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INFLUÊNCIA DOS ADITIVOS ALIMENTARES NA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DE
PRODUTOS DE ALHO

Article · January 2009

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Yara Queiroz Rosana Aparecida Manólio Soares-Freitas

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 Alim. Nutr., Araraquara
v.17, n.3, p.287-293, jul./set. 2006
INFLUÊNCIA DOS ADITIVOS ALIMENTARES NA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE IN VITRO DE PRODUTOS DE ALHO*
RESUMO: A atividade antioxidante em produtos de alho
com e sem aditivos (ácido cítrico, metabissulfito de sódio e
benzoato de sódio) foi investigada. Extratos metanólicos de
alho picado sem sal (AP), picado com sal (APS) e misto -
mistura do alho in natura com o desidratado (AM) - foram
avaliados quanto ao teor de fenólicos totais e atividade
antioxidante com os métodos DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazil), sistema -caroteno/ácido linoléico e
Rancimat®. O teor de fenólicos totais do extrato em base
seca foi significativamente maior (p<0,05) para todos os
produtos que não continham os aditivos. Em relação à
atividade antioxidante, as amostras com aditivos
apresentaram melhores resultados em todos os testes.
Concluiu-se que, apesar do teor de fenólicos totais ser maior
nas amostras sem aditivos, a presença de aditivos aumentou
o potencial antioxidante dos produtos de alho.
PALAVRAS-CHAVE: Alho; atividade antioxidante;
aditivos alimentares; DPPH; Rancimat®; sistema -caroteno/
ácido linoléico.
INTRODUÇÃO
O alho (Allium sativum) foi descoberto no Egito, na
data de 3.700 a.C., quando era empregado como
medicamento.8,14 Este vegetal pertence à família Liliaceae,
que contém mais de 700 espécies, incluindo a cebola, o alho-
poró e a cebolinha.5
Segundo a Legislação10, o alho é considerado uma
especiaria. Por definição, especiarias são os produtos
constituídos de partes (raízes, rizomas, bulbos, cascas, folhas,
flores, frutos, sementes e talos) de uma ou mais espécies
vegetais, tradicionalmente utilizadas para agregar sabor ou
aroma aos alimentos e bebidas.
O consumo de produtos obtidos a partir do alho in
natura aumentou nos últimos anos, não só por ser apreciado
_________________
* Trabalho elaborado com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - Processo no 04/01187-8).
** Departamento de Nutrição da Faculdade de Saúde Pública - Universidade de São Paulo - Campus de São Paulo - 01246-904 - São Paulo
- SP - Brasil.
*** Departamento de Nutrição - Programa Interunidades (PRONUT- FCF/FEA/FSP) - Universidade de São Paulo - Campus de São Paulo
- 05508-900 - São Paulo - SP - Brasil.
ISSN 0103-4235
Yara Severino de QUEIROZ**
Deborah Helena Markowicz BASTOS**
Geni Rodrigues SAMPAIO***
Rosana Aparecida Manólio SOARES**
Emília Yasuko ISHIMOTO**
Elizabeth Aparecida Ferraz da Silva TORRES**
como especiaria, mas também devido às suas qualidades
benéficas como a atividade antioxidante.9,13,15,16,28 A atividade
antioxidante das plantas da família Allium tem sido motivo
de vários estudos. Alho e seus extratos têm demonstrado
propriedade antioxidante em diferentes modelos in vitro,15, 28, 30 a
qual é atribuída aos compostos organosulfurados e seus
precursores,16,17 bem como as substâncias fenólicas. Vários
estudos demonstraram que a alicina, S-alilcisteína, S-
alilmercaptocisteína, dialil sulfito (DAS), dialil dissulfito
(DADS), e o dialil trisulfito são compostos voláteis presentes
no alho e que possuem atividade antioxidante.9,13,16
A principal perda de qualidade do processamento do
alho é causada pelo seu escurecimento que ocorre devido à
ação da enzima polifenoloxidase sobre os compostos
fenólicos. Estes são oxidados à ortoquinonas que se
polimerizam em melaninas, os quais conferem a coloração
escura ao produto.7
A indústria de alimentos tem sido beneficiada pelo
desenvolvimento de novas substâncias que podem ser
adicionadas aos alimentos com o objetivo de melhorar a cor,
o aroma, a textura e o sabor. Estas substâncias são conhecidas
como aditivos alimentares que correspondem a qualquer
substância presente por adição, intencional ou não, a um
alimento, com finalidades tecnológicas como conservação
contra deteriorações bacterianas, proteção contra alterações
oxidativas e fornecimento de características sensoriais.6,23
O ácido cítrico, aditivo normalmente adicionado ao
alho, é um acidulante versátil, hidrossolúvel, sequestrante
de íons metálicos (prevenindo reações indesejáveis de
oxidação de cor e aromas), antioxidante, seguro na
manipulação, inócuo do ponto de vista de saúde e pouco
corrosivo para as instalações industriais.23 Sua utilização se
constitui em uma alternativa simples e segura para o
processamento industrial dos produtos de alho,7,18 nos quais
também são adicionados os conservadores benzoato de sódio
e metabissulfito de sódio. Tanto o ácido cítrico quanto seus
sais são eficazes contra bolores e leveduras. A maior
287
solubilidade em água e a não interferência na coloração
tornam o benzoato de sódio o mais utilizado. Os benzoatos
têm a propriedade de serem inócuos para o emprego
em alimentos, em um nível máximo de 0,3 g/100 g.2,6,12,23,26
Outro conservador muito utilizado em alimentos é o dióxido
de enxofre (SO2) e seus derivados. Atualmente esse gás é
raramente utilizado, sendo substituído por outros compostos
geradores de dióxido de enxofre (SO2) como o sulfito de
sódio (Na 2 SO 3 ), sulfito ácido de sódio (NaHSO 3 ) e
metabissulfito de sódio (dissulfito de sódio - Na2S2O5). Os
sais de sulfito possuem a vantagem de serem facilmente
manuseáveis e quando dissolvidos em água formam ácido
sulfuroso, íon bissulfito e íon sulfito, que agem sobre
bactérias e fungos. Os metabissulfitos são mais estáveis que
os bissulfitos.2,6,12,23,26 O metabissulfito de sódio, além de atuar
como antimicrobiano, antioxidante por prevenir a oxidação
(seqüestrador de oxigênio e agentes redutores), inibidor das
enzimas proteases, oxidases e peroxidases, também atua
como agente quelante.22
A busca por produtos prontos para consumo cresceu
na última década, incentivando o desenvolvimento de
tecnologias que permitissem a fabricação do alho com
qualidade. O processamento do alho em pasta ou picado
pronto para consumo, de modo que se mantenha estável à
temperatura ambiente, facilita a sua utilização pelo
consumidor. A tecnologia empregada permite que o alho e
seus produtos apresentem como vantagens a segurança
microbiológica e manutenção das características sensoriais.
Apesar do uso de aditivos ser permitido nos produtos de
alho, estes devem ser utilizados na menor dose possível.2,23
Neste estudo, o objetivo foi avaliar a influência dos aditivos
alimentares utilizados normalmente nos produtos de alho
sobre a atividade antioxidante.
alho in natura –
aquisição CEAGESP
amostras com aditivos*
alho picado sem sal
(AP)
alho picado com sal - 2%
(APS)
alho misto
(AM)
* Para cada 10 kg destes produtos foram utilizados 800 g de ácido citríco, 15 g de metabissulfito de sódio e 6 g de benzoato de sódio.
FIGURA 1 - Esquema das amostras obtidas dos produtos de alho com e sem aditivos.
288
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de alho in natura (Allium sativum)
foram obtidas da Companhia de Entrepostos e Armazéns
Gerais de São Paulo (CEAGESP). O local de plantio das
amostras foi na região de Curitibanos - SC no período de
julho de 2004 e a colheita em dezembro do mesmo ano. A
classificação do produto é grupo - nobre; subgrupo - roxo;
classe - 7. Posteriormente, estas amostras foram enviadas
para uma empresa processadora de alho em escala
industrial, onde as amostras foram processadas, conforme
descrito na Figura 1.
As características específicas dos produtos de alho
estão apresentadas abaixo:
• Alho picado sem sal (AP): alho in natura picado;
• Alho picado com sal (APS): alho in natura picado
adicionado de 2% de sal (m/m);
• Alho misto (AM): este produto é uma mistura do in natura
picado com o desidratado, na proporção 1:5 (m/m).
O alho desidratado é proveniente da China cujas
informações sobre a sua variedade botânica não foram
disponibilizadas pela empresa fornecedora das amostras, pois
a mesma não dispunha deste dado.
Obtenção dos extratos
A obtenção do extrato metanólico para avaliar a
atividade antioxidante e o teor de fenólicos totais dos
produtos de alho baseou-se no método descrito por Nuutila
et al.21 com modificações. Foram pesadas 3 g de amostra e
adicionados 20 mL de metanol. A amostra foi mantida por
uma hora sob agitação e posteriormente ultrassonificada
(ultrasson marca Thornton) por 20 minutos, sendo em seguida
amostras sem aditivos
alho picado sem sal
(AP)
alho picado com sal - 2%
(APS)
alho misto
(AM)
filtrada utilizando papel filtro (marca Nalgon, diâmetro 12,5
cm e porosidade 3 Un). O sobrenadante foi recolhido em
balão volumétrico de 50 mL. O resíduo retido no filtro foi
re-extraído, e o segundo sobrenadante adicionado ao
primeiro. Outros 10 mL de metanol foram utilizados numa
terceira extração e, após essa etapa, o resíduo foi descartado.
O volume final foi levado a 50 mL com metanol.
Posteriormente, foi determinada a matéria seca (em mg/mL)
dos extratos pelo método gravimétrico. O volume de 1 mL
do extrato foi transferido para vidro relógio, previamente
tarado, e este foi colocado em estufa a 105oC, por 16 horas,
seguido de resfriamento em dessecador e pesagem, sendo a
operação repetida até peso constante4. A finalidade de
determinar a matéria seca se deve à padronização da
concentração das diferentes amostras para avaliação da
atividade antioxidante.
Os extratos metanólicos foram condicionados em
frascos âmbar, secos sob atmosfera de nitrogênio para evitar
a oxidação e armazenados à -18oC até o momento das análises.
Caracterização dos extratos
O teor de fenólicos totais presente nos extratos dos
produtos de alho com e sem aditivos foi determinado de
acordo com o método descrito por Nuutila et al.21 utilizando-
se o reagente de Folin-Ciocalteu (Merck). Em tubos de
ensaio, foram adicionados 400 µL do extrato, 400 µL de
metanol, 400 µL de Folin-Ciocalteu e 2000 µL da solução
de carbonato de sódio (20% m/v). A mistura foi
homogeneizada em agitador de tubos, sendo adicionados
mais 800 µL da solução de carbonato de sódio (20% m/v).
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas (centrífuga
marca ALC, modelo 4239R - Itália) por 3 minutos a 14000
rpm e mantidas em repouso por 20 minutos à temperatura
ambiente. A análise foi feita em espectrofotômetro UV-
visível, (Micronal, modelo B 542). Foi empregado como
padrão o ácido gálico. O cálculo do teor de fenólicos foi
realizado através da elaboração da curva padrão do ácido
gálico (0,005 a 0,03 mg/mL). Os resultados obtidos foram
expressos em µg equivalentes de ácido gálico/mg de matéria
seca.
Atividade antioxidante
Para todos os testes de atividade antioxidante (ensaio
radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil - DPPH; sistema
-caroteno/ácido linoléico; avaliação da capacidade protetora
da oxidação lipídica utilizando o aparelho Rancimat®), foi
utilizada a concentração de 1 mg de matéria seca por mL de
extrato.
Ensaio com DPPH
A capacidade das amostras em sequestrar radicais
livres foi determinada através do ensaio DPPH (1,1-difenil-
2-picrilhidrazil), descrito por Yamaguchi et al. 27 com
modificações. Uma alíquota de 1,5 mL da solução metanólica
de DPPH na concentração de 20 mg/mL foi adicionada à
750 µ L dos extratos das amostras. O decréscimo da
absorbância a 517 m foi monitorada em espectrofotômetro
em diferentes intervalos de tempo (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 e
20 minutos).
Para se calcular a porcentagem da atividade
antioxidante (AA) foi utilizado o valor de absorbância no
tempo de 20 minutos pela fórmula abaixo:
% AA = {[(abs. do branco do DPPH) - (abs. final da amostra
- abs. do branco da amostra) ] / abs. do branco do DPPH} x 100
onde: abs. = absorbância
Branco do DPPH = 750 µL de metanol + 1,5 mL da solução
de DPPH
Branco da amostra = 750 µL da amostra + 1,5 mL de metanol
Sistema -caroteno/ácido linoléico
Para determinar a atividade antioxidante pelo sistema
-caroteno/ácido linoléico, foi utilizada a metodologia
descrita por Marco19 e modificada por Miller20 empregando-
se como substrato a solução de -caroteno/ácido linoléico.
Em 28 µL da solução de -caroteno foi adicionada 28 µLde
ácido linoléico e 200 mg de Tween 40. Em seguida, o
clorofórmio foi evaporado sob atmosfera de nitrogênio e
acrescentado 140 mL de água oxigenada (água destilada
tratada com oxigênio por 30 minutos). No tubo de ensaio,
5 mL desta solução foi adicionada a 1 mL dos extratos. Após
ser homogeneizado, a leitura foi feita em espectrofotômetro
a 470 m, sendo esta a leitura do tempo zero (tempo inicial).
Os tubos foram então colocados em banho-maria (50oC) e
as próximas leituras foram feitas a cada 15 minutos, até atingir
o tempo de 2 horas.
A atividade antioxidante, expressa como porcentagem
de inibição da oxidação lipídica (% IOL), foi calculada em
relação a 100% da oxidação do controle (sem antioxidante)
utilizando a fórmula abaixo:
% IOL = 100 - [(absorbância inicial da amostra - absorbância
final da amostra)/ (absorbância inicial do controle -
absorbância final do controle)] x 100
Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica
utilizando o aparelho Rancimat®
Para avaliar a capacidade protetora utilizou-se o
aparelho Rancimat® 743, marca Metrohm, conectado ao
programa PC: 743 Rancimat® 1.0, onde foi medido o
período de indução da banha de suíno contendo o extrato
metanólico, segundo Antolovich et al.1 Um miligrama de
sólidos solúveis foram colocados nos tubos do aparelho
Rancimat® e evaporados sob atmosfera de nitrogênio. Em
seguida, 3g de banha de suíno sem antioxidante foram
adicionados em cada tubo e a mistura homogeneizada por
15 minutos em ultrasonificador. Depois, com a programação
de temperatura de 110 oC 1,5 oC, fluxo de ar de 20 L/h, os
tubos foram acoplados ao aparelho Rancimat®, até que a
curva de condutividade em relação ao tempo de indução
289
fosse finalizada para se calcular o Índice de Atividade
Antioxidante (IAA). O controle foi testado com a banha de
suíno sem adição de antioxidante.
Tratamento estatístico dos dados
Os resultados foram apresentados como média
desvio padrão. Para comparar os produtos de alho com e
sem aditivos foi realizado o teste t-student. Todas as análises
foram realizadas em triplicata, exceto o método utilizando o
aparelho Rancimat, para o qual realizaram-se em duplicatas.
O nível de significância estabelecido para todos os testes
estatísticos aplicados foi de 5% utilizando o "software"
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão
10.0 for Windows.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 1 estão apresentados os resultados dos
teores de fenólicos totais dos extratos metanólicos dos
produtos de alho com e sem aditivos. Todos os produtos
com aditivos apresentaram menor teor de compostos
fenólicos em relação àqueles sem aditivos (p < 0,05).
Provavelmente ocorreu uma interação entre os aditivos e
os compostos fenólicos do alho, uma vez que nenhum dos
aditivos presentes no alho se classifica como composto
fenólico. Segundo Araújo2 o aditivo metabissulfito reage
rapidamente com vários compostos. Este aditivo é o
principal composto utilizado na conservação de alimentos,
gerando o dióxido de enxofre (SO2) e seus ânions bisulfito
(HSO3-) e sulfito (SO32-). As reações químicas originadas
quando o dióxido de enxofre é adicionado aos alimentos
são complexas, sendo convertido, principalmente, a íon
Tabela 1 - Teores médios e desvio padrão (dp) de fenólicos totais dos extratos (em relação a
matéria seca) dos produtos de alho com e sem aditivos.
Alho
( g/mg/EAG*) em relação a
Alho picado com
(AP) aditivos
sem
aditivos
Alho picado com sal com
(APS) aditivos
sem
aditivos
Alho misto com
(AM) aditivos
sem
aditivos
* EAG = equivalentes de ácido gálico.
** p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.
290
bissulfito (HSO 3-). Este íon pode permanecer livre e
disponível para retardar a formação de compostos típicos
da reação de Maillard, como as melanoidinas, e pode
também se ligar, reversivelmente, a certos compostos,
como os grupos carbonilas de aldeídos. 25 De acordo com
Carbonell-Barrachina et al.11 quando o alho in natura é
picado ocorre a oxidação dos compostos fenólicos,
formando as quinonas que apresentam coloração marrom.
Os aditivos, como ácido cítrico, bisulfito de sódio, entre
outros, podem retardar a oxidação dos compostos
fenólicos, inibindo a formação destes compostos
indesejados (quinonas) que alteram a cor do produto. Tal
não foi observado neste estudo.
Na Tabela 2 estão apresentados os valores da atividade
antioxidante, pelo ensaio DPPH, dos extratos das amostras
com e sem aditivos. O alho picado sem sal (AP) e o picado
com sal (APS) com aditivos apresentaram melhor atividade
antioxidante quando comparados às mesmas amostras sem
aditivos. O alho misto (AM) com e sem aditivos não
apresentou diferença estatisticamente significante. Apesar
dos produtos com aditivos possuirem menor teor de
compostos fenólicos do que os sem aditivos, os primeiros
apresentaram melhor atividade antioxidante.
Este resultado se justifica pela presença do ácido
cítrico e do metabissulfito de sódio, aditivos empregados
nas amostras, os quais atuam como antioxidantes. O ácido
cítrico pode apresentar sinergismo com outras substâncias
que possuem ação antioxidante, conforme relatado por
Silva.23 Assimopoulou et al.3 relataram que o ácido cítrico
apresentou sinergismo com os compostos antioxidantes
presentes na resina Pistacia lentiscus, que é um produto
natural com proposta de uso farmacêutico.
Pelos resultados do sistema -caroteno/ácido linoléico
(Tabela 3), constatou-se que as amostras de AP, APS e AM
Fenólicos totais do extrato Nível de
significância
matéria seca (p)**
6,36 (0,54)
0,000
8,97 (0,25)
4,78 (0,37)
0,000
6,13 (0,09)
6,21 (1,10)
0,005
8,36 (0,63)
 Tabela 2 - Valores médios e desvio padrão (dp) da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do
extrato metanólico dos diferentes produtos de alho com e sem aditivos.
Alho Atividade Nível de
antioxidante (%) significância
(p)*
Alho picado (AP) com aditivos 28,80 (4,11)
sem aditivos 17,16 (0,18) 0,005
Alho picado com sal (APS) com aditivos 23,11 (1,78)
sem aditivos 19,08 (0,43) 0,024
Alho misto (AM) com aditivos 24,92 (4,76)
sem aditivos 25,36 (0,22) 0,880
* p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.

Tabela 3 - Valores médios e desvio padrão (dp) da porcentagem de inibição da oxidação lipídica
(% IOL), pelo sistema -caroteno/ácido linoléico, dos produtos de alho com e sem aditivos.
Alho % IOL Nível de significância
(p)*
Alho picado (AP) com aditivos 34,42 (4,47)
sem aditivos 30,21 (0,56) 0,050
Alho picado com sal (APS) com aditivos 38,11 (2,56)
sem aditivos 26,51 (1,56) 0,012
Alho misto (AM) com aditivos 40,94 (4,94)
sem aditivos 37,38 (1,10) 0,025
*p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.

Tabela 4 - Valores médios e desvio padrão (dp) do índice de atividade antioxidante (IAA), medido
pelo aparelho Rancimat®, dos produtos de alho com e sem aditivos.
Alho IAA* Nível de significância
(p)**
Alho picado (AP) com aditivos 1,66 (0,13)
sem aditivos 1,62 (0,08) 0,642
Alho picado com sal (APS) com aditivos 1,35 (0,08)
sem aditivos 1,38 (0,13) 0,704
Alho misto (AM) com aditivos 1,39 (0,12)
sem aditivos 1,21 (0,07) 0,071
* IAA = tempo de indução (h) da amostra / tempo de indução (h) do controle.
** p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.

com a presença de aditivos, apresentaram melhor eficiência
na inibição da oxidação lipídica do que as amostras sem
aditivos.
Em relação ao índice de atividade antioxidante
(Tabela 4), não houve diferença significativa entre às
amostras de alho picado sem sal, com sal e misto com a
adição de aditivos quando comparadas as amostras sem
aditivos. Assim, observou-se que no teste utilizando o
aparelho Rancimat ® a presença do ácido cítrico e do
metabissulfito de sódio não causou o mesmo impacto
verificado nos outros dois métodos. É possível que a
atuação do ácido cítrico e do metabissulfito de sódio como
antioxidantes seja dependente do perfil lipíco do substrato
ou das condições de oxidação do meio. No Rancimat® é
utilizada a banha de suíno, rica em ácidos graxos saturados
(60%), enquanto que no sistema -caroteno/ácido linoléico
utiliza-se somente o ácido linoléico, ácido graxo
poliinsaturado. Adicionalmente, no Rancimat® há um fluxo
contínuo de oxigênio, que influencia a ligação do dióxido
de enxofre, podendo oxidá-lo, irreversivelmente à sulfato,
diminuindo a atuação deste aditivo.29
Desta forma, a atividade antioxidante in vitro deve
ser avaliada com diferentes testes. Contudo, todos estes
ensaios baseados em reações químicas diferentes oferecem
resultados diferentes, conforme verificado no presente estudo
e por Sun & Ho,24 onde estes autores estudaram os diferentes
extratos de trigo sarraceno utilizando três métodos para
avaliar a atividade antioxidante.

291
CONCLUSÕES
A presença de aditivos na amostras de alho pode ter
contribuído para a redução do teor de fenólicos totais através
de uma possível interação destes aditivos com os fenólicos.
A adição do ácido cítrico e do metabissulfito de sódio
nos produtos de alho contribuíram de modo significativo para
o efeito antioxidante avaliado pelos ensaios DPPH e sistema
-caroteno/ácido linoléico. Tal não ocorreu com o método
que utiliza o aparelho Rancimat®, provavelmente, devido aos
diferentes perfis lipídicos dos substratos e às diferentes
condições metodológicas.
QUEIROZ, Y. S.; BASTOS, D. H. M.; SAMPAIO, G. R.;
SOARES, R. A. M.; ISHIMOTO, E. Y.; TORRES, E. A. F.
S. Role of additives in vitro antioxidant activity of garlic
products. Alim. Nutr., Araraquara, v.17, n.3, p. 287-293,
jul./set.2006.
ABSTRACT: The antioxidant activity in garlic products
with and without additives (citric acid, sodium metabissulfite
and sodium benzoate) was investigated. Different methanolic
extracts of garlic were evaluated: chopped with salt (CWS),
chopped with no salt (CNS), fried (F) and mixed (M), i.e.,
in natura garlic with dehydrated garlic. Total phenolic
compounds in the samples were measured, and the
antioxidant activity were evaluated using three different
methods: DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) assay, -
carotene/linoleic acid system and Rancimat® method. The
total phenolics content of the extracts in relation to the
dried residue was significant higher (p<0,05) in all
samples with no additives. Regarding to the antioxidant
activity, the samples with additives showed better results in
all tests. We concluded that, although the higher content of
phenolic compounds in the samples with no additives, the
presence of additives improved the antioxidant potential in
garlic products.
KEYWORDS: Garlic; antioxidant activity; food additives;
DPPH; Rancimat®; -carotene linoleic acid.
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