CROMATOGRAFÍA PLANA

Se llama cromatografía plana porque la superficie en la cual se va a desarrollar el proceso cromatográfico, es una
superficie plana (puede ser una hoja de papel, hoja de aluminio, hoja de vidrio (una hoja metálica).

cuando hablamos de Cromatografía Plana, hablamos de 2 tipos de cromatografía:

- Cromatografía en papel

- Cromatografía en capa fina (CCF) o cromatografía en capa delgada (CCD)

La cromatografía es un método de separación o aislamiento de compuestos, por medio de procesos adicionales podemos
identificar un compuesto, en instrumental la cromatografía tradicional es netamente cuantitativa. Ojo que la
cromatografía separa compuestos que por métodos tradicionales no se pueden separar, métodos tradicionales como por
ejemplo un método de destilación, método de extracción por solventes, por un método de precipitación.

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución entre dos fases
(F.E y F.M, fases inmiscibles que no se mezclan entre ellas, pueden tener interacción, pero no se mezclan es como el agua
y el aceite), una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil (porque los solventes se desplazan a través de la F.E,
la F.E es un lecho por el cual recorre la F.M o el sistema de solventes) Varios tipos de cromatografía son posibles,
dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas.

Se aplican varios criterios

• De acuerdo al soporte, si el soporte es una hoja (CP) o una columna (CC)

• De acuerdo al tipo de equilibrio que se establece en la separación, es una cromatografía de adsorción, una
cromatografía de distribución, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, una cromatografía
de difusión de geles, de acuerdo a las interacciones que hay internamente

• De acuerdo al estado de agregación de la fase estacionaria, cromatografía gaseosa o cromatografía liquida

CROMATOGRAFÍA PLANA:
La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Se clasifica en:

- Cromatografía en papel

- Cromatografía en capa fina o cromatografía en capa delgada (CCD) o TLC (en inglés)

CLASIFICACIÓN DE LA F.E:
 Agua soportada en un papel, en la C. Papel la F.E normalmente es en papel, tendría que secar el papel en una estufa
luego lo pongo en un secador y trabajar inmediatamente, entonces ahí se da una cromatografía de adsorción (el papel
es la F.E).
 El absorbente sobre un soporte, cuando el absorbente y si la F.E esta sobre un soporte (pudiendo ser una lamina de
vidrio, de plástico o de metal). Y la F.E puede ser Gel de sílice, poliamida, almidón, silica gel.
Generalmente en la CCF se pueden desarrollar todos los mecanismos de separación (cromatografía de adsorción,
cromatografía de afinidad, cromatografía de distribución, cromatografía de difusión de gel, cromatografía de partición).
La CCF me permite hacer la HPTLC (CCF de alta performance, en inglés) porque puedo bajar el tamaño de la partícula
por debajo de los 0.1 µ (micrones) significando que va a ver una gran interacción.

Cuando se habla de alta resolución (en español), la resolución es en la cromatografía resuelve las mezclas de los
compuestos, entonces si lo has resuelto, lo has separado en esos compuestos.
 Mecanismos de separación (esquema)

En cromatografía de adsorción, el soluto es adsorbido a la superficie de la F.E, al pasar a la F.M algunos se arrastrarán mas
que otros, porque la capacidad de adsorción es diferente (unos se adsorben mas fuerte otros mas débil) es decir al pasar
por la F.M por las diferentes afinidades unos se van a salir más rápidos y otros más lento).

En cromatografía de partición o cromatografía de distribución, porque tanto la F.E como la F.M van hacer líquidos, lo que
se da generalmente en una cromatografía en papel. DIAPO; el soluto esta disuelto en el líquido (que es la F.E) que esta
adherido o pegado en la superficie del soporte sólido, en la imagen se ve que algunos puntos se han disuelto en el
soporte y otros están disueltos en la F.E, como hay diferente capacidad de partición (uno se va a un lado y otro se va a
otro lado).

El mecanismo de partición mas fácil, es cuando utilizamos un embudo de decantación (pera de bromo) y ponemos unos
solventes (aceite y agua) formando 2 fases inmiscibles, pero cuando yo eche un compuesto (aspirina) parte de ella se ira
al aceite y otro al agua, lo mezclo formando una emulsión (mezcla de 2 líquidos inmiscibles) y luego se separa. Cuando
abro la llave y saco la fase acuosa y un poco de aspirina se me quedo en la fase oleosa, sin embargo, vuelvo a echar agua,
lo agito y parte de aspirina que quedo en la fase oleosa pasa a la fase acuosa (proceso continuo) esto se da en una
cromatografía liquido-liquido.

En cromatografía de intercambio iónico, se intercambian de acuerdo a las cargas catiónicas o aniónicas.

En cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de permeación o cromatografía de gel, separa de acuerdo al

tamaño de las moléculas.

Cromatografía de afinidad, se relaciona con el sistema llave-cerradura, en donde la F.E es el sustrato y la F.M son las
enzimas. Es decir, una llave solo le hace a una cerradura, en donde en la F.E se fija ciertas enzimas entonces solo retiene
aquellos sustratos que interaccionan con esa enzima o viceversa.

Aspectos históricos

Cromatografía en papel

- Fue desarrolla por Martin.

- Tiene como soporte un papel de celulosa.
- Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeñas de muestra (miligramos y
microgramos).
• Consden, Gordon y Martin (1940), sustituyeron el silicagel por tiras de papel, sembraron:

o Compuestos hidrosolubles (por ende, son compuestos polares), ácidos orgánicos e iones metálicos.
o El principio de partición cuando estamos hablando de la solubilidad, entonces es una cromatografía de partición o
cromatografía de distribución.
o Cantidad de la muestra necesaria 10-3 a 10-6 g o también 1mg=1x10-3, y un 1µg=10-6 g
o Tipos: ascendente (abajo hacia arriba), descendente (arriba hacia abajo), bidimensional (ósea una cromatografía en 2
dimensiones), circular.
 F.M. – Está constituido por un sistema de solventes (mezcla de solventes)
 F.E. - Agua retenida en la celulosa (papel Whatman es el más adecuado, está en forma circular, tiene tramas casi
homogéneas por eso permite una mejor separación)
 Métodos de detección (1ermetodo, el visual, si los compuestos son coloreados, 2do método, usar reactivos
cromógenos, un compuesto que coloreo apareciendo manchas) físico-químicos. El problema es que los reactivos
cromógenos son limitados, hay reveladores universales como los vapores de iodo, el H2SO4 (no se utiliza porque
quema el papel) y específicos (para un tipo de compuestos), por ejemplo, si trabajo con aa. uso Ninhidrina y solo me
aparecen coloreados los aa, así haiga otros compuestos en la separación, si he separado azucares uso antrona,
coloreándose solo los azucares. Para compuestos poli fenólicos, FeCl3
 Análisis cualitativo: identifico los compuestos por Rf (factor de retención) se halla: Distancia recorrida de la
muestra/distancia recorrido por el solvente. Parámetros para identificación en cromatografía plana en general es el Rf
- el problema que tiene el Rf en una cromatografía en papel es la reproducibilidad, se llego a tapar el tubo de ensayo
(cámara cromatográfica) con papel aluminio para hay que saturar los vapores para agarrar el equilibrio de la zona,
existiendo diversos factores que hacen que el Rf varié ya sea por usar más o poco solvente, por ser compuestos
volátiles, etc. Entonces es difícil obtener reproducibilidad constituida por la precisión, es difícil que esto sea
reproducible.
 Análisis cuantitativo: a través de un densitómetro, extracción de los solutos, lo extraigo y lo llevo a otro proceso para
cuantificarlo porque directamente no me permite cuantificar, lo que puedo hacer es un semi-cuantitativo.
Cromatografía en capa fina
 Fue originada en 1938 por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.
 Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas.
 En este tipo de cromatografía la F.E se extiende sobre un soporte inerte (vidrio, metal, plástico).
 Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos, este alemán hizo un aparto por
donde sale unas placas homogéneas que regulaba la superficie, existiendo una CCF preparativa, analítica, y
semianalítica por el grosor y la homogeneidad de la superficie en la F.E o del solvente sobre el soporte.

Cromatografía en Capa Delgada (fina)

 Izmailov y Shraiberen en 1938 describieron los principios de CCF, llegaron a separar los colorantes que había en la
yema de huevo.
 Usaron oxido de aluminio sobre soportes como placas de cristal.
 Reitsema usa placas de vidrios anchas (cromatofolios, hoja para cromatografía)
 Fue reconocida a partir de los trabajos de Stahl.
o Método rápido (es entre 20 y 40 min.) con respecto a la cromatografía en columna tradicional.
o Uso de diversos agentes cromogénicos, ósea hay varios compuestos para revelar, aquí si se puede usar los vapores
de H2SO4, antrona, MO4.
o Mayor sensibilidad que la cromatografía en papel (10-9 g, nanogramos)
o Gran gama de compuestos que pueden ser analizados, se utiliza todo menos compuestos volátiles.
o Método simple y barato con respecto a otro método de análisis.
o F.M. - Está constituido por un sistema de solventes
o F.E - Adsorbentes (entre los tipos de adsorbentes tenemos: sílica gel, alumina, celite, almidón, etc.)
o Métodos de detección: físico-químicos, por colorantes, radiación gamma, radiación ultravioleta.
o Principio: Adsorción (polaridad), partición, afinidad, intercambio iónico, exclusión. Mientras que en la
cromatografía en papel solo era de partición.

Requerimiento de la muestra:

Detectable en el cromatograma, es decir que pueda tener un reactivo donde se puede visualizar o pueda tener un
reactivo que lo pueda revelar para observarlo.
Soluble en la FM, la F.M arrastra los componentes, los solutos que quiero separar a través de la F.E y para arrastrarla
tiene que tener un mínimo de solubilidad, un mínimo de afinidad.
Estable a la luz, ya que si no lo es se degrada obteniendo otro compuesto.
Estable al oxígeno, ya que siembre se hace en el aire y si reacciona tendré otro compuesto.
Estable al solvente, porque si lo siembro y va a reaccionar con el solvente lo que voy a tener es otro compuesto.
Y no ser volátil, porque si lo siembro y si es volátil no se va a poder separar.
REVELADORES MÁS COMUNES PARA CCF
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles porque son coloreadas; las incoloras pueden revelarse
mediante:
• Por luz UV: absorbe luz ultravioleta y se puede usar una F.E impregnada con un indicador fluorescente (para una
longitud de onda de 254 nanómetros que se llama longitud de onda corta o F254, mientras una longitud de onda larga
F366), el número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado, del
indicador que va a florecer.
• La introducción de la placa en vapores de yodo (revelador universal).
• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una
campana de extracción de gases) porque ya que el H2SO4 vota vapores dañinos.
• Después que se hace esto, se calienta.

ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones, es el más usado)
b) Óxido de Aluminio o Alúmina (que puede ser ácida, neutra o básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
Para la selección del adsorbentes debe tomar las siguientes consideraciones:
a) Polaridad, que polaridad tiene el adsorbente, en que polaridad son las sustancias que quiero separar
b) Cual es el tamaño de partícula del adsorbente, de acuerdo al tamaño puedo hacer una cromatografía preparativa,
analítica o semianalitica.
c) Diámetro
d) Área Superficial
e) Homogeneidad de la placa, siendo el responsable el alemán Stahl.

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CCF.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la F.E, por ejemplo, cuando caliento agua con
azúcar disuelvo más azúcar porque la T° aumenta la dispersión de los solventes de las moléculas y permite que los solutos
se introduzcan más fácilmente en la estructura de solvente
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire por esta razón se tapa la cámara
cromatográfica porque si mueven la F.M se dan corrientes dispersas (al igual que las olas del mar), se sale la F.E del
soporte, por eso se debe de evitar las corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas, muchas placas están contaminadas con grasa (de la mano) o agentes plastificantes o adhesivos
(cuando se coloca sobre él soporte se utilizan varios agentes). Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben limpiarse
corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar completamente antes de aplicar la
muestra.
d) Pureza de los disolventes (es fundamental), dijimos que había solventes comerciales, solventes Q.P, solventes para
análisis, solventes espectroscópicos y grados cromatográficos o solventes de mas alta pureza como los solventes de HPLC.