 2 y 5:

Figura 2

Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
pneumoniae . Carril M: escalera de ADN de 100 pb (Fermentase, Leon-Rot, Alemania); carriles 1, 3 y 4: prod

Tabla 2

Número de genes TEM y SHV de K. pneumoniae .

Tabla 3

Patrones de resistencia a antibióticos de los genes TEM y SHV de K. pneumoniae .

4. Discusión
Klebsiella se compone de siete tipos: K. pneumoniae , K. planticola , K.
terrigena , K. rhinoscleromatis , K. ozaenae , K. ornithinolytica y K. oxytoca, y
dos de estas especies, K. oxytoca y K. rhinoscleromatis , tienen demostrado en
muestras clínicas humanas [10, 11] . K. pneumoniae , una de las causas más
comunes de sepsis por gramnegativos, por lo general habita en el tracto
intestinal humano y animal [10,20] . Algunos bacilos gramnegativos como K.
pneumoniae y Escherichia colilas cepas de tipos particulares producen β-
lactamasas. La familia Enterobacteriaceae produce β-lactamasas, que están
codificadas por plásmidos. Entre las β-lactamasas más importantes están SHV y
TEM. Por primera vez, TEM-1 de un hemocultivo (Temonera) en Grecia se
aisló de E. coli [21,22] . Una de las primeras β-lactamasas informadas es TEM-
1, que está codificada por plásmidos; sin embargo, otras bacterias como Vibrio
cholerae y Haemophilus de P. aeruginosa y Neisseria también tienen la
capacidad de producirla. Hoy, los informes indican la prevalencia de TEM-1 β-
lactamasa en ciertas partes del mundo, lo que sugiere que este tipo de β-
lactamasa es un problema mundial [23,24] . De acuerdo con un estudio de 2011
de Shebani et al [24] , de 70 muestras de E. coli , 27 (38.58%) fueron BLEE
(betalactamasa de espectro extendido) positivas y 43 muestras (61.42%) fueron
BLEE negativas, y que solo hubo 10 muestras (37.04%) con el gen TEM-1 β-
lactamasa y 17 muestras (62.96%) estaban libres del gen TEM-1 β-
lactamasa [24] . TEM ha sido responsable de varios brotes no relacionados en
los Estados Unidos [25] y un brote recientemente informado en Europa con la
misma frecuencia [26] . Un estudio de Corea reveló que SHV es la BLEE más
común que se encuentra en Corea [27]. SHV (especialmente SHV-5) se
encuentra comúnmente y se informa en todo el mundo [27, 28] . En otro estudio
en India, la frecuencia reportada de Klebsiella spp. Productora de BLEE . estaba
entre el 6% y el 87% [29-31] .
En conclusión, nuestros resultados sugieren que el método de PCR puede usarse
para la detección específica, rápida, simple y altamente sensible de K.
pneumoniae en muestras. Además, K. pneumoniae aislado de cucarachas
recolectadas en varios hospitales tiene más resistencia al ácido nalidíxico. El
imipenem parece ser el único agente antimicrobiano que mostró una
sensibilidad del 100% y puede usarse como el fármaco de elección para este
tipo de infección.
Conflictos de interés
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada por el Diputado de Investigación de la
Universidad Islámica de Azad, Shahrekord. Agradecemos a todos los miembros
del personal del Centro de Investigación Biotecnológica de la Universidad
Islámica Azad de Shahrekord Branch por su apoyo en esta investigación.
Notas a pie de página
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la
licencia no comercial de atribución de Creative Commons
( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0 ) que permite el uso, la
distribución y la reproducción no comerciales sin restricciones en cualquier
medio, siempre que el trabajo original esté debidamente citado.
Información del artículo
Osong Public Health Res Perspect . 2015 Feb; 6 (1): 3-8.
Publicado en línea 2014 23 de diciembre. Doi: 10.1016 / j.phrp.2014.10.011
PMCID: PMC4346594
PMID: 25737824
Abbas Doosti , * Mohammad Pourabbas , Asghar Arshi , Mohammad
Chehelgerdi y Hamidreza Kabiri
Centro de Investigación Biotecnológica, Universidad Islámica Azad, Rama
Shahrekord, Shahrekord, Irán
Abbas Doosti: moc.oohay@khsoib
* Autor correspondiente. moc.oohay@khsoib
Recibido el 7 de septiembre de 2014; Revisado el 10 de octubre de
2014; Aceptado el 27 de octubre de 2014.
Copyright © 2015 Publicado por Elsevier BV en nombre de los Centros para
el Control y la Prevención de Enfermedades de Corea.
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la
licencia CC-BY-NC (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0).
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investigación de Osong se brindan aquí, cortesía de los Centros para el
Control y la Prevención de Enfermedades de Corea.
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