You are on page 1of 118

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MEDELLIN

.' F A C U L TA D DEC lEN C I· A S


,i DEPARTAMENTO DE BIOLOGiA
SECCI6N MICROBIOLOGiA
1
I[

MANUAL DE

,
MICROBIOLOGIA

Elaborado por:

OLGA INES MONTOYA CAMPUZANO M. SCI


Profesora Microbiologfa Universidad. Nacional .

1999 . j
fl.··
.'
Ilurrii~IIII~I~!II~II'lli .
_ _._6_
:1.~
4000
.. 00127384
__
_~'__ ~
9 ~~ _______ ..

'F"!9,tJ :;&
Manual de M/crobiologia Olga Ines Montoya Campuzano ,~ 6::; Manual de M/croblologfa
,'1,;

INDICE

Este manual teorico-prtictico estti basado'en revisiones bibliogrtificas y


jundamentalmente en la experiencia practica de la autora durante INTRODUCCION ................................................'
varios alios de docencia. ''
PLAN DE TRABAJO •.••..•.• fll~.!
(, I
"
NORMAS GENERALES PAf i ! t•
l' J!
Agradecimientos: PRECAUCIONES PARA EIJI ;1, CI,tl-\
... . .... '"
t ", Lf,6QS
Agradezco el apoyo del personal del Laboratorio de Microbiologia
de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellin.' pRACTICA 1. DISTRIBu~J
'AMBIENT
I. . ~,
I' . q
,
-'0 :

, I! ~-~- ..
pRACTICA 2. OBSERVA! I ' r';-­
<,~.~Atodos rnis estudiantes que con sus aspiraciones e inquietudes I. I
, en el desarrollo de las practicas de laboratorio, a traves de todos pRACTICA.3. COLORA~' 1,/ . \

estos alios han contribuido al mejoramiento de .estas. '


J pRACTICA 4. COLORA~i I! --~-:..' -;
pRACTICA 5. COLORA(!! }, ,
,I

AI estudiante Alvaro Penagos Quiceno quien fue el que elaboro pRACTICA 6. CULTIVo'
r

los dibujos ilustrativos. ' PR.ACTICA 7. RECUE~ • ';-.
pRACTICA 8.' ESTUDI,i., '
II I I

BIOQU! i '
A las personas'qu'e han revisado el manual, por sus sugerencias y
sus grandes aportes. pRACTICA 9. GENET;,
pRACTICA10. ESTU~ i
pRACTICA 11. ESTUr!
Olga Ines Montoya Campuzano , II '
PRACTICA 12. PRO~! i .'
I pRACTICA 13. CON1' '
Ii ;
pRACTICA 14. MICF' i II '
!I

I pRACTICA 15. MICr

pRACTICA 16. Mid! 1 b 1'6 ~

I' (' r(l'O


t REACTIVOS ......... ~ ~g , 1

r\{ " \
I ii' x-
t; I rn3 , A
·1 BIBLIOGRAFiA .• J!
r £ J ()
1{" 8x N
..J ,,-:-h~;
1r(\~
, -')l­

",,1 I 06~
r
tf9.t) 18
Olga Ines Montoya Campuzano 65 Manual de M/croblologfa Olga In~ Montoya Campuzano

.".b
1,
i INDICE
I ,,". ,,.'., ; ' ,",.
I
tieo ~sid basadoen revisiones bibliografieas y Page
experieneia .piaetiea de la autora durante
INTRODUCCION .................................................................................. 7
PLAN DE TRABAJO •••••.•.••••••••••.•••..•..•••.••••.••...•.••••..•..••••••...•••.••••••••.. ~, 7
NORMAS GENERALES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO... · '8
PRECAUCIONESPARA EL USO DEL MICROSCOPIO ......................... ' . 8

icrobiologia
rna' . PMCTICA 1. DISTRIBUCION DE MICRORGANISMOS EN
... AMBIENTES NATURALES .................................... 10
PMCTICA 2.
OBSERVACION DE BACTERIAS .............................~. 16

quietudes
s de todos PMCTICA.3.
COLORACION DE GRAM '............................................ 22

PMCTICA 4.
COLORACION DEL ESPORO BACTERIANO ............ .25

PMCTICA 5.
COLORACION DE CApSULA ..................................... 29

'elaboro I
I
PMCTICA 6.
CULTIVO YAISLAMIENTO DE,MICROORGANISMOS. 32

pRACTICA 7.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS ...................... 50

. It,
PMCTICA 8.
ESTUDIO DE LAS CARACTERfsTICAS

BIOQUfMICAS DE LOS MICROORGANISMOS ..... 62

rencias y
PMCTICA 9.
GENETICA BACTERIANA .......................................... 76

PMCTICA10.
ESTUDIO DE HONGOS ......... ;~ ...........................~........ 79

I PMCTICA 11. ESTUDIO DE ALGAS ................................................. 84

.mpuzano
I -
PRACTICA 12. PROTOZOOS ••.••••..•.•••••....•••••••••.....•••••...••••••••.•...•.••••• '., 88

I PMCTICA 13. CONTROL DE MICRORGANISMOS ......................... 91

pRACTICA 14. MICROBIOLOGfA DEL AGUA ................................. 97

pRACTICA 16. MICROBIOLOGfA DE LA LECHE ........................... 100

pRACTICA 16.MICROBIOLOGfA DEL RUMEN ............ ~.................. 107

II

REACTIVOS •••••••••••••.•.•••••••.•••••••..•••••••.•••••••••.••••..••••••....•••••...••....•••...... " 113

I
BIBLIOGRAFfA ••.••••••.....••••••...••.••..••...•...•••...•.••••..••••..•..••••.•••••••...•..•••.. 117

!
3
,Manual de Mlcroblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia

Figura 6.13. Desarrollo de una colonia en u


LlSTA DE FIGURAS (a) inm6viI, (b) m6viI .............."
Pag.
Figura 6.14. Desarrollo de un cultivo en un
Figura O. Microscopio 6ptico y sus partes .................... ~.............. 9
Figura 7.1. ~ecu.ento de m n i...Jamns
Figura 1.,1. Toma de muestra del medio ambiente .......................... 12
dlluclones) .J I r, !
Figura 1.,,2. Toma de muestra de una superficie .................... ~........ 13
Figura 7.2. Nlimero Mas Pj I: "ltL'
Figura 1.3. Aplicaci6n de la muestra sobre el agar:.... ~ .... ~ ... ~............. 13
Figura 7.3. Resultados e~! f r
Lf 16 ~ S
Figura 1.4. Toma de muestra de las manos ..... ~.............................. 14
Figura 8.1. Toma de mU 1; I
~ ""'(
Figura 1.5. Toma de muestra de la piel ..........................................
Figura 1.6. Toma de muestra de las mucosas ................................
14

15

Figura 8.2. Serie Bioqui J I

-I: !.
I

I.

1X_~~r
(l

Figura 8.3. Pruebas de (cir !r '


Figura 2.1. Pasos para realizar una coloraci6n .............................. 20
Figura 8.4. Prueba de la/;
Figura 2.2. Coloraci6n con colorante acido ................................... 21
Figura 9. Agar triPticat
,\ \

Figura 3.. Coloracion de Gram ....................................................... 24


Figura 10.1. Pasos para •.
II

Figura 4.1. Forma de flamear la muestra ........ ~................................ 27


Figura 10.2. Estructuras/

Figura 4.2. , M~todo de Dormer modificado ...................................... 27


Figura 10.3. Estructuras, ;.,

Figura 5.1.
Coloraci6n de capsula................................................... 30
Figura 10.4. Estructuras.

Figura 5.2.
Pasos para realizar una coloraci6n negativa .......... ~ .•• " 31
Figura 10.5. Rh'IZOpUS, ten

i i
Figura 6.1.
Incubaci6n en caldo •..•••••••••.••••••...••.....•.•.•..•....•.•........... 35
(a) macros) ;

Figura 6.2.
Incubaci6n en bisel .••••••..••.••••...••..••.•••..............•...•.•...... ·36
Figura 11. Algas ....~ r
.
!! , ,

I
Figura 6.3.
Incubaci6n en agar s6lido ............................................ 37
Figura 12. Protozoos' r . \.)SlS '
Figura 6.4.
Siembra por exposicl6n ................................................ 38
Figura 13.1. Control d{ ,•.
Figura 6.5.
Toma de muestra ............................................................ 38
Figura 13.2. Control d1 . ~~0~
Ii '
Figura 6.6.
Pasos para la siembra en el m6todo Franc6s ............ 40
(concen~r ;
;i
\JJS
I

Figura 6.7.
Siembra metodo clasico ............................................... 41
Figura 13.3. Control C;I i
If! ____
Figura 6.B.
(a) siembra metodo radial (b) desarrollo de su colonia, 42 Figura 13.4. PruebasU I
r'
1

,fo,c6 kN
Figura 6.9.,
(a) siembra metodo en cruz (b) desarrollo de su colonia 43 Figura 13.5. Control J f ' r0~
Figura 6.10. Extendido de la muestra metodo por diseminaci6n ..... 44
Figura 16.1. M6todot· .~9
Figura.6.11. Siembra metodo en profundidad ..................................... 45
R x ~
Figura 16.2. Sondar'( , rn3
Figura 6.12. Desarrollo de colonias en un medio Uquido (a) en

superficle (b)sedimentos (c)en floculos ••••••••• ~............... 47

Figura 16.3. Protoz(::;


Figura 16.4. protozi'
~
r
I,' ~
J'» II

1b/ 8,K-')(­
N 1r
4
'""" 10
Olga Ines Montoya,Campuzano Manual 'de" Mlcrobiologia Olga Ines Montoya'Campuiano

Figura 6.13. Desarrollo de una colonia en un medio semis6lido


LlSiA DE FIGURAS (a) inm6vil, (b) m6vil ..•••••••......••••...•••.....•..••.•.................. 48

, Pag. Figura 6.14. Desarrollo de un cultivo en un medio s6lido .............. 48

,f
ptico Y sus partes ................................... 9
Figura 7.1. Recuento de microorganismos (metodo de las

jtra del mecn~_ambiente_-a•....---...... ' , 12


diluciones) .•••....•••...•••..•••••.........••.••....••.........•.•......•..••.•• 53

·~lo r -:
d ~ bL-2
1
.. 13
r....... 13

Figura 7.2.
Figura 7.3.
Numero Mas probable ............................. ~......................
Resultados en la prueba del NMP ...............................
58

58

''S/~. I.... 14
Figura 8.1. ioma de muestra en la serie Bioqufmica .................... 73

14 Figura 8.2. Serie Bioquimica en Enterobacteriaceas .................... 73

. ~..J.J
5---- u\
15 Figura 8.3. ,Pruebas de (a) caseinasa (b) hem6lisis ..................... 74

~ 20 Figura 8.4. Prueba de la gelatinasa ................................................ 74

~-,
C ,", ',;
.-:-; ~ _ _ _- - ­
21 Figura 9. Agar tripticasa de soja con oxitetraciclina ................. ' 78

~'J/-- 24
Figura 10.1. Pasos para realizar el microcultivo de un hongo ...... 81

27
Figura 10.2. Estructuras de un Basidiomiceto ............................... 82

-- 27

30

Figura 10.3. Estructuras de (a) Aspergillus (b) Penicillum ...........


Figura 10.4. Estructuras de una levadura .......................................
82

83

Figura 10.5. Rhizopus, caracteristicas de la colonia

(a) macrosc6picas, (b) microsc6picas ........................ 83

Figura 11. Algas ....................................................................................... 86

Figura 12. Protozoos....... ••.....••...... .....•...... ......... ....•...................... 89

Figura 13.1. Control de microorganismo por pH .............................. 92

38
Figura 13.2. Control de microorganismos por presi6n osm6tica

40
(concentraciones de glucosa) .................................... 93

41
Figura 13.3. Control de microorganismos por temperatura ............ 94

fa42
Figura 13.4. Pruebas de sensibilidad .......... ........... ............. ............. 95

ria 43 I Figura 13.5. Control de microorganismos con luz ultravioleta ..... 96

•••• 44 I. Figura 16.1. Metodo de fistulaci6n 0 canula ................................... 108

45 Figura 16.2. Sonda nasofaringea ..................................................... 109

I Figura 16.3. Protozoos flagelados del Rumen ................................ 111

,47
!" • • • •

! Figura 16.4.. Protozoos ciliados del Rumen ...... ......... .................... 112

f
I
I
5
.Manual. de Microblologia , . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia

INTRODUCCI6

Lista de Tablas

EI Manual de Microbiologia General fue I


fr-r-'
Tabla 1. Numero Mas Probable ............................................................. 61 I' ,
proporcionarle al es I "
Tabla 2. Diferenciaci6n de Enterob~teri.aceae ,rCSf"pruebas '·
tecmcas b"aSlcas ellII -:r
Bioqufmicas ..........................•,......•'.....................................,.."....... 75 CJd.l-~
requieren. II. Y,62S
~-O,~'+-S
EI estudiante trabaj'i .
de importancia, en II

como: calidad de I _- ___'--'-


~
~ -'

. y/ ­
VI
PLAN DE TRAB~! .1 .

'i

1. Las prueb~i
i !
,I
I

I
>-.

dependien{ ,
2. Un miCrOS;! .
los respofl,1 i
3. Antes def:.'
relacionac'
/i
4. AI iniciar f
5. Los estu(l
II
/' ,
realizada''I,i
I'
6. Las prac: .
'I

curso tei
II
7. EI estu(
, /.:

patogen
]I

i
,Ii
~i
Ii,
.1

./I'
i I

I
r j.J ()

1bl 8K N
-.J
v
~~ ;;
41"'0"
0
Olga In~ Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga In~ Montoya Campuzano

INTRODUCCI6N

Lista de Tablas

EI Manual de Microbiologfa General fue elaborado con el objetivo de


table ............................................................ 61
proporcionarle al estudiante de Zootecnia de la Universidad Nacional, las
tacnicas basicas en microbiologia, de interas para aquellos cursos que 10
requieren.

EI estudiante trabajara con los microorganismos (patogenos y no patogenos


de importancia, en las areas de asistencia tacnica que Ie corresponde prestar
como: calidad de agua, de alimentos, de Semen entre otras.
ern -.:
~JI ,.--------­
PLAN DE TRABAJO
--
1. Las pruebas se trabajaran en grupos de dos 0 cuatros estudiantes

) I"

2.
dependiendo de los objetivos de la practica.
Un microscopio se aSignara a cada dos estudiantes, los cuales seran
los responsables.
3. Antes de empezar cada practica, se realizara una prueba corta
relacionada con la practica anterior y con la que se va a efectuar.
4. AI iniciar una sesion practica, se hara una demostracion de la misma.
5. Los estudiantes elaboraran un preinforme y/o informe de la practica
realizada segun indicaciones.
6. Las practicas, se dictaran en el mismo orden que se desarrolla el
curso teorico.
7. . EI estudiante trabajara con los microorganismos patogenos y no

4/
-1 K~
patogenos de importancia, en la areas de asistencia tacnica, Que Ie

~j ~ ~ I. J\»)
IO)CJ'
II 7
Manual de Microblologfa , Olga Ines Montoya Campuzano . M8IJual de Mlcroblologfa

corresponde prestar como: calidad de agua, de alimento, de leche, del s. Oejar el microscopio con la platina ab~
semen entre otras. con el de menor aumento que presente
6. Colocar el plastico 0 forro de proteccion
NORMAS GENERALES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO 7. Guardar en el cajon con los lentes hacic

1. Usar blusa de laboratorio


2. Recoger el cabello con una hebilla 0 caucho~ ~
cf,tl-~
3. Lavar las manos con agua, jabon y cepillo, antes y despues de cada
Y,6o.$
practica.
-0 I Q';-'O, 3'1--.$
4. No comer ni beber, ni fumar dentro del Laboratorio.
S. No tocar con la mano ninguna preparacion en fresco, ni derrames en
IX-' _ -.
el Laboratorio. Llamar al profesor para evitar infectarse.
6. No toser, ni hablar, ni relr, frente a un medio de cultivo destapado.
7. Flamear el [as~ antes y despues de usarla.
8. Abrir los medios de cultivo frente a la llama.
9., Marcar correctamente todos los cultivos.
10. ' Colocar adecuadamente el material inoculado en el sitio indicado por
el profesor.
.
11. Oejar limpio y organizado su puesto de trabajo.
12. Colocar el material a descartar en el sitio " material de desecho"
nombrado,'
,II

PRECAUCIONES PARA EL USC DEL MICROSCOPIO


I ~~~~~)J<
1. Revisar bien el microscopio antes de usarlo. Sf encuen'tra alguna I \JvlSs
anomalla, informe al profesor 0 reportelo enlaHoja Control. i
1I ''.
2. Limpiar con gasa los objetivos y el ocular antes y despues de usarlos. :
3. Cuandoutilice aceitede inmersion, limpie el objetivo de·1 OOX con
gasa y alcohol.
4. No dejar nunca una placa montada en /a platina del microscopio.

IIIQculcwon; !nlroduwol\ en e\ 0191fll5l110 de \)11 VIf OS, VqC\)l1o., s~ro 0 "elleno,


8
Olga In& Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga In& Montoya Campuzano

como: calidadde agua, de alimento, de leche, del 5. Oejar el microscopio con la platina abajo y con el objetivo de 10X, 0
con el de menor aumento que presente el microscopio,
6: Colocar el plastico 0 forro de proteccion.
lARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO 7. Guardar en el cajon con los lentes hacia delante.

r~~\ .'
\ fhO.· \
~ ~'2- \' antes y despues de cada
-1.1',

oratorio. . . .
\ en fresco, ni derrames en
\ infectarse.
~e cultivo destapado.

IMAGEN --;r-+~
INVERTlOA

.,'\ el sitio indicado por

TORNILLO
\terial de desecho" MA.CRO

.
,
BASE

ESPEJO BOMBILLO
'cuen'tra alguna
trol.
\ de usarlos.

\100X con Figura O. Microscopio 6ptico y sus partes

\10.

9
. Manual de Mlcroblologla Olga In~ Montoya Campuzano
Manual de M/croblologla

. pRACTICA 1
En el_IJ.~f!9!....~~~icio de la denticion· sa ~9(J
DISTRIBUCI6N DEMICROORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES.
~~-Eacteroides '1_ bacilos !fu~1/l)t~~s; al
.' ~erobios. Posteriormente, con el· camb;d;
cambia y en los er..J("1'- ._,......._.._
------..;,
INTRODUCCI6N .

Los microorganismos estan ampliamente distribuidos en distintos ambientes


_--
nivel del tejido del
~_

/e~aduras. - ,'
....
I,

:1
-:r
ci,tJ-~
y 160. '5
aun en ambientes hostiles, como las aguas termales, el Gran Lago Salado, La micro biota dj! ~O,6':}$·
----. ~J ...., - - •• - -••- - _ _ _ " ... :

los desiertos, entre otros. Sin embargo, ~~LI:',Qa~~~_~~_!~Ji~~~~~~.~r:'~e.J]QJI~


~_~tafilococos .. y ~
sido
. .
.
demostrada la presencia
.-.... ..
de los mismos, como en los volcanes en
'-.~ ~---'''---'-. '---'~--''''--~- ~ -~--.""--~---"-'-""'~~""--'~---""""-'~"--~''''---''''''''''''--'---- estan norma/ment t;X_~ ._ .... ~9 _
---------.. . ".-...--,---,'~--, I
ebullicion.

El.............
~
intestino
,
contiJi
...•. __._--- ~/'

Por otro lado, haciendo parte' de la microbiota normal en el cuerpo de los


,....comt
lactico,
.-" .. tales
~".. ,,' ...··/i

seres vivos tambilm se encuentran microorganismos.. No obstante, §~gun,?s eXisten. bacteriai

organos internos como el corazon,. los rinones,el ce~~t:>r.9L.geben estar Bact~ri~~;;-~ragJ . )-.
exe~tos mi~~o~~~~,~i;~p~;~to' que ~u pre~encia
- - - - . - - -.. , I
de en ellos causaria '!1icroQ[g_c:nis.!!"o~l :

enfermedad. ~did~.!.y otrosJ ~--'--'il


.

!
I'
Una de las maneras mas sencillas para demostrar, en el laboratorio, la OBJETIVOS f'
~;isteQcia de g~lTl1E3nes en un, c!r!l_bl~~~-.Q~!~[~~~q9, es por !~'~~t~'dc;~~ F

siembra en medic's nutritivos--naturaLes~artifi~lale'~J


......- 1.
~~~V~~
, - -, _.,-
~ .,,-,.- --..,-.----~.-- -.~" --~-----'--- ---~--_.- Demostrar{
I:
cultivo, en f
Microbiota Nonnal de Algunas Partes del Cuerpo. 2. Comproba:;
hacen part} ,
,I
Ii :
\JJS5. \t
De manera natural, en las mucosas de la boca y de la laringe:._f)~.~stabl~cef'1
I; !
};
est;ptococos ~:h~;Olitic~;-(St;~t;;;;cus
tipo. -.....-- Virid;~;)-, , '
:

-:...----------....-. --.. - '.__...-- co .


como tarpbien
MArERIALES /:
negativo~ (Neisseria),
,f: !
est:fimcoco aerobios y... ----.-anaerobios,
...
diplococos --_
Gram
....... -- .- •. _---­
~'--- -~-.-.~
I
. i
difteroides'l.
-- --.-;--------~-- -------
ocasionalmente lactobacilos, varias especies de Hafi!!!!-llphilus, • CaJas de petri!
I.
neumoco s, mycoplasmas y---bacteriod~!.
....
"-,------.---~~'. -.-~-- • Escobillones c~

UblClllcidd: capooddd delI'


10
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano

.'

I PAACTICA 1 En el _I}I~!...., al
inicio de Ja dent!~i<?!:!3_~___ ~yede~~ilcontrar esprrg~uet~s

bORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES. ·


~maero blas,
b 'd
acteroles yb ' aSI, como aIQunos VI'bnones
lJ,lfmu,p' h U s o ,
aCllosTushormes; .rdJ

" anaerobios. Posteriormente, con el cambio de alimentaci6n la microbiota


• . \:,adertQG sllf,twanlosC/s p.12
cambia y en los adultosse puede encontrar regularmente actinomlcetos a
-------"",-_.._ ,-- y'~~.-.----.---'---.~-------- .. .-­
nivel del tejido de las amigdalas, y en la cavidad oral se pueden encontrar
le~~;Yuras. -- ---._. -..-----.--,

s ambientes
---
bgo Salado, L~_~~r9.Qiot~9_!Lt{~~ lQ~~~ ...nasalesPLJ~ge cont~ner, c~ry~r:!~I?!I_9!~~!~S,
I
rOnde no_ha estafilococos y estreptococos. Los bronquios y los alvaolos pulmonares
olcanes en ~an~~r~ai-~~~~~.~~~;;-~~~_e._!!li~[Q~ml~rno.s~d';tQ~mo~~ad~ f;;~~cr~~;9Clfll$l nos?

EI. intestino contiene gran numero. de microorganismos gue producen acido


lerpo de los I~~ti~~'tal;-~~m~~~Pf~;-y-la~toba~to;~
__.-....
,. _-,.-_
-....... :--.. _ __
•._._---_ ..;-
.....
E~-~i-cOIO~-;'I;-~;;I;;
.. ,......... ... ,­ ~'---'---'--'-

rte, ~!g~~s existen_.J?~.9!~rias.


,. -
anaerobias tales como . . bactergides,
. -, '-, -"-~--'---'-----.-----.--...-:-~-. ,"- -- -- _.",,_._.... ,..---_.. .-
especialmente,
,,_.'- ,~--.*--~,---.

-- ieben estar Sacteriodes 'ragi/i, Sifidobacterium y Clostridium; tambian se encuen!rar'!.


~ . ~ . --.---~. ,,-...~-.----.--.--

s causaria . microorganismos facultativos como Coliformes, EnteroCocos, Pseudomonas,


-.~ - . ' - _ _ _ ---.._-~ _ _ _ _ • _ _ _ _ .~ _ _ _ --'."-~--' _ . • r- •. _I~"'-'_- • __ ~._._~_-....._, ____,.

Candidas otros.

OBJETIVOS

1. Demostrar la ubicuidad de los microorganismos utilizando medios de


cultivo, en cajas de petri
2. Comprobar que en el cuerpo humano existen microorganismos que
hacen parte de la microbiota normal.
establecen
.r.0 tambian MArERIALES
!(NeiSSena) ,
. ~emophilus, • Cajas de petri con agar nutritivo
.~
• Escobillones de algod6n estariles 0 cinta pegante.

11
Manual de Mlcroblologfa Olga Inu Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa

• Estufa a 300C
• Tapar adecuadamente. (Figuras 1.2.,1.3). '
• Mechero

.' Cinta de enmascarar/'

fl,
• Tubos con soluci6n salina estanl.

'PROCEDIMIENTO
i
I

I
!
MICROBIOTA DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO
/;
F
MicroorganisnlOS del Aire:
• Destapar I,Ina caja de petri con Agar Nutritivo en cualquier lugar del I
I
I'
I
/' \

laboratorio. I
i:

• Oejarla expuesta por unos 15 minutos. ' Oespues de este periodo, ' I,

• 'Tapar adecuadamente. Figura 1.1. ' I


---
';..---
I 'j",
~3

Figura 1.1. Toma de muestra del medio ambiente

Microorganismos Presentes en las Superficies:


~~\lV~~
• Tamar un escobill6n humedecidaen soluci6n salina.
• Fratar sabre una superficie del laboratoria, tal coma la mesa, el'suela, la
pared, entre otros.
Microbioii "

I
J
f'

1b,'6
---_.,
(,(v0
\ "'-
\J - ,,

Microbiol r0'O
• Aplicar el escobill6n sabre un extrema del medio de cultiva en la caja de j!

siguientej
petri. l ~9-x .. 1r{"\)
• Hacer estrias en tada la superficie, sin romper el medici de cultivo. "
~
, ,
, ,
rr2~ ~c..""~
,
)<
• Sin la';,
I,
I
I
HI
r~J(j ~~~~;o ,Ie I
12
!
I 1{'/8 X N .,. _1~M_~_ lo~
I I ' "",,'1. 6 'l,.
r'\", , l ' r~__
I; I • I I ;, , A _
Olga Inms Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Inms Montoya Campuzano

• Tapar adecuadamente. (Figuras 1.2.,1.3).

il/. . ..
a esteril. .

Figura 1.2. Toma de muestra de una superficie

Figura 1.3. Aplicacion de la muestra sobre el agar.

Microbiota Nonnal del Cuerpo Humano.


,> uelo,la

Li8d9 Microbiota de las manos: Un estudiante del equipo debe proceder de la


siguiente manera:

• Sin lavarse las manos, colocar los dedos sobre el Agar Nutritivo de una

\
13
Manual de Mlcroblologla
Manual de MlcrobiOiogla' Olga Ines Montoya Campuzano

caja de petri, haciendo circulos en su superficie.


Microbiota de las Mucosas.
• Enjuagar sus manos con agua del grifo, sin usar jab6n
• Introducir un escobill6n humedecido en solu
• Colocar los dedossobre 'el Agar de otra caja de petri y realice la acci6n
nasales 0 en la cavidad bucal.
anterior.
• Proceder como en el caso anterior. (Figura 1
• Lavar sus marios conagua, jab6n y cepillo.
• Colocar sobre' Is superficie del Agar de otra caja de petri y proceder de
igual maners que en las dos anteriores.(Figura 1.4).
1­ A ccJlo r: [
o',tl-~
14 ,60. S I:;SY~
~O,~'t-5'
C\ \ ~~
.... ~ _-·-1
~-. ­
'.­
)u..'· C \
\ _----'-:--' -;/' _________ 1/
Figura 1 ~4. Toma de muestra de las manos
~
\
t\.J

Microbiota de la Piel. ~
• Humedecer el escobill6n en soluci6n salina esteri!.
• Frotar una pequeria zona de la parte interior del brazo 0 de la cara.
• Aplicar sobre el medio de cultivo, formando estria.
• Tapar adecuadamente la caja de Petri,(Figura 1.5).

Figura 1.5. ,Toma de muestra de la piel.

14
Manual de M/croblologia Olga InOs Montoya Campuzano
OIgalnes Montoya Campuzano

birculos en su superficie.
I
Microbiota de las Mucosas.
~ agua del grifo, sin usar jab6n
• Introducir un escobill6n humedecido en soluci6n salina esteril en las fosas
~e el Agar" de otra caja de petri y realice la acci6n
nasales 0 en la cavidad bucal.

'\ atri y proceder de


• Proceder como en el caso anterior. (Figura 1.6).

II Figura 1.6. Toma de muestra de las mucosas


It. I

NOTA: Una'vez realizados todas las tomas de muestra, proceda de la

I siguiente forma con las cajas de petri:

\r
cara. • Rotular adecuadamente con la informaci6n necesaria en la base de la caja
de petri (parte extema),.
• Incubar en la estufa a 300C durante 24 a 48 horas.
• Colocar invertida la caja de petri.

Actividad

Elabore un cuadro don de figure cada una de las muestras, teniendo en


cuenta la forma, el color y el tamario de las colonias obtenidas.

15
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla

encuentra esta. ,Este tipo de colorante se em,


celular. A este grupo pertenece la Nigrosina, (Tir
pRACTICA2
de Metileno.
OBSERVACI6N DE BACTERIAS

OB_Ic.."IU-ft~ v~-
.,
. .
INTRODUCCI6N
ccJlo r:.
Con el fin de aumentar el contraste y facilitar la observaci6n de las muestras '~')Y0
de campo claro, se pueden utilizar colorantes. Los colorantes son
compuestos organicos que presentan afinidad por determinadas estructuras,
la cual esta basada en la carga positiva y negativa presente en el. Todo ~- . . -
colorante, se caracteriza por presentar un grupo crom6foro que tiene como
funci6n teriir la estructura y un grupa auxocromo, el cual participa de la
reacci6n, para que se de la tinci6n.

I' Los colorantes se clasifican en cati6nicos (basicos), anionicos (acidos);


basados en la earga presente en el grupo crom6foro. Los colorantes
I
cati6nicos estan cargados positivamente; esto es que un campo electrico se
desplaza hacla el anodo (negativo) y se combina fuertemente con
componentes celulares cargados negativamente como. los acidos nucleicos y
pOlisacaridos acidos. Los colorantes basicos mas comunes son el Azul de
. "
Metileno, Cristal Violeta y Safranina. Como general mente los
microorganismos en su parte externa tienen una carga negativa debido al
transporte de electrones, estos colorante se combinan con estructuras de la
II ,
superficie celular; par 10 cual los hacen mas comunes en aplicaciones
• PI'
,I;
generales.

Los colorantes acidos (ani6nicos), estan cargados negativamente, por 10


tanto van hacer repelidos por los componentes organicos de las estructuras
celulares, par 10 que no penetran la celula, sino, que tine el medio donde se

16

Olga Inis Montoya Campuzano Manual de M/crab/alogla Olga Inis Montoya Campuzano

encuentra esta. "Este tipo de colorante se emplea para observar la forma

celular. A este grupo pertenece la Nigrosina, (Tinta China) 0 el Eosinato Azul

! pRACTICA2
I " de Metileno.

;ERVACI6N DE BACTERIAS
,

-----,.,.,.
.L----
,
OBJETIVOS

,!~Ii2.-
_rr­
f Diferenciar una preparaci6n en fresco de una coloreada.

observaci6n de las muestras


Identificar las diferentes formas y agrupaciones bacterianas, por medio de

ntes. Los colorantes son


\ . preparaciones coloreadas.

\r determinadas estructuras,
Apreciar la acci6n de los colorantes, de acuerdo con el caracter quimico de

ativa presente en el. Todo


ellos.

f______
\ crom6foro que liene como
mo, el cual participa de la
MATERIALES

• Portaobjetos - cubreobjeto
icos), ani6nicos (acidos);
. tl,
• Cultivos bacterianos de cocos y bacilos, de no mas de 48 horas.
m6foro. Los colorantes
• Mechero
. , \e un campo electrico se
• Frasco lavador
,rnbina fuertemente con
\~o los acidos nucleicos y • Puente de coloraci6n

oomunes son el Azul de • 8andeja

}' ro gen~ralmenle. los I


• Colorante bllsico (Azul de Metileno, Safranina)
1rga negativa debido al I
• Colorante ACido (Nigrosina 0 tinta china)
, t<;

\n con estructuras de la • .Aceite de inmersi6n


'\
rnes en aplicaciones • Paliuelos desechables.

r .
. .tegativamente, por 10


Gasa.
Microscopio.
•.

'"FS de las estructuras Para la observaci6nal microscopio de bacterias vivas ylo muertas, se utilizan"
~e el medio donde se dos metodos:

/
.(~
17
Manual ete Mlcroblologfa Olga InesMOI1toya Campuzano , Manual de Microblologfa

PREPARACI6N COLOREADA
• Montaje en Hlimedo .
• Preparaci6n Coloreada Las bacterias sin c%rear tienen e/ mismo indie
10 tanto, se observan transparentes al mierc
~---~~-~.~-~~-~-.~~.

MONTAJE EN HUMEDO.
~'
Este metodo se utiliza para la observacion de la forma y movilidad de las
e, 1­ ccJlo r:
( CJ'/tJ-~
bacterias vivas, Ej: coco, bacilo, espirilo.

1-] Ib~ $ 1:')/0


~O/~'i-$
PRODEDIMIENTO
• I

• Limpiar el' portaobjetos con alcohol.


,j._.
, .
-
.......
- ------
• Quitar el exceso con una toalla de papel 0 gasa y f1amear.
• Esterilizar el asa pasandola por la llama hasta ponerse al rojo.
• Oejar enfriar, siempre cerca al mechero. -
•~1
f.

Muestra en medio liquido •


I ;..,
• Tomar con el asa esteril una gotadecultivo (inoculo).. •
• Oepositar en el centro del portaobjetos limpio.. •
• Colocar lentamente un cubreobjeto, sobre el inoculo sin que se forme
burbuja.
• Observar al microscopio con objetivo de 40X - 100X.

Muestra en medio s6lido


• Oepositar en un portaobjetos limpio una gota de solucion salina 0 de agua
destilada.
• Tomar con el asa esteril una colonia del cultivo. .'
• Hacer una emulsion con la gota.
• Cubrir la preparaci6n con el cubreobjeto.
• Observar al microscopio con los objetivos de 40X - 100X.

18
Olga Ines MOntoya Campuzano , Manual de M/croblologla Olga Ines Montoya Campuzano

.- ~ " 1 PREPARACI6N COLOREADA

Las bacterias sin colorear tienen el mismo indice de refraccion de la luz, por
10 tanto, se observan transparentes al microscopio. Sin embargo, las
preparaciones coloreadas permiten observar claramente sus form as ,

de la forma y movilidad de las estructuras internas y externas y clase de agrupacion.

Los colorantes que se emplean para la tincion de bacterias pueden ser


basicos, Azul de Metileno y Cristal Violeta; acidos como: La Fuscina acida y
la Nigrosina; y neutros como: EI Eosinato Azul de Metileno.

~sa y f1amear.
\1 ponerse aI rojo.
. Los pasos a seguir en una preparacion coloreada, Figura 2.1 :

• Tomar el portaobjatos limpio


• Esterilizar el asa
• Enfriar el asa en los extremos de la caja de petri 0 del tubo.
• Tomar el inoculo y depositarto en el portaobjetos, y realizar un extendido
homogeneo.
• Proceder da acuerdo con el tipo de cultivo liquido 0 solido.
• Oejar secar la muestra cerca de una bombilla 0 una llama, controlando la
temperatura con el dorso de la mano.
• Evitar al sobra calantamianto.

TINCI6N CON COLORANTE BAslCO


• Cubrir complatamanta al axtandido con un coloranta basico, durante un
minuto ~
• Lavar con agua para eliminar al aX,ceso da colorante.
• Oajar sacar al air~.
..• Obsarvar al microscopio con 'los objetivos de 40X -100X.

19
Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa

CAJA DE PETRI BISEL

"rlNCI6N CON COLORANTE ACIDO

• Hacer una emulsi6n microbiana, tomando I

1. ESTERIlllAo6M
DELASA


• Exten" CJ~tl-~
• 1
Lf ,6'2 S
pe"9
. I ~--O/3'}-$
• Dejal

I
i'
tX_'-'
(j

j ,.
- -
t _ ____,.'--'.- JLr-
I .~.// - - - ­
/,
,/:

i
v-
I
I· I
I
I
j
.
5. FLJAQON DE
'

( NOl
I
!
,/
LA MUESTRA
AI j'
/ luz./:
f

t ~~;)V~fujjJ4
Acl Ii
i~,
t1 '
.. • 1. MIOOM DElCOlOlWlTE
Hi
ot
I
I'
f
16,'6 kN
----.­
\JJS:s
r0?>
D
~9 '" . . 1
r
E
. II
'. -1.1­
f'{"\ ' )

fI: I r-r::.3 I~ )<'}~


'")
. .~u c."" ~ -1
Figura 2.1 •. Pasos para realizar una coloraci6n.
..r r,tJ8K() ~ ~-:-h::I~;"
1(;" N
J.... I", l
20
'1 .
/i;
"",
-')(
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologla Olga Ines Montoya Campilzano
\ :

CAIA DE PET1lI BISEl

TINCION CON COLORANTE ACIDO

.' Hacer IJna emulsi6n microbiana, tomando un in6culo y mezclandolo con


agua.
• Colocar una gota del colorante acido sabre la emulsi6n.
[
I~
f
• Extender el cultivo teriido con portaobjetos limpio, hasta obtener una
peJfcula fina.
! • Dejar secar al ambiente.
I
!

! /

!
!

ti.::-- ~.:l
,
Q'
2

Figura 2.2. Coloraci6n <?on colorante acido


, ~,

DIUlE
, ~STRA
I ( NOTA: La muestra no se fija con la llama, ni se lava el exceso de colorante.
\ AI observar, se debe bajar el condensador para reducir la intensidad de la
!
luz.

Actividades
. I
I

Hacer una descripci6n morfol6gica de las diferentes microorganismos

observados.

Diferenciar al microscopio los dos tipos de observaci6n de bacterias.

Establecer las diferencias entre coloraci6n basica y negativa.

~
)<.\4 /
/) K~
J~ l\":)j ~~l,J\J)
l03~.
\O~N ,. 2J

"'--­ 1 Kt\
Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia

MATERIALES
PRACTICA3 • Cultivos jovenes de bacterias Gram Positivas
COLORACION DE GRAM • Mechero Bunsen
• Raectivos: Lugol y alcohol acetona
INTRODUCCION
• COlor,n~,tes:
cris.!~leta y Safranina "
• porta1ti -'-~
Las tinci~nes _diferanciales se caracterizan porque no tilien '. de forma
hom()genea a todos los tipos de celula. La, tincion de Gram
.--... ,~-.---"
una de las
----­ • puente
l
'I
' !112- <; C)
~
I ') CCJ (
I
•. Asa, Y,6'lS
mas importantes en microbiologia porque p(3rmite _!-!if~i~il~~~~~~ las bact~!i(3s
an _q~~~_ ~~l1~~~~~_Y C?!am Positivas, con relacion a la diferencia de la pared
• MicrosI ~--0 , 3'". ,-$,
celular. • PanuE
• Gasa: '! t X _ '(j
-.
r (-,
En esta coloracion los reactivos actuan de la siguiente manera: ~I cr~t§1 IIi
PROCE: :. .
C0,\olontc - vi.oleta c()~(~rant~.pl:i.r.:nartq Jiilen J~~bacterias y 1!_~_ol\J~i~~_~yg..c:!ada hace de
bfl.,cC0 mordi~f1te. 0 _fij~~.~r d~_c()l.or y las bacterias se observaran teliidas de un azul • preri
IJ

mas fuerte. EI Alcohol Acetona, actuara como decolorante al eliminar de la


_,_~ _____________,_ .__ . __ .__ . __ ..
~ ~ f'-~.-~-". _._._~~_.~--____. .w~_''''. ~-,
• Agre
r
Rared
---
-~
celular de las Gram'
..
Nega~ivas la capa Iipiaica,__ permiti~n90.ql:!~_el
,,-,---~-.---------.--" ,,~---.---~~" ~- -,-­
--~+".- ~--~-----. '---'-'.-'-~
• . Lavj, >-.
colorante
--.---.-.
se libere. Las Gram Positivas, no se ven afectadas
"- .-~~- ~-~--------~-- -.-~--.-~...
por la accion ~--------~~-.~---- ----.....------.~--
• Cubf i

/1
del deoolorante. En consecuencia las Gram Negativas no
<-.------- .-.- ,.. -,-- --- . '
se observan }tlas
. • Cu;,
~.
• I; ,

Gram Positivas retendran el colorante. rar

., .Ad,' ~
La
--- safranina, colorante secundario
.
tendra la funcion de hacer el contraste__~1
---.----_._­ ~-- -."'----,.-~ .--~---. • La'
teliir las bacterias Gram Negativas decoloradas en el paso anterior. I
• or
I
!
Act
OBJETIVO
l[ \f __ ~-:
J ".
Dife
, #i '

\
Diferenciar las bacterias Gram Positivas de las Gram Negativas, utilizando la Estf;
Gr8 f
tecnica de coloraci6n Gram.

22
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano
I f

I
I
I PRACTICA 3
:OLORACI6N DE GRAM
. \ MATERIALES
• Cultivos j6venes de bacterias Gram Positivas y Gram Negativas.
• Mechero Bunsen
• Raectivos: Lugol y alcohol acetona
• COlor,ntes: Cristal Violeta y Safranina
!
• Portadbjetos
,:~s se caracterizan porque no tirier) ; de forma
........ _-.. _.. _. - --" -.. -_ ...... - .... -.-.:..~---~~~

! • puentb de Coloracion - Bandeja


pos de celula. La 1tinci6n de Gram \ es una de las
•. Asa
I
; .. - - ...- - - - -' ..... , L ___._ _'-·---·· - - - - - - \ . ,

biologia
I porque
. . permite
.----.-.. . diferenciar a las bacterias
. -....
-.~-..;--.---.---.-
• Microscopio
rSiliva"-";..---- I cia de la pared

~r:. CJ ~~~ • pariuelos desechables


• Gasa, cinta de enmascarar

0· era: EI cristaI
\jada hace de
\---.~-~
PROCEDIMIENTO

as de un azul • Preparar yfijar un frotis en la forma usual

~rT1inar<!eJa . • Agregar cristal violeta durante un minuto

-'

• Laver con agua, para eliminar el exceso de colorante


endoque el
'. '~~I~e~~ion • Cubrir con lugol durante un minuto y lavar con agua
l--'''---':'­ • Cubrir el frotis con alcohol acetona" durante 20 segundos y lavar
ran )LIas
-- rapidamente con agua.

., Agregar,el colorante de co~traste durante un minuto.

ntraste al • Lavar con agua el exceso de colorante y dejar secar


• Observar 'al microscopio con los objetivos de 40X - 100X. 1

Actividades ,
. Diferenciar las bacterias Gram Positivas y de las Gram Negativas.
Establecer las diferencias entre una. coloracion simple y una coloracion de
andola
Gram. '

23
Manual de Microblo/ogla ~ Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologla
,~

1. Teiir con cristal pRACTICA4


Violet. tbante 1 COLORACION DE ESPORO B
minuto

INTRODUCCION
". ~~~~~--

La (
,I

6. Contrastar con ~ dl~<;
gen~
~~/~q-5

, slfranina durante
\ I
1 minuto porq~

La~J
\
~-.
"
-­ -
vagat,

~i~

~-~'~~~i, >.

~~Q~ ,

Para c '

\
calor co

OBJETI
1

Diferenci l~,

Distinguir
Figura 3. Coloraci6n de Gram' ,

24
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano

I ~-"--.' . pRACTICA4

l~.'~
....'
• o· \
COLORACION DE ESPORO BACTERIANO

1",. " . ..
_

INTRODUCCION
I
I
t
La endospora bacteriana es una estructura que caracteriza a algunos
~., '0 ~. !:~r~~ I generos bacterianos como Bacillus, Clostridium y Sporosarcinas. Importante
-
L7 ~P--2
~---'--

VJ ~[)o~icion y el tamatiQ que presente la endospora dentro de la celula


"J.
vegetativa son caracterfsticas de cada especie gue 10 posee. Par ejemplo en
~J.J
-_._-_._---- ...._" .-----~.--------.--- -"~.-"~,- -~--~"-.------ ­
el genera Clostridium, la... endosporapr~senta generalmente un diametro
~\
\ tOlorcJflla . . . ."......
-----:---.--.~-.-----.-'----:-,--- -'.-" -"-' ",'- -- - _._,. __ .....".
--"-~~ -~"~--."....--. ~ ----.-----.-~. -"'-'~'""-*-'-'---'---

mayor al de la celula vegetativa, lIegandola a deformar en posicion terminal


~ ""_~_,._ •• ~ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ' _ _ _" " _ . , - _ , - - - " " _ _ _ _ _ •••-_ _ ._",~. ___ ,:,,,,,,--_~._. __ ~~._, _ _ k_ " •• _ __~__ '_ ~ '" _ . ,

V .(Clostridium tetam) en tanto que en el genera Bacillus, la espora puede ser


. ...-.---_.,,------- --... ~---- ..- -----...-~: .---,--- -~ - - .. -----~,'"'-.-~--

';-­ de
..
tamatio 19ual a menor que el de . la celula
...... --- - _....
--.-.--------~.~-~.~"~."----------.,--. .'
vegetativa
.
y-'-puede estar ubicada
~- .. _..... ....
~ "... .~.---- . " -

E?~o~icio~~.~!!~r:§IJ. de la celula vegetativa.

~color~~t.':In~.__enqq§Q()[a, es indispensable utilizar una c~lo~)fac]~n


. ~.

I 9SReCIaUcon
-'"
~-, . -'
dos colorantes basicos: Verde
,---.
cje Malaquita,
.,'" ." ,-'
la Safr~nina
..
y"-----.
el
---~'"-~-,,~~.--,"--~">--. ---~.'"- ,~-,-.-~ -.-~~-- '-~"

J !i, • calor COJD() fjjadQr..


.~----'"-

OBJETIVOS
I
Diferenciar en una bacteria esporulada el tamatio y la posicion del esporo.
Distinguir una bacteria esporulada de una no esporulada.

25
or
Manual de Microblologla Olga InfMi Montoya Campuzano Manual de Microb/ologia

MATERIALES

• Cultivo de Bacillus cereus yJ3E£illps subtilis de 48 a 72 h.


• Mechero
,r ~,.

• Bano Maria
• Puente de coloracion - bandeja
• Colorantes: Verde de Malaquita y Safranina T A ccJlo r: [
e>',V-~
• Tubos con solucion salina esteril
L-J ,b0. '5 I-~/~
• Asa metalica ~O/?:>~$
• Frascolavador q 'Ci..~
3-.-­ ~ _,_.1)
• Panuelos desechables
~-
(\

PROCEDIMIENTO.
, I

Para la coloraci6n del endoesporo sa puede utilizar uno de estos metodos:

Metoda de Schearffer~Fulton
• Preparar y fijar un frotis en la forma usual
• Cubrir con Verde de Malaquita /
• Flamear la muestra hasta qu~ salgan los primeros vaporesJ
• Repetir la operacion durante cinco minutos; /'
I
•I ,
• Procurar qua el Verde de Malaquita, no se seque, ni ebulla./
• Enfriar la preparaci6n durante/cinco .minutos/
• Lavar el exceso de colorante
• Agregar Safran ina durante un minuto /
• Lavar el exceso de colorante /
• Dejar secar la preparacion /
• Observar almicroscopio con los objativos de 40X - 100X. (Figura 4.1)

L 26
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobio/ogla Olga Ines Montoya Campuzano

i
'!§..y Bagllt!.s subtilis de 48 a 72 h.

bandeja ,.,.- ,
t
.
'. ...
alaquita y 'Safranina )

,
~ ,
, '" ~, .,.
)1a esteril' Figura 4.1. Forma de flamear la muestra.
I , ,

Metodo..g.oPW' Modificado'
• Inocular una muestraen O.Sml. de soluci6n salina esteril
~ ,
• AcUqi?nar O.S mJ. de colorante .~~d.ELM!3IC!.quit.a y lIevarlo al Bario de
Maria' a .100°C durante '1 0 minutos
metodos:
• Preparar y fijar un frotis en la forma usual. ,

\ '

.• Lavar.
el exceso de colorante(

1/ _ - - -_ __ • Adlci~nar Safranina por un minuto


( /

• Lavar el exceso de colorante


• Deja(secar la muestra

" If,
r
./ .
I
I
• Observar al microscopio con los objetivos de 40X - 100X. (Figura 4.2)

Ii
[
(vJ I
- J .'

,~, \~J'p~Q-~ ('\~. "


X. (Figura 4.1)

Figura 4.2. Metodo de Dormer modificado

27
Manual de Microblologia Olga In&> Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia

Actividades pRACTICA5
~ Cual metodo es mas practico? COLORACI6N DE CAp!
Anotar las dificultades encontradas en la practica
Esquematizar 10 observado y hacer la diferenciacion entre: Una bacteria 'r~--~~=~~
no esporulada y un~ esporulada - Los tamalios y la posicion deJge~b~~i~j~t) INTRODUCCIO 1­
:; C9it2-~
La capsula,
---------.
e'
/,
Y16 Q 5
~-O ') "\ I.
IJ~S·
presente en tC,
~-----~'-1

compleja, seo. 0
-1 tX_'
polisacarido, r:

Para su obse.
1 Dl..(', . •.
~~-.------j '7/
tambien se 8.
l
I
~_ara Ob!~DJ' ~
cultivarla e~
-'-. -'~"-"'- "',f
p .
I:
OBJETIVC .

visualizaJ .
I"i

~~-Jv~tr0)
i
! Diferencid
I'
i p
i
!
,I
.
. i

! MATERI)' ,
-. !I "
!i
j
\Jvf)j
If
i
f
• CultiJi J
I
I ~
pnetJ i
I! 72 hi;·
,1

• Caja!
l • Mec
ll
.,

I
I .1

I
I
. J
~1

~ 28 I
I
I.
>I
Olga Inlls Montoya Campuzano, Manual de M/croblologla Olga Inlls Montoya Campuzano

pRACTICA5

I
ractiCO? COLORACION DE CApSULA

ncontradas en la practica
:ado y hacer la diferenciacion entre: Una bacteria
?orulada - Los tam alios y la posicion de,:esRorb;'~r'J INTRODUCCION
rt ~------
p/J U2X::.,lCl
_ _ _ __
~"'
,.....,..

~ul~, estructura bacteriana localizada extracelularmente y I)~ esta


presente ~n todas las bacterl~. Su composicion quimica es muy variable y
compleja, segun elJj~o de b~2.teri~.J~!-.!.~de esj~r QOI'J§1ituiQ~ts_~or p-e~,
polisacarido, polimetafosfato; 10 que impide que se thia. ,
--- -- , <

C,')
--
Para su observacion se requiere de una tecnicaespecial como la de Antony;
-
tambien se puede visualizar con la coloracion negativa.
---- ............. ~--,--.---

1.-------' 'JI -------­


Para obtener una buena formaci on de capsula bacteriana, es necesario
_ _ _ ,._.~_._. _ _ _ _ _ _ _ ,~""0_", ... ...
_ _ _• ..---.~ _ _ _ _- - - ••, " ' " ..- ._ _ _ _ _ _ _...._ _ _ . _ .___~_" _ _ _ _ _ ._-~- _"'_.~ .... "~"_ ­ .. '-:7'";'~,-,~,." -...~,., ,,",.~._.~.

cultivarla en un medio rico en... earbohidratos.


-------.--..-------.----,.. . . '-.'.".' ,
<-,~----.".~-~ ---'.-~ .~-'.'.----

, >,
OBJETIVOS

Visualizar la capsula bacteriana utilizando coloracion negativa y de Antony.


Diferenciar entre una bacteria capsulada y una no capsulada.

MATERIALES

• Cultivos en leche descremada 0 en caldo glucosado al 5% de Klebsiella


pneumoniae (capsulada) y Staphylococcus aureus (no capsulada) de 48 a


'---' -r'--rj.:--..---.--.--..------~-'----'.-'--'--~.-"~'.".
72 horas. ",

,I • Cajas de coloracion .,,",'

• Mechero

, .
29
Manual de Microblologia . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologia

• Asa metalica
• Frascolavador PROCEDIMIENTO

• Puente de coloraci6n . Lc//


• ColocBr sobre la superficie de un portaobjetos
gota de agua.
• Reactivo: Sulfato de Cobre (soluci6n aI20%) r-f';I
.• Cristal Violeta • II, I',I
(,

• I
,• I
I
T A colo r:
• Safranina 0',1.2-<;.
• I L.J ,60.5 I;:,)/~
.PROCEDIMIENTO . ~O,?:>'i-S'
7, ',,:

• c,
• Preparar un frotis y dejarlo secar al aire. ~'-'- .. - - 3­
(:~ ~-
• Agregar lentamente 'el GristalVioleta a temperatura de 34°C por cuatro' -:::---­
__--c-~;I
--­
'.
minutos 0 sumergir en una caja 0 frasco de coloracion par dos minutos.
, . .~ " , .. \. ,

(Figura 5.1.)
• Lavar la placa, sumergiendola en" una soluci6n de Sulfato de Cobre al
:Jc
20%.
,< , ,.­

• Secar al aire la placa en posici6n vertical


A
-
. . ,.\

• Observar al microscopio con 40X-100X.

, '

30
Olga Ines Montoya Campuzano . Manual de Mlcrobiologia . Olga Ines Montoya Campuzano

PROCEDIMIENTO
• Colocar sobre la superficie de un portaobjetos limpio y desengrasado, una
. I

pbre (soluci6n al 20%) gota de agua. .

. . I

:.------­ ------"
J.

! .' • Tomar un in6culo y mezclarlo con la gota de agua.


I

i • Agregar una gota de tinta china 0 Nigrosina alia mezcla anterior. I .


!
1
10 r:.
I
• Realizar un extendido, deslizando el borde de un portaobjetos sobre el
I

. PO~aObjetos que cont!ene la muestra. . .\ .' . . ... , .


• DeJar secar la muestra y observar al mlcroscoplo con obJetlvos de 40X­
100X. (Figura 5.2.) \

. or cuatro !

minutos. \

breal
\
. ..
Figura 5.2. Pasos para una cOlor~ci6n
I
negativa

Actividades
!
Esquematizar 10 observado y hacer la diferenbiaci6n entre una bacteria
'I I

capsulada y otra no capsulada. ," I


Establecer una diferencia entre los tipos de color~ciones.

31
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya' Campuzano . Manual cJ.e Microblologia

Los Medio~___~r:!riquec!~~s _E~opor:io~a~_~~~~~


'PRACTICA6 Corazon, tetrationato, entre .otros) para
CULTIVO YAISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS . micreorganismos exigentes, incapaces de sintetiz,
.
---:.~----~---~----~ ..........--.~~--.-.~

otres elementos necesarios para su metabolismo.


. -------_._-"-"---"--_.

INTRODUCCION "" ccJlo r:.

En la naturaleza, las. poblaciones· de microorganismos se encuentran


I~SY0
mezcladas, pero· erJ el laboratorio puedenalternarse cultivos . puros,
empleando diferentes metodos de siembra.

Los medios de' cultivo difieren entre SI segun el origen, la composicion


--.----.--~ ­
qufmica y la consistencia. Se considera que un medio de cultivo
_"""'A'~_'_ .,__ '"--"--.es natural;
v,~___

en tanto que, al sintetizarse


-,--~ ..
tenga los eonstituyentes
'--' -
definidos que aportan
., ­
los nutrientes ne.cesarios el crecimiento de microorganismos.

;".' Los medios de cultivo solidos contienen agar agar, es un polisacarido


extrafdo de algas marinas, el- cual se' solidifica a ~ooG y se funde a 5~.
~.-.--------.--~- , ...- -'

Segun la
- . _ _ _ _ _ _ ----~- •• _ _
consistencia, se habla de medios Jfquidos (sin agar agar), ~ _ _ .. ~_, _ _ _ "_.~~_._~~ . . ., _. __ •• _ .. h'~ ....... _ _ _ , _ _ .~"". _ _ _ _ _ _ __

semiso/idos (0.5% p/v de agar agar) solidos (1.5% p/v de agar agar) .
.. -_._----- .-- ..-_ ...... -- .- .......
-.-\; ... --- ---' --. ------.------­

De 'acuerdo con la composicion qufmica, los medios se denominan: basicos,


,-.-.~-,~ .~,----, -->:"~~.--~~-.-.-----':""" ~'--.- ..-.-- ~-'-----~~'~" ,..,-,~ ~'-'--.---'--- \
enriquecidos, selectivos, diferenciales,de transporte, entre otros.

,"J

~Q!}~e9.ios ." -'-


Basicos se preparan generalmente con
-···~_--_~·-"""··"··· __"_~_~_ .. ~_~ • • • _~_· •• _ _ _ n. __ • __ . - • .,-,-.~.---~'"'"
e~.t!"~~tc:l __ de carne,
-- -- -. - ---~~

extracto de levadura, peptona,


_ _ ~__ '. carbohidratos
_ __ ' ............. -- """,>' _&~-- ff,.,., 4'" <_,,__ .~
trazas de sales. A partir de
- ~---~-~---- ~ -~~ ....

estas bases se pueden preparar los otres tipos de medios por adicion de
----.---------.-----; - _ •••• ~ _ _ _ _ _ ~_ ,". _d_' _.,. _ _ _ .~ .. _ _ _•_ _ _- ._ _ •_ _ _ _ .... _ _ .~ ____________ ~~- _ _ _ • , - - _ _ _ _ ...

colorantes, protefnas, antibioticos, aminoacidos, entre otres; de acuerdo con


el usc que se vaya a dar.

.32
Olga In(n; MontoYa Campuzano Manual de. Microblologfa Olga In(n; Montoya Campuzano

Los Medios Enriquecidos proporcionan nutrientes especiales (Cerebro, .


:'-~'~~.-- ..- ..---- .. -... - ..~~ .. --~----~--."----.---~---~-.--- --~-- .--.-----~--"---------.-

PRACTICA6 Corazon, tetrationato, entre otro~,,~p_~~~ _____~'luel~~ __~ac!~rias y/o.


i
llSLAMIENTO DE MICROORGANISMOS '"---__
microorganismos ._;______.inca
exigentes, _.____ paces
_ ,______ ___.. __ ____.aminoacidos,
de sintetizar __.". '"._. . . _."__ ___vitaminas u ~._. ~._~ ---~~~- ~_w __..!..~ _ _ _ •__"'!_" __ __ ._.

'?tros elementos necesario~ pa~~_!~ m~!~ol!~..!!l0'

/ Los Medi~ Selectivos, ~!1tienen sustancias como~ntibioticos, acidos 0


-
base que inhiben el desarrollo de algunas poblaciones microbianas pero que
..---'--------.------,------......----------.-..---.......:.......----~
encuentran --
permiten el crecimiento de otras. .
...------­
os puros,

caracteristicas.. morfologicas . de. las colonias formadas por diferentes


,"--- ---_._..... _- ---
-.,..-..~--'-----.~-' ~--.-- -----.-'~----......-.------- --~-~----~----.~~--,-,---~---,---~.-,,~., ,.- ---~ ~--

mposicion microorganismos, J:?or contener


--------------~~- --~--'~'-<
agentes indicadores
. . . . . .-".. . .. ...-,-, ,-,....
tales como
_.''''"'' ....
sales
•.--....... ,,,
biliares,
~-.~----'"-"'~~--- ->-~--"",- -~.' ."---,~- -~-,-- ~.,.----

colorantes.
flie aporta!!.
e.~ natural;

~uestras de
_
/Los Medios de'Transporte, se utilizan para transportar frotis 0
microor~~~!§fu6;~~;~6~~~6~--~~rno
- - --------..,,- St;~t~~~~~~:-N;i;seria,-H~emophif~;
.. -"-' .. ,-. ..,-
... '-. ''''''''''-''' .. """----.'"'~ --.,~~.~-,,--- .. "~ -,~~--' . -.. .' -..-

• >, lisacarido conserv_~_Q9_osf£U~_~!!!~Q.~cion de la microbiota de generos. La carencia de


e a 50°C. . ~~-i~~nte de nitrog~no impid~-~~~~~~~~ble~;~~;~-I~'~~lti~iicacion-de ~sto~
.-" . ,,' ..
,-~---"'"'-----~-~-"'''''---,-~ . ,~-,~ ~~-~. ~"'-'-.-.-"-.----.----""-.~~~~~"'"
I .. ~;

,t_
.\
microorg~mp.§ ..
aga2 ' --"'-,---- .. ... ~

:r).
Las tecnicas
~--~-.,
de cultivo microbiano'
-----"" -- .. -.. ...- .
sirven "- para-----,-".-
aislar..
un tipo de '"------'~-----,,-~.--.- -,~" '-'-'-'- ---~. -------,~------

basicos,
\
microorgan!~mo_~~p~e:~~~~_~.~_.~_na fue~~~. ~~!~~~!!~~~~tir~~~~1 nu_~~~o d~
micro~rg~nis.r:T.lg_s.
.
-'---.~"-'
..:gue se encuentren en,.-... un material
-.,~' - .. ..... - .. dado'
-...•
(rumen, leche,
-,._--------'_._­
'''- -"-,,""",,"'~"-'-'''~'~' -, ~~--- --'-~-,-.- -, -"'"~-~--~--"---~-, ~-~--.~-

agua,
. - -..... entre
..
otros),....... _---,-
incrementar el-" numero de.... poblaciones microbianas
--.~~'.-" ,.-"~.-'". . "" .....
0 .~' .~-~~.~.--~ ,"",~" --.'-.---'----~-'-

kcame,
, artir de
mantener un cultivo,en condiciones estables.
_ _ ._~ _ _..."'..,_:...- ... ~'~ ........ ""~~.'":-7,."""---,~ ... "...--'---~,""",o,-''''"'''''' " ... ~-'.-"'->"""' __ ,.".'""',_'_...~r_'~·~- ..

!
icion de OBJETIVOS

, rdo con
Inocular un microorganismo en' diferentes medios de cultivo y observar sus
caracterrsticas d~ crecimiento.

33
Manual de Microbiologia . .Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia'

Practicar los diferentes metod os de siembra de cultivo. • Flamear nuevamente los bordes de los tubas, C
,.
tapas a los mismos.
MATERIALES • Flamear el asa.
• Cepas puras de bacterias Gram positivas y Gram negativas • Incubar a temperatura de 37°C por 24 a 48 hare
• Mechero
,
...
• Asas y agujas de inoculacion
-=-r A colo r
• Incubadora . C)',tl-~
--. Cinta de enmascarar l-j ,60.5 I:: '5/\
• Espatula de Digrasky
~O, '.j-:t-S·

• Medios de cultivo: Agar Nutritivo" Caldo Nutritivo. ~C) _


-~,,-----
--
'"

PROCEDIMIENTO . c
·,r (.(',· .
_----."'7".:-......·-7/ ')' --- ---'-­
Para aislar y cultivar un microorganismo de acuerdo a la procedencia del
, '\ < ' " •

inoculo, y de donde se vaya a inocular, se utilizan varios metodos.asr:.


, , -

Inocular de un Medio de Cultivo en Caldo a otro Caldo


• Rotular cada uno de los tubos con nombre del estudiante, dra, hora, medio Siemb! i

de cultivo y nombre de la cepa.


, ~
"
Para es'
• . Realizar cada siembra frente al mechero. enlos'b~
- 'I
I
• Flamea~ el asa de inoculacion y quitar los tapones a los tubos con cultivo y . • Tom
!
a los que conti en en el caldo que sera incubado, evitando el contacto con bise!

i
la llama. . /\ antel
,
• Flamear los bordes de ambos tubos e introducir el asa dentro del tubo con
. ~
• HacE I':
. ~

cultivo, obteniendo un ,inoculo.. • Inoc\


I
• Introducir y sumergir el inoculo dentro del tubo con el medio de caldo de • Flam
cultivo esteril. • IncuJ
• . Sacar el asa y pasarla por las paredes internas del tubo para eliminar

cualquier exceso de inoculo.

34
...
, \

.Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia' ~\ Olga Ines Montoya Campuzano

I.
netodos·de siembra de cultivo .. • Flamear nueva mente los bordes de los tubos, colocandoles los tapones 0
tapas a los mismos.
• Flamear el asa.
~rias'Gram positivas y Gram negativas • Incubar a temperatura de 37°C por 24 a 48 horas. (Figura 6.1)

iculor~
!
d ~~2
ll-'SY~.
! . .
Ff
, ruJJ
~ q _.- ~\
I
--
-1--
;:-­
V
". ,c: ;"1 ~-----.

mcia del

. v.
Figura 6.1. Incubaci6n en caldo
j

. . . "..
.a, medio Siembra de Cultivoen Tubo con Agar Inclinado
Para est~ sJembra hay que ~er en cuenta los mismos easo~ que s~ ~gu~n
~,?;di~re:en la man~i~_~~Ciliza la siem~r§.
ultivo Y • Tomar el tubo de ensayo esteril con el agar inclinado de manera que el
bisel 0 pico de flauta quede al frente destapandose del modo ya explicado
I anteriormente.
I
: • .Hacer un movimiento cuidadoso con el asa.
! • Inocul~r erl zigz~g enla superficie del medio de cultivo.
• Flamear la boca del tubo y taparlo.

'? )<d~..; "/ • Incubar a temperatura de 37°C p~r 24 a 48 horas (Figura 6.2)

"" ~ . 'J -1 K 5
~v \ ~ ~ ~ ~ \' J\l)

35
Manual de Microblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de. Microblologfa

Figura 6.2. Inoculacion en bisel

Siembra
~-- ...
par ---
Picadurll
---------­ - ~

Se utiliza un tuba de ensayo esteril que contenga media de cultivo


----"'---..,----*.. --.--;-"-~-"-,, .~.-,". ," .---~,--------~--- -~-~

semisolido,
," __ ._~" __ *. ___.__
._.,~,
se .,._-
usa "_~_,, .•
para .qeterrlJll]ar
_.~,_, ___ -- - .. _"__ '"' "'~--_"_A
el___,....___
comportamiento' de
~._ ._........ ___ ~_~.~ __ ~.--~.~_,~-_

los
,
microorganismos en ~reselJc~a d~ oxigeno, para observar su crecimiento y
~_ ••• ______ ~_*_.".' __ ._.......... - . , .__ ____ r
~ - - ____ .. -,,- ," •• ~- _ _ _ "'_ ' ' ' - __. _ ' __ .M ___ ._~_~_ . . .- - ­ '_ _' _

r:no~~~~~~Q !_c~!'10.~~ra I~ er~~E!r.vaC?i9n pe 10s~y!!iY.9_~.~~_~~ri?n9~U;!~~~-,-~_~s


~ . ,

ti,emp_o.

En esta siembra, se procede de la siguiente manera:

',.' ~----- -----... -~ '- .-------.-----­

• Tomar un inocula con el asa en forma de aguja.


• Introducir el inocula en el tuba, hacienda una puncion en el centro del
media de cultivo y en fonda se hace un giro de 180° para asegurarse que
la muestra quede en ,el media.
• Retir~r la ag,uja can cuidado.
• Flamear la boca del tuba, y taparlo.
• Incubar a temperatura de 37°C par 24 a 48 horas (Figura 6.3)

36
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de,Microbioiogia , Olga lties Montoya Campuzano

Figura 6.3. Inoculaci6n en agar s6lido

Siembra y Resiembra en Placa


Se puede realizar: a nivel·. de superficie 0 en profundidad. La siembra en
-_._------- "--"--- . .

, cultivo ~ci~~~-agar pue~ s~~~~s~cion, estrias Y_, diseminacion. En


k~~~ -
cambio, la resiembra solo puede ser por estrfa Y diseminacion.
---------------._--- ,

~!~-; • Siembra por Exposici6h


te mas

Se utiliza esta siembra para conocer la microbiota presente en el aire, porque


------"--.-"'-------~..-.----~.- ------­
los microorganismos que se encuentran allr, caen a \a superficie del agar,
desarrollandose Y formando colonias.
; del
• Tomar una caja de petri con medio de cultivo solido, esteril y fr~o.
• Abrir la caja de petri en un lugar seleccionado, durante 5 0 10 minutos
aproximadamente.
• Tapar, incubar a 30°C durante 24-48 horas. (Figura 6.4)

\()~v).
\
~ \
\'
37 ,
t'
Manual de M/croblologia ;." Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de M/croblologia Cl

!. Coloear el in6culo en uno de Jos extremos del m


,

encuentra en la eaja de petri.

• Extender la muestra en forma continua, hasta ur


I. Flamear de~--_ _ _ __
). Enfriar el i ! 1- ­
Figura 6.4. Siembra por exposici6n.. I desde dOl,i' C/,4'1 c
!t-"'- ~
f') c.(
siempre f(
f! Li,G'1S I .:::,
Ii .~O/31--$
• Siembra por Estrias • Repetir ef .

(l

En la resiembra por estrias, se puede utilizar varios metodos: EI Frances. el • Rotular c .


t' tX-.~-
, I
_ -9 __
Clasico y el,Radial. • Incubar e :
f" !

1 ,
~ -

i)Lr ,'"
EI Metodo Frances es el mas utilizado en Microbiologia, porque favorece el ____' --"...-,-"",/ I

---.-~-- ~- .. --------- '- ... _._-­ NOTA: En/'.



,:.' i /
aislamiento de colonias la observaci6n de las earacteristieas de cultivo que se inici/
microbiano. Se reaJiza de la siguiente manera:
---.-~.--' --' .

r. Flamear el asa, enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo esteril;
tomar la nluestra del material que utilizara.(Figura 6.5)

/: .'
"
I

f ~).slS '

r· ~~~V~~j
,!

, . "

Figura 6.5. Toma de muestra

38
Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano

• Colocar el inoculo en uno de los extremos del medio de cultivo que se

encuentra en la caja de petri.

• Extender la muestra en forma continua, hasta una cuarta parte del medio
• Flamear de nuevo.
• Enfriar el asa y proceder a hacer 4 0 5 estrias formando un angulo recto
desde donde se hizo la primera siembra, hacer otras 3 0 4 estrias,
siempre formando angulo recto con el origen.
• Repetir esta operacion hasta formar una especie de C.
• Rotular correctamente la caja de petri.
• Incubar a temperatura de 37°C durante 24-48 horas. (Figura 6.6)

\ NOTA: En el procedimiento de las estrias se debe esterilizar el asa cada vez


l que se inicie una nueva serie de estrias.

ff,

)()~ -­
-1 K~

,-.l~j ~~I,J\j)
\O~N 39
r - - - - I<
Manual de M/croblologia Olga
Manual de Microblologia .' Olga Ines Montoya Campuzano

. EI. Metodo_~Ias~~o, se utiliza cuando el ~~l~!ivo_~~..


de microorganismos en una muestra.-9.ad~
---.------.............-~------"~--.-~~.-~-'- . - ----­
• Flamear el asa y enfriarla en uno de los bordes del
.• Tomar la muestra.
• Colocar el inocula en uno de los extremos de la ca
• Extender la muestra de un extrema a otro, en zi,

:/'
k;,~

l· .2
--r:-
:lcP c..
2 3)0
,J) ()<t«31
gct·2.. ­
/,/'\
I
!<
:2-3
2,.0

2. Sc q91­

4. Hacer estrfas 5. ResUltados despues de incubar 24 - 48 horas

Figura 6.6. Pasos para la siembra en el metodo Frances


,
i b/3:r~
. ,I

O/12'S""
?~31"O) c
40
LJ/'\ Od

Olga Ines Montoya Campuzano > Manual de Microbiologia , Olga Ines Montoya Campuzano

EI, Metodo Clasico, se utiliza cuando el objetivo es determinar la presencia


~_ _ _ _ .~_ .,_~,,_ ~"'~_'''""~_~"_~'''_' _._'" "M~ _ _ _ ' _ •• _ _ " _ _ _ ~_' ..-'

r:
de microorganismos en una muestra dada .
...-----.~-"---,-.~.------"".,--~--,,----"~-""-------..-->­

·~:::~~ae~:e:~;.nfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo,

• C%car el in6culo en uno de los extremos de la caja de petri.


• Extender la muestra de un extremo a otro, en zigzag sobre toda e/ area
de la caja.
• Rotular las cajas con sus respectivos nombres e incubar a 37°C durante
II..
. 24-48 horas. (Figura 6.7),

Figura 6.7. Siembra metodo clasico.

EI Metodo Radial, presenta ~L!J1J~,!:!~ objetivo.,..9ue el metodo clasico.


_ _--.. - _ _ _ _ _ _ _ _ " ... __ ~~ .,_ _ '_W'"''

• Flamear el asa y enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo.

s • Tomar la muestra.
.• Colocar el in6culo en uno de los.extremos de la caja de petri.
• Extender la muestra de un extremo a otro, en zigzag hasta una tercera
parte del area de la caja.
• Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag, d~1 extrema
izquierdo partiendo 'del inoculo inicial.

rd~r no '> Co"

ydt . I
41
Manual de Mlcroblologia' . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia

.Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a-hacer


,
zigzag'de la parte
central del inocula'inicial.
• Flamear de' nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag del extremo
.::"::- : -;-.~' ..
derecho del inoculo inicial. (Figura 6.8) . ..- -> (V:,"
:<:~.,~·-r-"--~----"-~-~~''-.._ _~_ _ _....:.

r:-
'-",

/:'>

;':"C;
2-cP c..
23)0
2 S'C

9 Qg,2-'X

. Figura
"'l

(a) (b)
4.3 Siej'

. Se emQIE (01') Dt-~ S '3

6­ .~--

~~~
Figura 6.S. (a) Siembra metodo radial (b) desarrollo de su colonia 1~'O-, ~-qOO'

se utiliza \f\...::L- -4 .J:- ~ '1 _..


EI Metodo en cruz:
_ _' _ _ _ _ M • • • ~" ••• " _ _ _ " ._ _ _ _ ~_ •• _ _ _
Es ~~~i~a~_~_pa~_<:).1:>~_~~_~r la presencia de enzimas ~--"-'~o~J . J> \T -, .
producidas por los microorganismos, estemetodo
.___--_ . . _________--___...____0_,_
en la realizaci6n de pruebas biogufmicas.
, ..---.-­
-~-~---------------.--:---- .. -~.----
. de siembra se practicara

• Flamear .el asa y enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo.
--~-
sObrl
• Este
-03
--rob)er
-210 -j .
A-LJ_
C
por I
• Tomar la muestra.
• Enfrf
~ <J f) .l J f4 I (t,.<AJ,e.)
• Proceder a sembrar como 10 indica la figura 6.9
HIe-lAC! vt I-\- / f0;D
: ~:~
• Fla
- - - - - f -----_
b/3+S'
0112S­
L// s­
6)/ , 2-~--
42
Olga Intis Montoya Campuzano Manual de Microbiologia Olga Intis Montoya Camplizano

:mfriar 91 asa y procedera, hacer zigzag'de la parte


licial.
~nfriar el asa y proceder a hacer zigzag del extremo
I

hiciaI. (Figura 6.8)

,r~.
e.
,..
,
.. '
.

(a) (b)

.Figura 6.9. (a)Siembra metodo en cruz (b) desarrollo de su colonia

4.3 ~mbra por Diseininaci6n


. ~~ emEle_a este metodo, ~on el fin de adelgazar la muestr~"_para que en la
superficie del agar queden las colonias' separadas para esparCir la muestra
---""--7"~""--"--"----"""""-·~----. "---''-''---- -":------;:"....:,--,--.._.:......_______
se utiliza una va rill a de cristal, previamente esterilizada.
~~,._~ _ _ _ ~----,.~",._. ,-~.,.., •• _ _ .~ ' ..... _ , _ . " . . . . ~_ . . . . . . ~~, , , . . _...." ' ' ' ' _ _ " "•• "_"',.._._~~._ . ._ •• ~"" _ _ ,,.. ._ . , _ _• • ,,,~,,_. ,.•• _,, _ _ _ . . . . > o· , . _ _ _ ,."'~_"' ~ ___'"

• Inocular entre 0.1 a 0.2 ml de la muestra previamente homogeneizada.


sobre la caja de petri con el respectiv~ medio de cultivo .
• Esterilizar la espatulade vidrio, introduciendola en alcohol y luego pasarla
ultivo.
por la llama.
• Enfriar la espatula pasandola por la tapa de la caja de petri.
.• Pasarsuavemente la espatula sobre la muestra.
!

• Observar que quede completamenteabsorbida sobre la superficie del


medio de cultivo (figura 6.10)
• Flamear de nuevo la espatula y descartarla.

43
Manual de Microblologia " Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblolog/a o

I':'
20"':)(
23-'0
2 s' C
Fi
. IOf) fX-_ ~
SUMERGIR LA VARILLA
EHAlCO,HOl EXTENDER SOBRE
LAPLACA Observaci6n d
--
FLAMEAR LA VARILLA
Una colonia es
Figura 6.10. Extendido de la muestra metodo por diseminaci6n.
cel~a..9~_h~

Siembra en Profundidad
Las diversas E
forma y color
caracteristicas
I
.Ci~sificaci6nj
Esta. tecnica, se utiliza para aisl?lr microorganismos procedentes de una
~ • ~~ _ _ _ _ O_ _ _ " ' _ ' _ ' _ _ ' _ _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _ - - - ' - _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _
• - _ _ ~_. ~,

muestra de suelo, alimento, agua entre otros; el aislamiento se puede hacer


. -.~-, ...,~".,-., ,--,- , .... _. "-.--~-.. -'"'-~."-,-,.-.-- .... --~-.~----.---

directamente de la muestra 0 por medio de las diluciones.


-.-"-.. ... ..
. . . -, -----.~ , -~,------.
Por 10 generc::

- - - - - --j

En ,esta tecnica, primero se adiciona la muestra dentro de la caja de petri c!~~!d.0 ~I~~~ .

vacla y luego se vierte el medio de cultivo fundido a una temperatura de tie~er1l

50°C, se mezcla cuidadosamente, con el fin homogeneizar bien lamuestra.

·.," ~~~:~
r
Tomar 1 ml de la muestra,previamente preparada.
unas de otl
Adicionar a una caja de petri vacla, debidamentemarcada
• Mezclar 20 ml del medio de cultivo fundido. (SQoC)
Forma: aI
• Hacer movimientos circulares con la direccion de las manec!"as ,del reloj,
Tamail0=l
devolver el movimiento al contra rio. Hasta que el medio solidifique
-, " " t '.: " " " " "
unas fra~
• Incubar con las condiciones indicadas. (Figura 6.11)
a 10 m~
colonias

44

Ito", '.
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microb/ologia Olga Ines Montoya Campuzano

Figura 6.11. Siembra metodo en profundidad.

;
EmNDER SOBRE
LAPlACA Observaci6n de las Colonias Microbianas
Una colonia es una__.'_poblacion
., ..
de celulas microbianas, originada por una
.._" __.___ _._._~_~.~~.~",n ._,""F~ __ ~_' ____··_ , ""'~ __'""-""'-_ _ _ _ ~ _ _ _ _ _- - _

celula que ha formado varias generaciones en un medio de cultivo solido.


~--'-~---'-'*'-'-"-"-'--.---.--------,~.-.".-,--"'-,---:...--~,---.-~-~--"---- ....- - -.. -~-~-.".'--.'-.~---.,----.- .... ~ ..... ---~.-.~----

Las diversas especies microbianas forman colonias diferentes' en tamano,


forma y color dependiendo de las condiciones de medio de cultivo. Estas
caracteristicas, observadas a simple vista se tienen en cuenta para su
clasificacion.

Por 10 general colonias (ormadas al interior del agar toman la forma lenticular,
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _••,.. _.,_~ _ _ .. _ _ . . _._~ ______,.,_ _ • _ ~~_. ._ • _ _ ._"...._ _ _ ,~'""_:_ _ ~_ _ ' " : _.... _ _ w' _ _ _ _ _ _ • _ _ ~ ••• ~~ _ _ .... _ _ --""""---~"

debido a la presion que la colonia sufre dentro del medio, p~r 10 tanto, no se
--,,"._"" ~",","~--..---.....:.,,,.-,---,-.-------,,,.-----.-.,.~-..,- "'~'''''''~--''''''''-'':'---'--.''''-'''''"-~~-''-'''"'-''-----'--

tiene
"',-
en cuenta para su evaluacion.__ .
. '-·-" ..- - . - - . ·_ _ _ _ _ _ __
.-'~"- ~:'n,. "~.,~~.

CARACTERlZACI6N DE LA COLONIA
Las caracterlsticas que se evaluan en las colonias que crecen separadas
-~-~-- .. - . - - - . - - .

unas de otras en la superficie de medios de cultivo son:


. ----.

Forma: Circular, irregular, rizoide


-----.--.~-~.----'.-~-.--.-----'""""""'.---~.

\as del reloj,


Tamafto: EI tamano de las colonias van desde !T'uy_~equ~, midiendo
~ue
unas fraccio~~~_sr~_!!IH'_'!!~!r~:~U;!.~._clL~metIQ hasta ~.~y_grand~~ midiendo de_~
a 10 mm. Cuando una colonia. mide_.!!1e!:l0s de 1mm songenominada~
colonias
- - con punta
...-.--
de ............••..••..
alfiler,- 0....puntiformes.
--~.-- -_.•._.•......_-_.......­
..--~.

45
Manual de Microbiologia '. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa

~--:~'''''"~
f ~
i:
Cromogenesis Pigmentaci6n: Una de las caracterlsticas mas notables :i·.
- ..--~--.--.---
0
.
,
,
'.

de los cultivos, se observan en algunas especies'productores de pigm~ntos,


,: r ,.
que este, puede ser retenido dentro de las celulas de manera que la masa •
celular se colorea, mientras que en otras especies, el pigmentos es
excretado coloreandose el medio de cultivo. Se debe determinar si el color
-r:­
~c)'j C
es soluble no en el medio.
0
..- - - - - -.. -c-.- ­ 2 3J0
2. Sc
Elevaci6n: La colonia pueden ser IT'u~}in~j~r:>lanada), o.gruesas (elevada)
cuando una colonia es ...elevada
---~----.-~--.---~.----.- -.
presenta diferentes
- ---- ..
grados
,---~,
de convexidad-­0
._---_.- .. ----~ ~.~-,-~--.-

j:j~C!..rDJ.n_e!l~.
, .

Su~err.cie: Lisa, rugosa mate, brill ante.


:--;-- ---------.. --t--------------·-~-·--..··--- ----,,­

lJ3orde: Los bordes de las'colonias presentan.diferentes tipos de acuerdo a la


especie a estudiar asi: Liso, ondulado, dentado, rizoide.
-- ..------~------,~~,----

C~l1s~tencia: Cremosa,
. . . . . ..___. _... ___'_ -viscosa,
-~.--:--_"'~ ~ .-' -_._, _granulada.
__._4_.'_'__ __ "_.
~_·_. _~_

Desarrollo de un medio de cultivo liquido: Se 'observa el crecimientQ.


--._-----_.
microbiano con .base a . la cantidad de desarrollo ya seaescaso,
~ - moderado..--­0 -~

abundante; distribuci6n - del


-~-
desarrollo en el' caldo' unif6rmente
.... .....----.- .. ~ -_. distribuido
._----_..... __ ..­
(turbiedad uniforme). Desarrollo confinado a la superficie del caldo a traves
~.---.,---- ............-.. " -----~-----
de la formaci6n de pelicula membranosa 0 lisa, en supei-ficie, formaci6n de
---:-------~---.-~--. - - ~---.- '- -.-~,---- - -~------ . ---,--- -----------~-,--------~---

floculos, anillos,' 0 que aeumule como sedimentos. (Figura 6.12.)


bI3+~

0112~
1-11 S­
())/ ,2-S
46 ..
, Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa , ' , Olga Ines Montoya Campuzano

~aci6n: Una de las caracteristicas mas notables


~'''~~--
!n en algunas especiesproductores de pigm~ntos.
,
f !'
ido dentro'de las celulas de manera que la masa
f;
• -_·
tras__D'.!~'- - - .=.-·=-·'=--=-.::;::::;--:::;;:·----;:::;;..--~~I pigmentos es t
;-

.
'j
"l~_'->''';'
'

, minar si el color

\.
I

(a) (b) (c)


Figura 6.12. Desarrollo de colonias en medio liquido
(a) en superficie, (b) sedimentos, (c) en fl6culos

Capacidad para emulsionarse: ~,g~r:!~~U~_~c::>J9IJja~_pueden formar suspensi6n


~-~, ----.~,,----.-, .-....--.~~-~---... - --."-----~ •• --~ _ -,,----.~-~-"~ ~ -"<"" -.--,,~ ~--.----'--~--

turbia uniforme; 0 suspensi6n granular en agua, otras no se emulsionan.


. _~~~,~ _ ....e.'._ ~~'_"" __ ~,~ ..,_;.,',._ ,. _ _ • . . .,..... "_.,~ __ '. " ., ~ . ___ _ _.. ,,~ ~_ •

La presencia 0 ausencia de olor se detecta comparando con los olores


conocidos; como ?i?f naus:abundo, olor_~~idg,putrido oJmp.~~~~pl!!?J~_~_Q~.!:..e
otros.

Desarrollo del medio de cultivo semis6lido: Crecimiento a 10 _____


________ _ _ __ ____
largo.. de
.__
la_
___ __" __ _ _ _...... w _

I
~_!-_ ~~ ~ .""'""""--~ ____ .- r_ ~ • _____ ~_w .,_~_ _,_~, ~

linea de inoculaci6n que puede ser Iimitado a la zona de picadura 0


w ~ ___ '_","___ ~." • ,,~_ ,. ~ " " ••• _ _ ~~_.+4.-.,_ .-", • - - - ._ _

extenderse mas alia de la picadura. (Figura 6.13)


I
J,J
l~ole.s
l------f

• 47

. Manual de Mlcroblo/og/a Olga Ines Montoya Campuzano Manua1.de Mlcroblo/og/a (

Actividades
Observar las caracteristicas de crecimiento en ca

.
~""~,! ...~'~\

(a) (b)
6.13~·· Desarrollo de una colonia en un medio semis6lido
(a)inm6vil,(b)m6vil

Desarrollo del mediode cultivo. s6lido en bisel


En la figura6:14, se observan las caracteristicas de crecimiento en un medio
- .... -. ,,--~.----,-.....---.

de cultivo solido en bisel. ,

.r... .1

lii\ %~\
I ~,' "it ,

'f;;: f ~.".{ \ .', ' :,"J


~~'~ \.~~:S:/'
RIlOlDE AIt:lORESCENTE ESPARCIOO

Figura 6.14. Desarrollo de un cultivo en un medio s6lido

48
Olga Ines Montoya 'Campuzano Manual de Mlcroblo/ogia Olga Ines Montoya Campuzano'

Actividades

Observar las caracteristicas de crecimiento en cada uno de los metodos de

siembra.

, '
Cual metodo de siembra en caja de petri considera mejor y por que?

,q1-1 b~lJ-~~~~ \ .
recimiento en un medio

ESPARCIDO

,Iio s6lido

49

Manual de Mlcroblologia ,. . Olga InfMJ Montoya Campuzano ,


M.JI7ual de MlcTobloiog/a

..
. ... ,,~.,,~,"1>

pRACTICA 7
Se puede considerar este metodo indirect~deb
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
celulas, puede dar origen\a una
... ') -._- _
"'.-;'. .,' ~ "",,,"~, .....-. _
COlo~j~:'~po'r
...--_.
,)., .... ,," ~--- .,."" .-~
'10 ~
- ------­ - ~-
,
_ ,-,'­

, '. ~

INTRODUCCl6N .'
~
2cP(
EI numero de microorganismos en una muestra (agua, suelo, aire, alimento entre 2 3)0
otros), es un parametro importante porque permite evaluar la calidad microbiana
2S'C
de esta. Los metodos mas emp\eados son: Numero Mas Probable (N.M.P.),
Recuento en Placa, turbidimetria, Conteo Directo al microscopio, que tiene la
desventaja que incluye celulas muertas y vivas a no ser que se utilice una tincion
. '
especial.

En esta practica, se tend ran en cuenta dos metodos: e\ Metodo de Recuento en


Placa y el de Tubos Multiples de Fermentacion (NMP).
\ ) - \) T 'f'- lr03~Cj
()/O()~OO'l. ?l 0,<::01002:>
OBJETIVOS
II -)

1. Practicar los diferentes metodos de recuento de microorganismos.


_1
I
2. Detectar la presencia de coliformes y enterococos, utilizando la tecnica del
Numero Mas Probable. (Tubos multiples de fermentacion).

RECUENTO EN PLACA

Este metodo esta b~sado en la ~~1~ci~r.1,::~~OIiG8 de que a partir de una celula


'" -, ".-, ......- ' ,

bacteriana se origina una," colonia. Se tomara una cantidad de muestra


representativa que sera diluida tantas veces como sea necesario, para obtener un
recuento de Unidades Formadores de Colonia (U.F.C) entre 30 y 300.

0112s.­
LJ/ S­
-Q).II2-~-
50
Olga Ines Montoya Campuzano ,
Manual de MlcTobloJogla '-,;, ;\', Olga lnes MOlltoya C,mpuzano
"'\'<'y).J
rJ.»~
, 't_'

PRACTICA 7
UENTO DE MICROORGANISMOS Se puede considerar este metodo I indirecl9 debldo a que una agrupaci6n de
\ , ',' " , ' " ';',' ,,' - - >

I celulas,puede dar origen\a'ima cOlom~~"~-Por 10 anterior, el ;imer~"de colonias


~~,= ....«-'-.."'". '" -"'-C',-::'~::~ -:;~';:'''_J~''-'' -_._-- ,

co~_adas p,uecje ser rT1E!not qU~1 numero real de celulas Indivlduales presentes 0

algunas b_acleri~S no son' capaCfi-~de ror~a, r colonias visibles bajo las condiciones
,
r'-'­ , empleadas en el procedlm lerno ormal debldo a danos fiSjOIOglco~ ocaslonados
~' alimento entre
8\ ~ ,dad microbiana por condiciones ambientales '~~Lec"u~dasl po~a disponibllldad d,e nutrlentes, 0

presencia de algunos t6xlc~s,-;:ernr~ olros. '


qq1 "(. ''fCDZ"j
I~I
, '\able (N.M.P.), , \ r . ,

.. /

" , que tiene la

L - qq ':j-, 4 CO ~\. Ice una tinci6n MATERIALES Y METODOS

b-?< , --1' "', '~\)


-- -'-',
, ex,q 1-
I
b?- v-
'j IrC'' ~
~. Recuento en • Tubos de ensayo con 9 mt de agua peptonad'a al 0.1% PN para las dilucio'nes.
• Cajas de petri e~teriles vac/as.
. \
_
,

• Cajas de petri con Agar Plate Count (PC) 0 Agar Nutritivo.

\ .- Pipelas esleriles de1 ml.

• Esp~tulas de, Digrasky.


• Muestras por analizar.
- . Cuenla colonias

PROCEDIMIENTO

• A cada dos estudiantes se les entregaran cuatro lubos de ensayo, cada unQ

c~m 9 ml. de agua peptonada al 0.1 % PN.

a celula
, \ '
• Homogeneizar la mueslra mez,clandola cUidadosamente, invirtiendo varias

ruestra
veces el recipiente q~e la contenga, a fin de tener uniformidad.

rner un
• Hacer diluciones 10 1- 10 2 -10 3 dependie ndo del origen de la mueslra a

analizar.

• Tomar con una pipela esteril, 1 ml. de la mueslra y pasar a/ primer tubo (Tubo

\ 51
Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla

1) de ensayo con 9 ml. de agua peptonada al 0.1% PN. (diluci6n 101).


• Oejar escurrir la pipeta, sin que se ponga en contacto con el agua peptonada.
• Agitar, el tubo en vortex 0 normal mente.
• Inocular en la cajas de petri vacias as!:

~'o/t~etodo en Profundidad
• Llevar por separado 1 ml. de cada diluci6n a la caja de petri
• Verter 20 ml. de agar Cuenta Germenes 0 Nutritivo Temperado a 45°C.
• Mezclar, con 4 movimientos circulares suaves en la direcci6n de las agujas
del reloj, y Luegoen el sentido contrario para aislar bacterias presentes en
la muestra.
• Oejar enfriar el Agar hasta que solidifique
• Incubar las cajas invertidas a 37°C durante24-48 horas.

Metodo en Superficie

\ )-t)?Y'-C
O,OOIOcYl It OJCOlcO~
Inocular en las cajas de petri sobre la superficie del Agar as!:

lOt') LX -.. S ~,'3


• Tomar 0.2 ml. de cada una de las diluciones. 6 -- ...: ::=---­
........

1)<'10-. ,>(-01 00' 0


• Verter por separado sobre el agar en cada caja de petri, respectivamente. 1U
. F9 , ~f\.~ -4 J- '1 _ ,~f)
• Esparcir con la espatula, por toda el area de la caja, con movimientos
J> -V~J
EI NMP

4=b -I . Cc-~
circulares, hasta que se agote la muestra.

1
• Incubar las cajas, invertidas a 37°C durante24-48 horas. aprecia '/
Se consi
l
3 .2
·---robler
10
A-L1. '
de estud
Nota: La espatula se esteriliza pasando por alcohol absoluto y f1ameandola. Se
~ 0f'1'l j /4 I ( "",-cJ ,z)
enfrra y se utiliza
EsteJ 01c-~c<v( 4 / /?~C>(~
numerol - - - - f ____
Probabl b/3+S'

52
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de "'Icrob/alogia Olga Ines Montoya Campuzano

!
I

~e agua peptonada al 0.1% PN. (dilueion 101).


i ~ .
ISIn que se ponga en eontacto con el agua peptonada.
onormal mente. " ....1m1 1....1m1
!
)etri vaefas asf: ~~

~I
II I !l­
-----­ ~-==------..=--====
i\! il "onada
O.1%pJII
AQUa

l'
I; i <!
, II

i 1." II ,I
~;
n
!'
1. 2 '.,

I fI
ls.o.9m1
I

r
100 mI de muestra 1....1 mI I

Figura 7.1. Recuento de microorganismos (metodo de las diluciones)

EI NMP se llama el metodo de los Tubos Multiples de Fermentaeion, porque se


apreeia la capaeidad que tiene el microorganismo de fermentar un earbohidrato.
-----.-------,-~----.-~~-- .•• ~.---~-- ~".-. ' - ' - ' .•.- ". - «. '~'-'-"'--"-~ ..........

Se eonsidera que la prueba es.~sitiv~ euando la bacteria fermenta el earbohidrato


de estudio produeiendo gas 0 turbidez .
.-...."'..~~ ••.• "".''','.,;~~--:t:.~;.:;'''~

Este'metodo se basa en las leyes de probabilidades, obteniendose estimaeion del


numero de baeterias en una muestra que se expresa como el Numero Mas
Probable (NMP).

?~lt"'IO) Co" \
I
i 53
0~ \
Manual de Mlcroblo/ogfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblo/ogia

Se puede estimar el NMP de diferentes especies de microorganismos como Materiales


Coliformes Totales y E. coli, Enterococos, Pseudomonas, Clostridium entre otros,
• 9 tub'­
cambiando sola mente los medias de cultivos. Asi, can caldo Lauril Sulfato, Caldo
Lact -r­
Brila, Caldo Lactosado se determinan los Coliformes y E. coli, el caldo cetrimide se conc
~c)-:> l
usa para Pseudomonas; Clostridium en el caldo SPS y los enterococos en los 2 3)(')
I
• Cam
Ccaldos: Glucosa azida y Purpura de Bromocresol azida. 2. 'SC
• Tubal
• Tuba
EI NMP de coliformes y E. coli, ha sido el metoda mas utilizado en analisis
• Pipet
microbiol6gicos de rutina en alimentos yagua. Para su determinaci6n existen dos . I
• CaJas,
metodas el clasico y el rapido. EI metoda clasico se realiza en cuatro fases
• Asas
diferentes: Presuntiva, Confirmativa, Completa' y el Test de Mackenzie, para dar el
resultado se demora de 3 a 5 dias. En cambia, en el metoda rapido se hace en • Mech

una fase y se observan los resultados a las 24 horas. • PariuE


• Mues~
EI Metodo Cilisico
prOC8di1
La Prueba Presuntiva consiste en recuperar los microorganismos, inoculandolos
Prueba P
en un caldo lactosado, que se caracteriza par ser un media de enriquecimiento.
campana
Can la Prueba Conflrmativa se ratifica la presencia de los Coliformes, se inoculan
I • 3 tu~oi'
I

los tubas positivos de la prueba presuntiva en un media de cultivo selectivo Caldo .


Lactosado Verde Bilis Brillante (BRILA) . En la Prueba Completa se di~encia las I • 6 tubo~
I colonias de coliformes totales cuando se inoculan en un media de cultivo
'~'--I
! • prepa]
l
! diferencial como es el Agar EMB (Eosina Azul de Metileno). En el Test de • 'Tomar
Mackenzie se diferencian los Coliformes Totales y E. coli utilizando en un media
• Deposi
! • Tomar'

I
f
de cultivo diferencial como es el caldo Eijkman que contiene Lactosa y Triptofano, I'
incubados a una temperatura de 44.5 °C; los Coliformes Totales aunque contien,
! ! bI3i-~

fermentan la Lactosa y producen Indol no 10 pueden hacer a esa temperatura, en • Tomar (


cambia la E. coli si 10 hace. .restanti O,I:2S;

• Agitar sl LII~
muestrl '6J, ,2.-S"
if
54
I ---
t ~,~-
Ol"a In~ Montoya Campuzano Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano

~p de diferentes especies de microorganismos como Materiales


I

oli, Enterococos, Pseudomonas Clostridium entre otros


! , ' J J
• 9 tubos de Caldo Lactosado distribuidos asi: 3 Tubos con 10 ml de Caldo
l medios de cultivos. As!, con caldo Lauril Sulfato Caldo
Lactosado con doble concentraci6n. 6 tubos con 9 ml. de Caldo Lactosado de
: . I

,determinan los Coliformes y E. coli, el caldo cetrimide se


concentraci6n sencilla ..
;Clostridium en el.£9ld~-· s enterococos en los
• .Campanas de Durham
• Tubos con Caldo Brilla
• Tubos con' Caldo Ejjkman
tilizado en anal isis
L .. .
\lnaclon eXlsten dos
• Pipetas de 10ml. Sml. 1ml.

~ 4 «) ~) ,a en cuatro fases
• Cajas de petri con Agar EMB

--l ~~kenzie, para dar el • Asas

G\C\ 1-', ~?- V-~ Ir() "


\.~,
~ fapido se hace en
• Mecheros
• Pariuelos desechables

-------- .
. I ~~
• Muestra analizar

f),1 ('0/
~ /'f'\C?J
1.. "\
),
~, inoculandolos
Procedimiento

Prueba Presuntiva: Se hace con nueve (9) tubos con Caldo Lactosado, mas
'>:! \ ',~ .. nriquecimiento.
campan~ de Durham introducida en el tubo en forma invertida. dispuestos asi:
-1 ')<:.-- 1,002hX I Cl les, se inoculan
~electivo Caldo • 3 tLibos con 10 ml. con Caldo Lactosado de doble concentraci6n.

,OO\OO'l- _ qq9-)4)~\diferencia las • 6 tubos con 9 ml. con Cal do Lactosado de la preparaci6n inicial
J:..- ~1:. -
\ ,001..'0'
.' IY\"'"
,
io de cultivo • Pr~parar el homogeneizado de la muestra.

. '_ /' ~J - , el Test ~e


• Tomar 10 ml. de la muestra ml.

L('V'I- ct -v\ .,1g en un medlo • Depositar en cada uno de los tubos que contiene 10 ml. del medio de cultivo.

. J YTriptofano, • Tomar 3 ml. de la muestra y depositar de a 1 ml. en cada uno de los tubos que
es aunque contiene9 ml. del medio de cultivo..
• Tomar 0.3 ml de la muestra e inocular de a 0.1 ml. a cada uno de los tubos
restantes, con 9 mi. del medio de cultivo
• Agitar suavemente los tubos para asegurar una buena homogeneizacion de la
muestra con el.medio de cultivo.

?~. 1"'\0'> C60.

. 06t 55
r
.Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano 'Manual de Microbiologfa

• Incubar a37 °C. durante 24 - 48 horas. • Observar la formacion de colonias tfpicas de coli
• Leer a las 24 horas, los tubas cuidadosamente. briIJante.
• Reportar como positivo cada tuba que presente gas en la Campana de Durham
. ·'Testder
• Reincubar par otras 24 horas si no hay produccion de gas.
• Examinar de nuevo para observar presencia de gas. • Tom
• Remitir directamente a la prueba confirmativa todo tuba positivo. •. Inoc

• Descartar los tubas, si despues de las 48 horas siguen siendo negativos.. • Incu'

• Reportar la prueba presuntiva como negativa. '. Obs


-_ ~ _
IQ"I €

'. Adic
--
Prueba ~onfirmativa: Se realiza esta prueba a todos los tubes positivos en la, • Obsj
prueba presuntiva. • Seo
• Tomar un ml. de cada uno de los tubas positivos can Cal~o Lactosado, par
separado inocular en cada uno de los respectivos tubas con 9 ml. de Brilla', EINMR,
con Ca l\ ) - ,) T '/" l~
• Incubar a 37 °e. durante 24 - 48 horas.
O,OC10o'l. '"X. O/CX::)lCO~
• Observar en los tubas can Caldo Brilla la produccion de gas en la campana de
Durham.
• Registrar como tubas positivos, los que presenten gas en la campana de
Durham. Can estos tubas positivos se busca el numero de Coliformes Totales

I
en la tabla del NMP.

I[ .

Prueba Completa: Se realiza esta prueba a todos los tubas que dieron positivos I
en la prueba completa.
• Tomar una caja de petri con Agar EMB y divida la base de la caja en 5 a6 I
partes, can lapiz vidriograff, segun los tubas positivos que hayan dado, i
• Marcar en cada parte con el tuba respectivo,

b!3-1-~

• Inocular par metoda clasico cada tuba positivo en la parte correspondiente.


• Incubar a 37°e durante 24 - 48 horas. Ii
0,/2S­ res I no )


f~
1-//
'6)/ ,2-.:::::,-­
56
Olga Ines Montoya Campuzano "Manual de Microbiologla Olga Ines Montoya campuzano

~e 24 - 48 horas. • ·Observar la formaci6n de colonias tipicas de coliformes, que son de color verde
!
II tubos
. cuidadosamente.
... . brillante.
cada tubo que presente gas en la Gampana de Durham
[horas si ~o hay produccion de gas. Test de Mackenzy
~ observar presencia de gas. • Tomar con un asa la colonia representativa de lacaja de petri con Agar EMB.
la prueba confirmativa todo tubo positivo. .' Inocular en un tubo con Galdo Eijkman.
~espues de las 48 horas siguen siendo negativos .. • Incubar a 44.5 °G. durante 24-48 horas.
·uothl,g..cO.....,..-....-.',·.,. . ... I .• ' Observar a cada tube con Galdo Eijkman producci6n de gas.
j
,• Adicionar 5, gotas de Reactivo de Kovac's

:2- U - lenla
i
• , Observar aquellos tubos con produccion de gas y anillo rojo (indol po~itivo)
C\q'} ~ 'Qw,2:"T 1 • . Se confirma que en la muestra hay E. coli.
! por

7-, -_ qq ~, 4 ~~lIa EI NMP de Enterococos se realiza en dos fases: en la primera se utilizan 9 tubos

con Galdo Glucosa Azida distribuidos de la siguiente manera :

qq ~, b? k~ Ire> ~l lana de 3 tubos con 10 ml. de Galdo Glucosa Azida de doble concentraci6n.

6 tubos con 9 ml. de Galdo Glucosa Azida de concentracion sencilla ..

Se pro cede a inocular la muestra de igual manera que en el NMP de Goliformes,

se incuba a 37 aG durante 24 a 48 horas.

Los tubos que presentan turbidez. se inoculan de a 1 ml. en caldo purpura

Bromocresol se incuba a 37 aG. durante 24 a 48 horas, los Enterococos se

detectan cuando hay un cambio de color de purpura a amarillo en los tubo.

Para los resultados pro ceder a mirar en la tabla del NMP.

57

r
Manual de M/crablalogfa : Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Itt/croblalogfa

esto es posible porque el medio presenta dos sustn


. 5-bromo-4cloro-3-indolil-B-D galactopiranosido ( X:~
4- melilumbe i eol",1?-O-o"·"-...-"-'
I
I
. \. Y l)<:"l(r031
?-c)0 c.. .' gq 0· 2­
t
2 '?/0 f· (X
2S c V)~~
\
\
Figura 7.2. Numero Mas'Probable

I .

\.
'\

\.
20
-\-
'-'. .J1
~ - ' 4 '-­
Mtj .
l~
000'00'). "'X- o,CO\OO'b
\ , -1
L --r--; N 'S
\ QIJ (A-~ ---:'6":" "_OOO\OO'l..
- ~
\ 1.'1'\0 A"

~ J:..":!­
\0-;.. J;-
\ . f)
\ .-i,. ...)':.. ~ \1001
Posltivo Positivo
r Yd9· 2 10 j 0~J~
Figura 7.3. Resultados en la prueba NMP • ---lOb\e)' A~c J

'-...\unv.) 11\ c~ 1 (

Metodo Rapido

))A IC<\A~ \ I,/), J P00 e.S
t.. v
I

Es un metodo en el que se utiliza el mediode CultivoLMX que cOt:1tiene una alta I~ II - - - - - - ;


calidad alimenticia y un tampon fosfato, el cual garantiza un crecimiento rapido de
coliformes y el Lauril Sulfato que inhibe la presencia de bacterias Grar:n Positivas.
b,3=t~
Este medio facilita la identificacion simultanea de Coliformes Totales y E. coli ,

58

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya' Campuzano

esto es posible porque el medio presenta dos sustratos: Un sustrato cromogenico

5-bromo-4cloro-3-indolil-B-D galactopiran6sido ( X-GAL) y el sustrato f1uorogenico

4- metilumbeliferil-B-D glucuronido (MUG). EI XGAL reacciona especlficamente

con la enzima 13 -Galactosidasa dando un color verdeazul, esta enzima se

encuentra tanto en Coliformes Totales como en E coli. EI MUG reacciona con la

enzima 13- D-Glucoronidasa, dan do un compuesto fluorescente a la luz ultravioleta

[1' Smi de 360. nm; esta enzima solo esta presente en la Ecoli. EI medio de cultivo

. tambien tiene incluido . tript6fano, sustrato que utiliza el microorganismo para

producir indol.

Materiales
• 9 Tubos con 10 ml. de Caldo LMX
• Reactivo de Kovac's
• Lampara de Luz Ultravioleta 360 nm
'\ • Pipetas .1. ml.
• Papel desechable
• Cinta de enmascar
• Mechero
D. 1 _ -=..qq9-ILJ}~ • Muestra analizar.
,J­ -1:. 'Y\"".:.
I, OO'tb ~ I 0
PROCEDIMIENTO
6~J -vI. 0 ~o\ • Preparar las diluciones 101 _102 - 103 de la muestra a analizar.
• Pipetear1ml de la ·diluci6n 101, inocular a los tres primeros tubos con Galdo

f'1 «) .
ne una alta
LMX.

i f~e>{c.s
• Pipetear 1 ml de la diluci6n 102 , inocular en 3 tubos que contienen el Galdo

I . . I r
\to rapido de
Positivas.
Fluorocult LMX.
• Pipetear 1mlde Is diluci6n 103 , inocular en los 3 tubos restantescon el Galdo

~'''O) Cc.I"\
y E coli!
Fluorocult LMX.

I o~t o\\~ .
I _~ ~r~1 -1 c9--2-B 59
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia '

• Homogeneizar cada tubo 10 veces. Tabla 1. Numero Mas Prol


• Incubar a37 °C. durante 24 horas ..
Combinaci6n de 3 Tubospc
• Observar, en lostubos con Caldo LMX cambio de color de amarillo a verde ositivaL-_J--_ _ _ _--:"--,·""~
azul, son considerados positiv~s para Coliformes Totales.
• Tomar los tubos positiv~s para Coliformes Totales.
--r­
:Lc)~ L
• . Revelar en cuarto oscuro con la lampara de luz ultravioleta. 2 3)0
• Observar f1uorescencia. A estos tubos positiv~s 2 :s- (.
•., Agregar 0.2 ml del reactivo de K~vacs, agitar suavemente.
• Observar la aparici6n de un anillo de color rojo en la superficie de la capa
alcoh6lica. Positivo para Indol.

NOTA: Considerar como E. coli:

[J
Tubos de 'color verde - azul ,presencia de f1uorescencia y anillo de color rojo.

Anotar el numero de tubos confirmados como positivo de organismos coliformes

totales por diluci6n. Ejemplo:


lQ!) Dt. -... S - '3~_
De la diluci6n 101 contamos 3 tubos (+) 11'10- 6 - ;':;,00\00'1
De la diluci6n 102 contamos 2 tubos (+)
\S\~.2- -4 J __ ~ --1 y=- ~
De la diluci6n 103 contamos 1 tubos (+)
J> \J 'i l
I,', En la tabla del NMP, ubicamos el resLiltado obtenido 3-2-1 y obtenemos el
resultado de 150 Coliformes Totales {gr. 0 ml.
-y---lob)q
o9 /210 -1
A-LJ
De esta manera en 24 horas confirmamos E. coli por el color verde, fluorescencia
~ un")') Ill, (~cJ.J I
e indol positiv~ y Coliformes T otales por el color verde. , .
I
0.c.-lAaJ It I RJo{c~
Actividades

I
I
!
0
____ f ----­
-~

Anotar el Numero Mas Probable de coliformes fecales y'E. coli por diluci6n.
b/3i-S'
Buscar en la tabla del NMP anotar el resultado correspondiente.
0112-S;
L/I S­
I~ o 6J1 r2..S
60
t
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia • Olga Ines Montoya Campuzano

) 10veces., '
i Tabla 1. Numero Mas Probable.
124 horas. ,',

Son 'Caldo ,LMX cambio de color, de amarillo a verde


Combinaci6n de 3 Tubos por diluci6n
positivas
:ositivos para Coliformes Totales.'"
95% de confiabilidad(limitesl
f para Coliformes Totales. '

.
,NMP en 100 ml Bajo Alto
/' 0-0-0 <3 0 0
~n~a lampars d~LUzu'tr~'T 111 0 -0 -1 <3 0.5 9
'/1 0-1-0 3 0.5 13
II 0-2-0 3 0.5 13
~3~
I

.. , I
PI 1-0-0 4 0.5 20 I
Iz.D - \uperfiCie de la capa /I' 1-0-1
1-1-0
7
7
1
1
21
23
I

1-1-1 11 - 3 36
\ 1-2-0 11 3 36
x _q q q.., Lf CO ~ .) ,
l.,.,\­ ~.
2-0-0 9' 1
. 36
~- \ 2-0-1 14 3 37
,,
qq ~I b?-.I<:.~,Ir(> ~ n
\, \ de color rojo.
. 2-1-0 15 ·3 44
2-1-1 20 7 89
2-2-0 21 4 47
'. anismos coliformes ! 2-2-1 28 10 150
I
\ 2-3-0 28 10 150
3-0-0 23 4 120
.. 3-0-1 39 7 130
3-0-2 64 15 380
3-1-0 43 7 210
3-1-1 75 14 230
3-1-2 120 30 380
3-2-0 93 15 380
3-2-1 150 30 440
3-2-2 210 35 470
" 3-3-0 240 36 1300
de, fluorescencia
3-3-1 460 71 2400
3-3;.2 1100 150 4800
. \
3-3-3 >2400 150 ,4800

iluci6n.

,I----f
61
Manual de M/croblolog/a Olga Ines I'tfontoya Campuzano
. Manual de MicrobioiogJa

Cajas de petri
pRACTICA 8

ESTUDIO DE LAS CARACTERisTICAS BIOQlIiMICAS


REACTIVOS'
DE LOS MICROORGANISMOS

., Barrit: a naftol 5%-hidr6xido de potasio 40%

INTRODUCCI6N
·r
• I -r

:Lc)':> L
EI estudio. de las caracteristicas bioquimicas de los microorganismos • 23 J0 " ""'X",
( l /'
constituye un aspecto importante para la clasificacion microbiana. ~
:2 S'C
----
fundamento radica en la dotaci6n enzimatica bacteriana, visualizadaa traves
-------_.-----_ ......

de la accian de las mismas, sobre determinados sustratos con agentes


----..,
Fel
LO)

I
- '"
revel adores. cor

Para observar las reacciones bioquimicas se utilizan diferentes agentes


pro
j
(
reveladores que permiten visualizarlas. A los medios de cultivo seildicionan . La
indicadores de pH, sales de
______ hierro,
______. aminoacidos
____ .____... azufrados, entre otros.
___ _____J__ _ de
~
"
~
-
_
.
-
.
_
~
~
~
va
.OBJETIVOS
'Qf) lX -.. ~ - '3 .
Identificar diversos generos bacterianos de la familia Enterobacteriaceae,
1~IO-6- ~/OO'OO'
obserVando reacciones bioqufmicas en diferentes medios de cultivo.
Detectar la presencia de algunas enzimas bacterianas a traves de la V\. ~ -4 J> ':. ~ ---1 J>:o-
reacciones bioquimicas.
J> \f lJ

-f)09 .2 10 -1. 0~c


MATERIALES \ ---fa b) ey A-U. ' \.
~ uf'l <l j f\ I Cv<A-j,eJ
• Cultivos bacterianos puros
• Medios de Cultivo:
• Tubos: con caldo glucosado, lactosado, sacarosado.
t-'\. 'C,tA~ (..J A J fCJo{c-~
Tubos con agar: SIM, Citrato, Urea, Kligler (KIA) 0 Triple Azucar Hierro - - - - f -----­
(TSI), gelatina, Nitrato Movilidad. b/3'+~

• Cajas de petri con agar: almidan, sangre, caseina 0112'S""


LII S­
62
6Jll2-~-
... '".,:

Olga ines Montoya Campuzano


. Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano

I pRACTICA 8 . Cajas de petri , .

~ LAS CARACTERisTICAS BIOQUiMICAS REACTIVOS· "


~E lOS MICROORGANISMOS
• 8arrit:a naftoI5%-hidr6xido de potasio 40%
• ' Rojo de Metilo

, • Per6xido de Hidr6geno .
racteristicas ~io<!~lcroorganismos • Plasma de conejo

I'im~~
. J>c..' . . tfObiana. §!:!.
~.A
, .
) ; 3 'zada a traves Fermentaci6n'de Carbohidratos

~ r-~
con agentes Los diferentes Grupos de· microorganismos aer6bicos y anaerobios varian

considerablemente en su capac/dad para·' desdoblar los carbohidratos,

producien,do acidos y gas, solo acido pero no gas, 0 ni acido ni gas.

La observaci6nde la respuesta bioquimica, se logre' gracias a la formaci6nl

de burbujas, 'dentro'del agar 0 a los cambios de coloraci6n producidos a la

variaci6n del pH, debido a un indicador presente en el medio de cultivo.

~ada_grl!e?_~~ mi~~~~~Q~.l'1i~,rnos posee alta_~~p.~ci~~!da~H~9L~I.~.l:Jcstrato ~~


<!~~~_~l?la.' Un grupo de microorganismos puede ferm~[1t.ar~rL~~~car
. Y_!l<?_~D_
"'--'---~-' '-~ .

la , isP~~~Q .. g~_ el, que difiere s610 en la agrupaci6n de los atomos deH y de los
grupos OH alrededor de los atomos de C:

Las bacterias presentan cinco ~pos principales de fermentaci6n, las cuales


dependeo de los productos formados, asi fermentaci6n: ~tan6lica, del acido
!actico, del acido propionico, delgrupo coliformes
........."...,....," -.,- . . . .
---"'-'7-;::--~-----;--'~~-----'-~' ----~..:..--.----~-.-~
y alcohol butilico.
... ...-.....-.-- ..
,~--------, ~ "'.~ -------.,--~.-

Para observar la fermentacion del grupo coliformes se utilizael medio de


~"~-~- -.-~'~ .. .. -.-~,---~-"---""'~ -_._-­
cultivo Voges Proskauer.
\

\,
63
r 11"'10'>
Manual de M/croblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologfa

Rojo de metilo I Voges Proskauer.(VP/RM) PROCEDIMIENTO


: f

Estas dos pruebas se rea~~f3!lj~ntas en el mismo me~io~d~__c~lti~~~gue


• Inocular el microorganismo en 10 ml. de calc
<?onti~Q~_~I?_~P.t~~~L9hJ~s~ en una concentracion no mayor a O.S%p/v,
• Incubar a 37C 12448 horas.
porque una cantidad'mayor puede interferir en la observacion de la reaccion.
En arnbas pruebas, los microorganismos fermentan la glucosa, pero varia
~~--~---- . _._d. __ .. ~~ _~-'--'----- -~- -- ,-...--------­ ---r:­
una de otra, en la forma en que 10 hacen; basado en la presencia de las ~c)~L

enzimas relacionadas en el metabolismo del acido piruvico. • Adi 2 3)0


• Me 2. S'c.

: ~b~1
La prueba de Rojo de Metilo, utiliza como indicador de pH el rojo de metilo,
----.--~-.-- . ---.-.-,------ ...~--- ------- -. -. ----~ .. ~-.....,.. -- ~......~----,---
~L9ual
- tiene la propiedad de det~rminar .. - - - la concentracion de tlidrogeniones - ~---.-----.

que seforman c:.tJ~Q9~_~rLor~!l_nismo ferme~ta la g~uco~.-9~?1 hacerlo • Adi


. . , .
se sintetizan una gran cantidad de acidos mixtos, como acido·
-~-'-.-.----~,"--- --_...lactico,
_-----. • Ob·
succinico
_.... y formico.
.....--- - ---,.
---~

Agarh
Los organismos que producen estos acidos en concentraciones altas de Estos
---------------.--- -. --­ ~--.,-----.------~---~~.""--
" , ----
hidrogeniones de manera estable cuando son incubados bajo condiciones del rni

optimas d~ cultivo a 37°C/S dras y alhacer!~J~ajan ,~~H h~sta}4AJ son RojQ concen

~Metilo Positiv~. ~os organis~~~ Rolo~~~~etiJ~~_~~~_ativ~_ tambieQ observca

~~4

eroducen estos acidos, pero tinalmente s~ obtiene una concentracion menor presen

de hidrogeniones, debido a que ellos continuan ......degradando -los acidos . medios

_.. --....-.--~-, , ~-.---.-----.-----.--

Rroduciendo carbonatos y---'--~-"-~-"----~.------'--""'".~-


anhidrido carbonico; las ~""~>
protelnas las'-~.degradan carbohi

~-,-----.------ .. - - - ' -----~-~" "'~~ .', ."--,-" - - _....- ' : ' " :

formando compuestos de amenia y simultaneamente sintetizan acetofna y


,;'--"-~-'---~' - - - <"- --.-,-~---.,~.-"'--"~.-~, .-' .-"~-"-.-~.¥- '~-'. ~ . -+ -. -'" -_._._----------._._------'-- - - ' ­
2.3 butanodiol. Todos estos productos de la fermentacion, contribuyen a que
--.--.--,~,- --...--"

el pH suba casi hasta la neutralidad; por 10 tanto cesa la produccion de


. --------- I,
, sulffdri

-.- ---- "--"y aumenta la concentracion· C02. Esta prueba se detecta a las
hidrogeniones -----,-,-------~~.-,-.---~'"-.--------- .­ ")

48 horas de incubacion, utilizando el reactivo de Barrit. Los microorganismos' coloraci·


-
que sintetizan acetoina son Voges Proskauer Positivo.
..------------
\; ... -------.--~------

------ ------------­
­
t
Interprej' bI3:r~
KlK: N . 0112~
a
1-// S­
6)'1 I z,~-
64 I
.. I
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologia Olga Ines Montoya Campuzano

,Proskauer.(VP/RM) 1, . ,
PROCEDIMIENTO
l~ali~~ilJ~r:!!~~e!l__~~~'!1~_~~dio de_~~ltivCLque

.. Inocular el microorganismo en 10 ml. de, caldo Voges Proskauer.


p9s~ en una concentraci6n no mayor a 0.5%p/v,

. ---­ • Incubar a 37C 124-48 horas.


(or puede interferir en la observaci6n de la reaccion.
!microorganismos fermentan la gluCosa, pero varia • Leer a las 48 horas I~ prueba de la acetoina (Voges Proskauer).

-hac~~; basado en
en que 10.. _----.
:. --_._--
)
la-pr~se~~i;d~--'as • Tomar 5 ml. de cultivo microbiano.

lei metabolismo del acido piruvico., . • Adicionar a un tubo de ensayo esteril.


, • Mezclar 0.3 ml. del reactivo de Barril. .
) . .

f~=yJlli?2=-~~-\~~~:' ~~~:~!~


Observar a los 2 minutos la aparici6n de un color rojo.
Incubar nuevamente el medio de cultivo a 37 C 1120 horas.

~ cosa, po!gue~'-.b§lcerlo • Adicionar 3 gotas de reactivo rojo de metilo.


rf.. 'Q!f6\n como acido.:..Jac.,!!co! • Observar la 'presenda :de eolorde tone naranja a rojo:,
C\q1 ,

de Kliger (KIA). triple azucar hierro (TSI) ~-.

.~, / / /

Agar hierrro
Estos
--.. medios.-------_.----_.
de cultivo son. -diferenciales.
------- permiten comprobar la capacidad

._----=--­
gel, microorganismo .Rara desdoblar un carbohidratoespecffico en la

_ _- ' - - -_ _ _- - - --~'" ..... - ..-'" "'~_e" _~ __ . _ " - ----... '

concentracion indicada,I~lucosa '0.1% p/v, s~~rosa;1% p/v 0"actosa1% ~


observandose finalmente cambio
..
de color de rojo a amarillo,
-
debido
)
a. la
~-,-.----,-----~,--------'"----~--- *~".-.-'-----~.----".-~---~----, ~

presencia del indicador de pH [ojo


-- de-f~I]..QLy3~resencia 0 no de gas. Estos --~----~~.,,---.--

. medios se diferencian
.
entre sf porque en el TSI estan Rresente los tres , ~~--~--.------'-.- ---.~'---

9:§(bohidratosy el KIA so 1.0 ,contieneglucosa y lactosa.


, --- ----,-.--------
..:... --,~ .-~.--,---- -'~-'----

.
'

'..
l
Igualmente/con esta prueba es posible determinar produccion de acidO
_sulfidri~ cuando el microorganismo desdobla el tiosulfato de sodio para

, reaccionar con las sales de citrato ferrico de amonio produciendo una

coloraci6n negra. .. ­
r
t
Interpretacion de resultados.
KlK: No hay desdoblamiento de ningun carbohidrato, no hay producci6n de
acido sulffdrico.

65
. Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla

KiA:" Desdoblamiento de glucosa pero no de lactosa, no hay producci6n de Utiliz,aci6n del Citrato de Sodio
Gas.
KIA+: Desdoblamie~to de glucosa pero no de ladosa y producci6n de gas.
AlA: Desdoblamiento de glucosa y lactosa.
H2S: Producci6n de acido sulffdrico.
\ .
Nota: Todas las Enterobacterias desdoblan la Glucosa, s610 ias del grupo
{ Coliforme desdoblan glucosa y lactosa

Lisina Oescarboxilasa (LlA)

Esta enzima es del tipo adaptativa 0 inducida porque ~ita de la'

qQ8,.2-'X
.
presencia del sustrato Iisina para poder sintetizarse, pero el medio debe estar

-_._ _
~"--~- .. - - - - - , . .

acido ..para que


......•. _.-
trasforrnandolo
la enzima
....._-._-

en cadaverina
......
(amina)
------
--.--~'---,- ---~--~-----------~--
.....
-'7-";"'-''''--''-

......- .... -pueda


_.... actuar·_.

,
~.- ------~-.---
-~.-.

sobre ....
- ~ -<--w"_ __

el grupo carboxilo,
+ C02. Estos productosalcali~!zan
-,-_.­ el
---~ ..... --~,-

.
t-'

__ __
.
._---­
,--~.-.-

m~dio:

La cadaverina es estable en condiciones anaerobias y se produce en


presencia de una coenzima el fosfato de piridoxal. Este proceso es
{
irreversible, pero no oxidativo.

Para esta prueba, se utiliza tubos con medio de cultivo Lisina - Hierro con
\ .

purpura de bromocresol como indicador de pH,.en forma de bisel. Cuando la


~ - ~ f"

enzima actua sobre el sustrato se observa un color violeta en el medio de


cultivo.

Los tubos positivos deben dar KlK + H2S: descarboxil6 la lisina y produjo
- .
acido sulfidrico, 0 KlK.
..

66

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblolog/a ' Olga Ines Montoya Campuzano

61ucosa pero no de lactosa, no hay producci6n de ,Utiliz,aci6n del Citrato de Sodio


I . .
II ..... , Algunos microorganismos ,h,eterotroficos, pueden crecer y multiplicarse en un
,glucosa pero no de lactosa y producci6n de gas. medio inorganico, que contiene Citrato. de ,Sodio como (mica fuente de
: .
;;Jlucosa y lactosa. Carbono y mediante la enzima Citritasa, pueden 'desdoblar la fuente y as!
,
ls'ulffdrico. -'"-~~ ingresar al Cicio de Kreb's. ,

\18S del grupo EI Citrato de Simon's es un medio de color verde, cuyo il1dicador de pH es el i}
I
,azul de bromotimol que permite evaluar, cuando la bacteria utiliza el citrato,
qq1 'Y:.. 'qCf6,Z'i
tornandose el medio de color azul intenso. .

q~be estar
La prueba es positiva c!,Jando se observa en el tubo de ensayo el fondo verdei
'l\ '--'_ 0
y enel bisel azulPrusia, solamente cuando el microorganismo crece;- J
aq1-1 ~/)- Y-JJlrP~~~. ~~,
0

\ calinizan
..._-_.,-­el
J'!:QcJucci6nde Indol- Acido Sulfurico y Movilidad . '>'U,\
EI Agar §IM, proporciona fuentes necesaria para determinarla caeacid.?ld,de_ •
oduce en un microo~g~ismo~ear~A.p!9du9lr: !~~~,~)~~cido Sulfhfdrico. Adicionalmente,
permite ~~l!:Jar si la baCteria es m6vil 0 ~.

Producci6n de Indol: Los microorganismos producen ,Indol a partir de la l


oxidaci6n del tript6fano por la acci6n de la enzima triptofanasa; 10 cual puede \
ser detectado agregando 0.5 ml, del reactivo de Kovac's al medio donde
crecen las bacterias. La funci6n del reactivo es reaccionar con el Indol y
producir un anillo rojo en la sLiperficie del agar.

Producci6n de acido sulfidrico (sulfuro de hidr6geno): alg!:JI'J()§


microolg_anisr:!lc>'s.. p>~~q~rL._de~2Q.~~i_L'?~__'§!D.LQg~9!dos azufrados como
~!~te!na~ cistina y metionina, Up~r§r:ldo> ~ulfuro _Q~ b!~r6g~no que es el
producto mas reducido del azufre.

67
'Manual de MlcrobioiogJa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobioiogJa

Para observar la,


producci6n del gas H2 S al .. medio debe contener., sales, de Licuefacci6n de la Gelatina
" -------~----.. ....:-.

, metales;:Resadq~ como Hi~rro, Nrquel, .Cobalto, Bismuto o"Plomo,gue al La gelatina es una proteina obtenidapor la hidrc

reaccionar con este forman un precipitado negro. en los tendones y cartilagos. Cuando ·se dii
~--~~-. ·t---:.._-,·_··· ­ utilizada por aquellos microorganismos"que pOi
, J-/lS'

Movilidad: se observa por la aparici6n de un velo blanco difuso alrededor de gelatinasa dando lugar a su licuefaccion.
.. -, - - .--~- -' ---''''i'-~''----- -'-~'~-~------'--- '--' ,.~
~~~-
la linea de inoculaci6n. Cuando la bacteria es productora de--------..!.----~-~-.--
--.-~"--,------"

la lectura ~~J~_rTl~~!li~ad,
H2 S se dificulta
por 10' tanto, se recomienda sembrar en un agar
\! ..... ~~S A
--'-'-_. ' , -"1

blando..
_ "\i, I l4 b 0- 5
I '1 1'\ ,(f!"
\' ~O, :;-r.;;;>' ,euJ.
Reducci6n de los Nitratos Cp C\ --if
\ 4~:- -~i ,. --:.'1­
; I _

',La reducci6n de nitratos incluye a todos los procesos en los que el NitratO..§!3 ..
'-----.------ "

( ~~9~~~...§_!!ltlito,-Y.. en algunos casos puede lIegar hasta Nitr6g~ molecular.


La
anaer6bica.
de las bacterias aerobias facultativas reducen nitratos en fo'rma
\· ·. ~7>~
~
Para est a prueba· se recomienda un· medio .semis6lido como el nitrato ~ I
./
que contenga ~ntre O.~ y 0.4% de agar-agar, el cual,favorece lareproducci¢m
d~_.~icroorganismo, permite
.- -- --.-~<--~
la movilidad'
__.. . '''' __"..____.___
.. bacterian~~-d~~~d~
._. _, .__._____..___._.
~"".-.--,--~~.-.~,...I.~--.-~ . _.__.__ .. ___ _ rapidamente I~ "~" ._~ " r __ ~ .,..._~--,-" __ ,,-w_ _ _ _ _ _ _ _

nutrientes y
-,------ productos de ...desecho,
- .. ,--".:: -aumentando
.... ........
las ---.-
------..,~-.-----"~
actividadas
......
reductoras --'-'- " ~--~---.- , ~-,--.......:.---. -~,--.-~

de un organismo. La pruebaes positiva ...


cuando al adicionar el reactivo de....
-'--.--~~--~~---.~*- --~-.-.--'-----.-----.---~ ~-

,
·Griess se forma un anillo rojo en la superficie del.medio. ­
~ _ ,_ ,~. _____ ~" ........ '_~_""'"' __ ~ ... _ , . ., . _ ...' - . , _ _ _ _ _ ,
., _ _ _ _ _, v • ".L___ ."_._ _'___ ~_A____

Descomposici6n de la Urea ~~ .
La, .Urea es una carba~ida del acido carb6nico que es hidrolizada por la
~nzimaureasa. EI medio'de cultivo ,urea contiene como indicador de pH el
I Rojo de Met~lo, au cambio de color de rosa palido a fucsia permite observar si
I
l '
la reacci6n es positiva.
.

68

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano

::i6n del gas H2S eLmedio'debe contener, sales de


I '---'--' __
Licuefacci6n de la Gelatina
Hif?rro, Nfquel, ..Cobalto,· BismutooPlomo, gue al La gelatina es una protelna obtenidapor la hidr6lisis del Colageno presente '
~n un precipitado negro.
t " ... .~. .~
en los tendones ycartflagos. Cuando se disuelve en agua puede ser
utilizada por aquellos microorganismos 'que pose en la \~rlzTrru;-extrac~'Ulali
gelatinasa dando lugar a su Iicuefacci6n.

Para una mejor observaci6n, se emplean medios de cultivo que no sean ricos
~.. ---.~

en Carbohidratos'fermentables,' porg~e est9s__ inhiben la acci6n " de . ~


gelatinas.§. EI cloruro de: mercurio 5..lJ.Qlimado (HgCI2); se adiciona sobre la
~ ~------- ------- - ---,­
superficie del agar_y la formaci6n de.J!!lhalo blan~<;Lalrededor del ~ecim!~to
- . .........::::_-._--
los que el Nitrato
~--
se ... ~lan~ca que la pruebaes RQ~;

n nitratos Em forma Para evitar utilizar el reactivo anterior,


'~'-~--- -
dada su toxicidad, la prueba
..
se
..---.
realiza
--- ---'~--- -----~~-- ..

qJr~9t~me_I]!~.;_eJl. tubo_g~_Ems.ClYQ.._~L.9..uaL~_IIlj.~JJf3_12%_~g~~~~~_X, ~
Iicuefacci6n aparece desp-uesde24
------.. .-.---- horas de. . . ----.".
-~~-.------------.---,....<-------
incubaci6n,
.-.----­ sin quelareacci6n
--..-~-----,.-~~-

. "~ 0 el agar nitrato revierte aun, cuando el,medio perma"nezca refrigerado a 4°C, durante por 10
',\e, la reproduccipn menos 3 horas..
, ------'-­
rapidamente los
..
-~-- -~------- ~

'ades reductoras Hidr6lisis de la Casefna?'1


\;-;-;~ L~ caseina, esunafosfoprotein~,constituyente prinCipal de la leche. Algunos
( -~

microorganismosson, capaces de hidrolizarla .mediantela casefnasa (enzi~a

extracelular), convirtiendola me~iante el proceso de peptonizaei6n en un


.
compuesto soluble. Utilizando ,el Agar Leche y la adici6n del acido acetico a/ .
3%,se visualiza la formaci6n de un halo alrededor de la colonia, si, /a
reacci6n es positiva.

Hidr6lisis del Almid6n '\ Gy;).,te'1 0 \\'")

EI, almid6n, ' es , un .' polisacarido de origen vegetal __gue__~g~nos


--.-.---.-.-'----:--'-.-- .... -'-- -
--------~.-~~-------'------- ~~-- .. _--­
microorganismos hidrolizan pOf" medio de. una enzima extracelular IIamada
... -~----"" . '" ..
"---~--,-.- ~-~--.:.--...------~ -.-.- .
----~ ---.---....~ ~~.""""-~--~-- -~-.#""'------------- .. -
Amilasa (diatasa), . La amilasa desdobla el almid6n hasta formar M~ttQ~_a
_. . -"~. ~ -~----.-.. --- ~---.... -~...... ,-"----~----------.. ~--
' .

69

Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/crablologia

soluble, la cual puede penetrar al interior de la celula,' donde es utilizada agregar una gota de plasma sobre uri inocula pI
---- ------.-.'

.con:l2}uente de carbono para el proceso respiratorio. EI revelador empleado Corazon. "\


-----' --·~---~-'-"""'_W"~-".!-----r"_-·""'·'~~ -.-~ . - .. - .- ....".--~--~.~.'--.. ---------­
en esta, prueba es_~L ~~do, ya qUEU~I' reaccionar co,! el ~Imig~f!roduce, un
\ '-"" ~,.- .• -~-.--.-..-----"--~ 4

~r oscurQ. Si alrededor de la colonia se forma un halo, no coloreado ~ Prueba de la Cat~asa: I 2­


-----=----.--~--,-,----.,--,---.-------

considera la prueba positiva.


---.----'---~----------

,Hem6lisis de La Sangre
,Se utiliza el. Agar ,Sangre para observar como algunos microorganismos
-'-'~--'--~-"--'.-- -----~-.-.~- >~-..

patogenos producen ,,..-


hemolisinas
.. extracelulares,
..
que tienenla propiedad de ~~.' -~',.",.- -'~ ~-,~,----~..--"-.~.~- ..-~-~.~~.------

,destruir ,Ia
-'.
hemoglobina y producir el dari0ge los· globulos, rojos. -._---­ ~~-
La
formacion de un halo transparente alrededor de la colonia, indica la hemolisis
- - - - - - - - _•• _ _ _ _ .~_ .._ A_''''_ _ ._--_.~.~_._, ___ ~_~--"'-------·-
_ _'.. - - ­
i •
!
a de la cadena a de la hemoglobina; y la ~~arici9n...9~~UJ!l.halo tr.?ns~
-"--"'-'~--'"--.-~,.-.. - " ,-,-,.--.~---------- --~, --....--­
verdoso, hemolisis pde lacadena P de la hemoglobina. Dada esta cualidad,
'-~." "'~ "'- ' •. ' , ~-,-- ..... -.... ~-~ -,,.~- ".~---.,#'~ ­

los microorganismos pueden clasificarse como a 0 P hemoliticos. ~

denominan 0 hemolfticos aquellos que no producen hemolisis.


----------,-----------.~--- .. -.--~.. ---- \\
Prueba de la Coagulas~ I'
\ Existen microorganismos patogenos, como el Staphylococcus aureus que
sintetizan la enz.im~ coagulasa, induciendo la coagulacion del plasmc.t~· par.a

!esta prueba, se emplea plasma des'fibrinado de conejo 0 de humanos, a los


cuales se Ie ha adicionadolcTfratoCiesoc:!@1 como anticoagulante. " :'
,,
i : '

EI microorganismo a evaluar debe cultivarse primero en Caldo Cerebro


-.--.. --...
-~------~-------.----~- -.----~.- ----~----."---~--.-,,.--.---" ---~--.--
\',
Corazon y despues, debe inocularse en el plasma a 37°C en bario Maria. La
------------,----.----.-,---.~ _ _ ~ e~ _ _ _ _ _ _ . . ---~---.-,,-.---~-- . . - - - .______ • _ _ . _ •• _ • - •• ~.- _ _ _ _ • _ _ _ _ _ _ _ _ ~_

lectura se hace durante un tiempo que no exceda las 8 horas. La formacion


de coagulo, indica prueba positiva.
....----.,--------:
,--~- .. -­ -~~---.-~--.~.~

La "prueba de la coagulasa puede hacerse en un tubo de ensayo que

jcon~enga 0.5ml de plasma, al cual se Ie adiciona 0.5 ml del' cultivo en Caldo


Cerebro Corazon (BHI). Si la prueba se realiza enportaobjetos, se debe

70

Olga Inas Montoya Campuzano , Manual de Microbiologia Olga In as Montoya Campuzano

retrar al interior de la celula, donde es l:I.!!!i!adC! agregar una gota de plasma sobre uri inoculo proveniente de Caldo Cerebro~
ira ~I_proceso respirato~.<?- EI revelador empleado Corazon. --,
-
~ ---- - --------------------.. -~~-
; ya que ?~acci~onar co~. el almid~Qroduce. un
...
lr de
"'--
la colonia se forma 'un haio ·no coloreado se
-____ . -.. . .- ­
-~
Prueba de la Catalasa: ) 2­
La Catalasa: esuna hemoproteina que 'al desdoblar el peroxido de hidrogeno ~
u oxidar los substratos secundarios retiene su estado oxidado. EI peroxido de

.croorganismos hidrogeno no es un producto final de la descomposici6n oxidativa de los

propiedad de carbohidratos, al no desdoblarse se acumula es t6xicoy provoca la muerte


-----­ bacleriana. Esta enzima esta presente en la mayoria de las bacterias
\ ~os. La
- l la hemolisis aer6bicas y anaerobias facultativas, que presenten ellslStema di~ito9"omoJ

F ta cualidad,
.\
Procedimiento ­
• Tomar una colonia con el asa esteri!.
ticos. Se
• Depositarla en el centro de un porta objetos limpio.

-."


Adicionar una gota de peroxido de hidrogeno al 30%.
Observar. producci6n de burbuja.

\us que Prueba De La Oxidasa


\., Para
" a los Esta enzima se produce la presen~ia~e u~!sistema-cito~_~rT10-o~~} EI
cual es importante en la respir~ci6n aer6bica porque activa la oxidacin del
citocromo-oxidasa reducido por el oxigeno molecular, el que a su vez actua
como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia
de electrones.
La

La presencia de esta enzima en los _microorganismos, los cfasifica en


\n aerobios y anaerobios facultativos al mismo tiempo porque son capaces de
1 - .
\
-)
desarrollarse.... -en
..- presencia de oxfgeno
,
y sintetizar la Catalasa. En cambiol
.
los
' '
. ' ,
microorganismos anaerobios obligados no se desarrollan en presencia de

\
71
Manual de Mlcrobiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologfa

\oxlgeno atmosferico, porque carecen del sistema citocromo y de la actividad


,,
loxidasa.·, . " .
./ ~
:' j

Esta prueba se realiza utilizando una varilla que contiene N,N ..---.,-
dimetil-1,4­ I '
- - - - ____________._6 __________ __ ~___ . __ .____ ~.-.---,-

)
fenildiaminocloruro 1-naftol actua aSI: ) ;
l :
I "
I .'
,-.;
Enzima :
oxidasa+oxlgeno atmosferico + citocromo +reactivo oxidasa; al
~ ' , ,

--
oxidar el reactivo produce un compuesto coloreado,el indofenol, el cual
~.~'-'-- .. ------------.-.-- .. ' ... - ..•. ---- ...---~-'-- CJ~V-~
actua a su vez como aceptor y dador de electrones.
...-...
, - _._._--_ -:.._--_._.--_. -
-------~".--'~-.:...-. .. . -- ---.-------'.-----~ ---­ Y,62S
~O,3't-~
PROCEDIMIENTO GENERAL DE LA SERlE BIOQUiMICA

Con un- soloinoculo se debe sernbrarcada uno de los 'medios de cultivoa


Figura 8.1.
evaluar.

En los tubos con caldo, se introduce el asa y se agita en su interior para

descargar el inoculo.

; .j
• Esterilizar la aguja de inoculaci6n y tocar el coraz6n de la colonia de la ::", .
muestra para analizar.(Figura 8.1 )
• Inocular en elfAgarRIAO-~~ introduciendo la aguja hastael fondo y
luego sactll1dola haciendo una estrla en zig zag en la superficie del Agar
inclinado.
• Inocular el~~trato_ Simon~ haciendo zig zag en el bise!.
• Inocular en elt~~_~~J por picadura hasta el fondo. ­
• Inocular el tubo con~ por picadura hasta la mitad. .
•.. I nocular el tubo con§gar ur~ por punci6n hasta el fondo:' Siembre en
zig zag en el bis~1 0 pico de flauta.
• Inoc~lar el tubo con~dov~es-p~~~k~edlavando el asa (Figura 8.2)
• En las cajas con jA98Lalmid6n-y-s~grel se hacen IIneas cortas en cada
uno de los cuadrantes(Figura 8.3)
• . En :el .h.ibo con ra9~~~in~cLl'ar la muestra para analizar con el
asa(Figura 8.4) . . ' . .
,;- .~
.. !
I

72
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano

que carecen del ~istema citocromo y de la actividad


I
ii
Iutilizando
'~~
C'_'_ _
una varilla que contiene N,N dimetil-1,4­
_ _ ' ' ' ' ' . ' '_ _ _ _' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' _ '_ _ '''___ ____.,,''"'''" , ___

~I aclua as!: '-t"


I.p ~ ~ cJ~, ~2., 0 oxidasa; ~I
fenol, el cua/
~0. t___ ~_

; rvJJ
I C) ,__. ~,\
1
--
.-1-- ~V de cultivo a Figura 8.1. Toma de muestra en la serie Bioquimica ,

l£',I---­
.3---'
\
, clnterior para

ryr.
I "
~~-;. rrAs.
V' , ~,
Ionia de la

~
e/,fondo y
\ del Agar

,
,

Figura 8.2. Serie bioquimica para Enteroi?acteriaceas

;.\ cada

on el

\
73

Cl
Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologla

Identificar el genero del microorga~,ismo de estudic


....7-~ . "

Tabla. Diferenciaci6n de Enterobacteriaceae I


~J"'--
KIA ILIA IC.S J_
I
1m A ccJl(
E. Coli 1­
Shlgellia
,
,
o',i?-c; \ :; )..1
v SalmonellA t
Cltrobacter
Enterobacter
II
~:
~~,?:,'i-5
l {I
I Klebsiella ' ....

1
~!

-­ .9--
"

CI, ""'
J Is. Serratia:_-: , '.
. ; ; t - , .. - n
Proteus ' I
fJ
'
(' ,

11 Pseudomonas
i ', ,.. ­ .>­
)c r ' " ,

II ,- , i "
~ (~ KIA Agar K\i '
Figura 8.3. PruQbas de (a) caseinasa (b) hem6lisis LlA Agar Lil,
C.S AgarCl.,

Mov Movilid{\

R.M Rojo der


, \, . V.P Voges FI

Gel Gelatina ,;...

A 'Acldez . :

A Acidezc"

K Alcalino \

V Variable 'i, \
'

, '

, Figura 8.4. Prueba de la gelatinasa

.' "
Actividades
Reportar en una tabla los resultados, obtenidos de su cepa con cada una de '
. .
,,' .'las, pruebas bioquimicas.
',' Buscar sus resultados en la tabla de caracteristicas bioquimicas.
Olga In~s Montoya Campuzano Manual de Microblologfa Olga In~ Montoya Campuzano

Identificar el genera del micraorga!Jismo de estudio.


'. .... ':.~.
..
~-
"

Tabla. Diferenciaci6n de Enterobacteriaceae par pruebas E,:Ii,oquimicas


KIA LlA e.s! SIM Urea Nitrato R.M V.P Gel.
I-12S' Indol Mav I
E. Coli 1J1A1A ·V+ - ,­ .­ + 7 V+ ~-",,/~
1/,-:;/11 1jf}J/h _.-
' z'?''%~'1 Idl!+~// -
Shigellia ' KIA',· -.. - - . V+ - ''h'/:'//l'
l,.1 t
\if!!'-+-

1
~:.:)' y.f!t /p/
,1.,,/ - -.
'y SalmonellA 1 "lZ
:,', KIA , ;1'/t'~ 'I ,~. 1 ., lll
Wht (::1'71:1> 1//!;~+1/// I'll·fl/i"
:' (I/; !/IJ/jIJ/11 J/~J4-¥t, Itf rr--~ II,,", - -
Citrobacter AlA -, + fjr
l/f/f,N/ //;J~·f/t· v11.."
+'j{fi/t!. V ' 1/: //+'
ii- / vf/L.f(/Zt
/. //I} I;' - -
Enterobacter ' ~AlA
11Jf t
f 'c+ : , - !111/A Il"/ ( y~.)+ f'
'j;;'­
'/-'/ '/11
/ ' ':','
/ ' I ~/~t" ~/~K~ij.,Y;;t ' 1/+/;;7
'~""?' '/""~ '1
I I /1'/
-
,.,'
+ V+
'/ Klebsiella ' I ~AlA- !tJft//;
0+ " - V-, - V ;'/'/~"
',//I'iJl, - + -
j .& Serratia~_~' , KIA " t+Ji¥t1/ " + -." . YfCi/)'ZI/ 'j1~/-:!t,p..t1t
V'·' l~!;?;t:/f:. V+", +:.:, t
Proteus KIA .' - + ~t/~I V+ V~(.i:.t~i \,:!,) (h -IJ,'l//)
I .1'+"1' /ftl4j ,+ +
Pseudomonas KlK - +
(,1 fI,

-
11;;;"1;(;1 't'l/~Jt/I~~/ V
/1 .'" ,
-)
/. .i-'~. , '/
. - - +

KIA Agar Kliglerhierro (fenrientaci6n de lactosa y glucosa)


LlA Agar Lisina hierro (descarboxilaci6n)
C.S Agar Citrato Simons
Mov Movilidad
R~M Rojo de metilo
V.P Voges Proskauer:
Gel Gelatina
A 'Acidez
A Acidez con gas
K Alcalino
V Variable

'DJ.M.-- !+v6\~) Co,A~~ .


/
~ de ' eA"t ~ 0 -f> (1-)

Vyc.lCI-.,. (-.).

N..Q,,,,,oq,,o.:.;.,. ~G-'O~~v.'O oI v
V.f/_~ l~) \ '
(75-.
~-"" • • • .'>',

...•.
Manual de Microblalogla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Micrablalogla

• Asas
PRACTICA9 '
• Varillas de vidrio de 2mm. de diametro.
GENETICA BACTERIANA

• Cajas de petri.

Aislamiento de un mutante. resistente a oxitetraciclina.


, - . P'ROCEDIMIENTO
--------
La
- mutaci6n, es un cambia irreversible en un gen
.
que puede'
( .
manifestare .en "
ccJlo r:. [
la sintesis de la proteina, alterando una caracteristica fisiol6gica: morfol6gica I~.')/~
a bioquimicaen,la celula. La frecuencia:de aparici6n de los mutantes en una
poblaci6n mlcrobiana esta muy relacionada a ciertos cam bios fisico-quimicos
. ..

ambientales, y no es tarea facil aislarlos y detectarlos, par 10 tanto para


detectar y aislar un microorganismo mutante' se requiere de metodos
especiales como el"Gradiente en' placa" .

Este metoda es utilizado para detectar facilmente cepas mutantes, par. 10


general cuando se presenta resistencia a antibi6ticos, estos cambios son
mutaciones espontaneas, detectadas faci/mente porque las celulas.
resistentes a dicho antibi6tico, solo creceran ell el media de cultivo especifico
en presencia de concentraciones de antibi6tico; mientr~s son inhibidas las
cepas sensibles como la poblaci6n norma,1. Para detectar. estas celulas
mutantes se utiliza el metoda "Gradienteen Placa".

OBJETIVOS
Practicar el metoda de Gradiente en Placa para detectar cepas mutantes
Diferenciar una cepa resistente y una sensible al antibi6tico oxitetraciclina.

MATERIALES

• Cepas de U Staphylococcus aureus"


• Agar Soja Tripticasa
• Oxitretraciclina

76

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblo/ogla Olga Ines Montoya Campuzano

, ,

PRACTICA9
• Asas
GENETICA BACTERIANA
• Varillas de vidrio de 2mm. de diametro.
• Cajas de petri.

:lnte resistente a oxitetraciclina.


. PROCEDIMIENTO

riO irreversible en un gen que puede manifestare ,en >


• Colocar la caja de petri esteril por un extremo sobre una varilla de vidrio
f alterando una caracte~istica fi~ioI6aiCa-mon:ll69ica • Verter agar Tripticasa Soja fundido a 50°C en la caja de petri de tal forma
que el medio de cultivo cubra la superficie del fondo.

AI; CU, lor,:', d ~~~ ~i:: • Oejar solidificar

I;:SY~. \~ara • ,Colocar la caja de petri en posici6n horizontal


odos • Madir 0:1 mL del antibi6tico oxitetraciclina a un tubo con agar Tripticasa
, JJ
.ct.. Soja fundido y temperado a 50°C
~ C) ___ ~\
- ~,
;::-:­
V r 10
• Mezclar bien el tubo
• Verter el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri.
-,. . c- --,;
" :' 1/ .--­
_----­
• Oejar solidificar
., Inocular 0.3 ml. del cultivo I< Staphylococcus aureus' sobre la superficie de

~~-
ex -..3-'~ agar Tripticasa Soja
~.CP'. • Esparcir la muestra bacteriana con una espatula de vidrio
• Incubar a 37 C por 24-48 horas
• Examinar el desarrollo de las colonias resistentes en las areas de mayor
concentraci6n del antibi6tico
• Tomar varias colonias
• Hacer una suspensi6n en caldo Tripticasa Soja
• Incubar 3 tubos con caldo Tripticasa Soja conteniendo 0.001 mg y 0.05 mg
de oxitetraciclina
• Incubar a 37 C par 24 horas
• Observar crecimiento por turbidez.

,
77
Manual de MlcrobiOiogla " .Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologfa .

AGARCQII
pRACTICA 10
OXITElRACIClItA
. ESTLI 010 DE HONG(

~~~~~~;~i~~~~~-
:'f··:·········":-:··:.."c:"~·:";::::;:;:::::::-;~·::·~:.:·";:=~=:~'::;=-':::=···i:\

i:1!\~~\m~*~2I~'f:~~¥~~it
~-l AGAR
. AGAR CON "
z.- NUtAENTE TRPTICASA DE SOJA

Figura 9. Agar tripticasa de soja con"oxitetraciclina ,

Actividad
. ".
Realizar un cuadra especificando las caracteristicas 'morfol6gicas de la
colonia de una cepa resistente can la cepa sensible.'

78
.Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia .• Olga Ines Montoya Campuzano

pRACTICA 10

. ESTUDIO DE HONGOS

INTRODUCCI6N

r ina

1icas de la
Los hongos no poseen clorofila, adquieren su energia de los compuestos
organicos que estan en el suelo y en el agua. EI alimento 10 pueden obtener
de los materiales muertos (saprofitos) 0 se nutren como parasitos de
. huespedes vivos. Por eso consideran heterotrofos.

Son descomponedores de la madera, las hojas y otros restos vegetales,


formando el humus que enriquece el suelo y sintetizando el dioxido de
carbono que vuelve a la atmosfera, para ser aprovechado por las plantas.

Los hongos, se utili zan industrial mente en la fermentacion para producir


acidos, alcoholes y otres compuestos; como tambien en la sintesis de
algunos antibioticos.

Ademas, los hongos deterioran productos textileros, cuerdas, aislamientos


electricos einfinidad de articulos' comerciales e industriales. Pueden ser
beneficos 0 patogenos.

OBJETIVOS

Identificar las estructuras reproductoras y vegetativas de algunos hongos..

Adquirir habilidad en el microcultivo de hongos.

Distinguir entre hong os y levaduras.

Observar al microscopio placas preparadas de hongos y levaduras.

79
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano . Manual de Microb/ologia '

MATERIALES
• Cajas de petri con Agar selectivo para hongos(OGY-SaboL!raud)

• Cubreobjetos y portaobjetos

• Papel filtro
culo r:
\ ,
• Puente de vidrio
I=,)Y~
• Estilete

• Glicerina a120% esteril

• Azul de Algodon ( Lactofenol )

• Lugol

• Cepas de Saccharomyces, Rhizopus, Penicillium y Aspergillus.

PROCEDIMIENTO c,
-
Preparaci6n de un Microcultlvo
• Colocar en una caja de petri un pedazo de papel de filtro, untado de
glicerin~.

• Colocar sobre el papel un puente de vidrio en forma de U.


• Colocar un portaobjetos y encima un pedazo de Agar Sabouraud de
. 1x1 cm. Luego colocar el cubreobjeto.
• Proceder atomar varias veces una muestra del hongo con estHete de otra
caja de petri 0 de un alimento.
• Inocular varias veces en el Agar.
• Envolver la caja con papel Kraft. /
• Incubar durante ocho dias a temperatura ambiente y a oscuras.
• Hacer observaciones· diarias. (Figura 10.1.)

80
Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano

Agar selectivo para hongos(OGY-Sabo~raud)


rtaobjetos
,

\
\

~-

t cub r ~ cJ -: :. ~'L
I;: ~/\!!1.

1. AImeIr .....

\
l ",,­
: \ "-~,""""
I
'. ".
'0 de I
,i
., --",",<""" \

{~~
. I;,

tf de
i

\ /'
.I .
'.'

\otra ."~, (
;!,: .

,I
f,
f;

5. CoIocw etln6allo
IIObre. eI truzo de JI
y
\ 19II'. I

. . -.
......-....
~L". ...-..........

,-~-, ", ~~
­

I \

Figura 10.1. Pasos para realizar el microcultivo de un hongo.


\
\'I
l 81
Manual de M/croblologla Olga Ines Montoya Campuzano ,Manual de M/croblologla

BASDoMIcETO
Figura 10.2. Estructuras de un Basidiomiceto

COllidloforo

. Figura 10.3. Estructuras de (a) Aspergillus, (b) Penicillium

82
Olga Inu Montoya Campuzano . Manual de Itt/croblologia Olga Inu Montoya Campuzano

lamelas

Figura 10.4. Estructuras de una Levadura.

Figura 10.5. Rhizopus, caracteristicas de la colonia


(a) macrosc6picas ,(b)microsc6picas

Actividades

Examinar los hongos presentes en las cajas de petri. Describir su color,

textura, forma, entre otras caracterlsticas visuaJes.

Preparar una placa: Tomar con un estilete esteril una' muestra de cultivo .

. , (b) Penicillium Observar al microscopio en 40X. Jdentificar el tipo de hifa y organos de

reproducci6n.

. Clasificar el hongo 'al observar sus estructuras reproductivas.

83

,Manual de M/crab/ologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia

pRACTICA 11 cultivo microbiol6gicos. En cosmetologia, se utilizan


jabones y talcos .
ESTUDIO DE ALGAS .
Para la clasificaci6n de las algas,' se tienen

INTRUDUCCI6N caracterrsti\~=~'~
'. Naturale2i 1­
'r O',~<;
Las algas son organismos Eucarioticos, unicelulares 0 coloniaJes, estos ultimos • producto~:i Li,b 0. '5
forman agregados celulares; las hay macrosc6picas y microsc6picas, presentan • Tipo, nurrl! ~Ol'b'i-S'
"

como las plantas pigmentos clorofflicos y carotenoides que actuan en procesos • Composici
I C\
fotosinteticos oxigenicos, utilizando el agua como donador de electrones. • Caracterii '.
• Ciclos de Ii .;1.->,- ~~
! /" - Ou',>'
Muchas ,algas son fototrofas obligadas y por ello incapaces de crecer en la
, - ­
. , ~ :--j/1, _____
oscuridad con fuentes organicas de carbono. Sin embargo, algunas algas' pueden OBJETIVOS :";. ­
crecer en la oscuridad, de manera quimiorganotrofa, catabolizan azucares \
Observar las, i
sencillos y acidosgrasos. l

Clasificar cadi i, >


,Habitan todo tipo de agua, (salina, dulce, caliente 0 frla); se les encuentra en las
, rocas, piedras, plantas 0 animales. MATERIALEil '; ,

\- I

La presencia de determinadas especies de algas en un cuerpo de agua, puede • Frascos cor; !


t \ )4. Ie' . ' " :
• portaobjetoi :" "-- ...:J\.:) " - .---:::::

o/Olj~V~fu
indicar el grado de contaminaci6n 0 de limpieza en la cual se encuentra. ,Algunas
de elias pueden producir olores 0 sabores indeseables; otras pueden actuar como • Gaieros y pl.,'
barreras para el intercambio gaseoso del medio ambiente, 0 ejercer una acci6n • Claves parar, , , (\
~:) , ,
"

pe~udicial en la obstrucci6n en el tratamiento de agua potable (cloroflceas). • Microscopio' \J:


• Gasa ~ ....------...

~ Ab '0 ~ ,

Las algas, son utiles en la fertilidad del suelo, como alimentos por su alto valor • Panuelos de' ~I ';, r0~
nutritivo (Chlorela). En el ambito industrial, las 'Diatomeas, se utilizan como li ~. 1{'{\')
filtradoras, aislantes y abrasivas; las algas rojas del genero Gellidium se usan en t·" 4 ~.,.., -1,/5 --;
! rf>'3 ,/\J C/<'"
la elaboraci6n del Agar Agar, pOlisacarido util en la preparaci6n de medios de III
I'
\, •• ""_ •

84

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogia Olga Ines Montoya Campuzano

II .

I pRACTICA 11
cultivo microbiol6gicos. En cosmetologfa, se utilizan como base, la elaboraci6n de
!ESTUDIO DE ALGAS jabones y talcos .
.
Para la clasificaci6n de las algas, se tienenen cuenta las siguientes
caracterfsticas:
,
• Naturaleza y composici6n qufmica de los pigmentos.
eIO,niaJ~~, estos ultimos • Productos alimenticios de reserva.
\CrOscoPlcas, presentan • Tipo, numero, implantaci6n, morfologfa del fJagelo.
\e actuan en procesos • Composici6n quimica de la pared celular.
e electrones. • Caracterfsticas morfol6gicas de la calula

ls de crecer en la
·l9unas algas "ueden
• Ciclos de vida y reproducci6n.

OBJETIVOS
.' ~\tabolizan azucares
~,
Observar las algas microsc6picas en una muestra de agua estancada.
Clasificar cada una de los g{meros de acuerdo con las claves taxon6micas.

,\s encuentra en las


MATERIALES

de agua, puede • Frascos con muestras de agua estancada


,~'.

· entra. ,Algunas • Portaobjetos y cubreobjetos


\ .
\en actuar co~o • Goteros y pipetas
'rr una acclon
fceas).
• Claves para la identificaci6n de' algas
• Microscopio

• Gasa
. su alto valor
• Pariuelos desechables
. Jizan como
, se usan en

85
Manual de M/crolJlologfa ,.' Olga In~ Montoya Campuzano , Manual de Microblologfa

Actividades
PROCEDIMIENTO EsqlJematizar 10 observado
• Tomar un portaobjetos desengrasado Clasificar las algas de acuerdo con las claves tax~r
• Aqicionar con una pipeta 0 con un gotero la muestra de agua para analizar: . ,.,-I'"
I

• Colocar suavemente un cubreobjetos encima, sin producir burbujas 1­


• Observar al microscopio con objetivo de 40X. ' C>',il-~
A CcJlor:
L-i ,60. '5
~O(~'i-$·
I::S/0

(\
-
"' ~---

- {­
Dc.. _"_'_ _C-~'I
r
_ _-'_'.. .,. .___. '-1/ ___
.,..i / ~

~C
-
A

,.
Figura 11. Algas

86
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/crobiologia Olga Inu Montoya Campuzano

Actividades
I . Esquematizar 10 observado
sengrasado
Clasificar las algas de acuerdo con las claves taxonomicas.
) con un gotero la muestra de agua para analizar
ubreobjetos encima, sin producir burbujas
!
pn objetivo de 40X. .,

87

.-
_Manual de MlcrobIoiogia, _ Olga Ines Montoya Campuzano Mlllllual de Mlcroblologla

PRAc·nCA 12 Sporozoa: Incluye protozoos que f~rman esperas 1


PROTOZOOS medios de locomoci6n en el estado, adulte. Todcl
vertebrados entre ellos tenemos los Plasmodium
Los protozoos son eucariotes unicelulares de tamano microsc6pico. Su habitat es paludismo; el Toxoplasma gondii que t(aosmiteJaJI
muy variado, se encuentran en- agua salada, agua dulce, en restos de materia
organica en descomposici6n,etc.. Un ejemplo es la ameba comun .
~. A color: [
\ -- - ci,t?-~
I
\' L-\,bO- '5
I:: -S/\;' -f9,_~v I ,

De acuerdo con los mecanismos de locomoci6n, los protozoos se dividen en cinco I, ~o,?:>'i-5 - ,G;J

~- .3---- ~ ~-.- -0
clases: Sarcodina, Ciliata, Mastigophora, Sporozoa y Suctona. _
CI,
I,' ~-. i ..

--('-"-.:-:~;}~/~
Sarcodina: Forma ameboides, las cuaJes se mueven emitiendo protuberancias a
modo de apendices tentacuJares, J/amados pseud6podos. Dentro de este grupo
se encuentra el genero " Amoeba " que siempre esta desnudo en su fase
\
vegetativa, siendo un microorganismo qe vida libre, encontrandose en habitats
acuaticos de tipo marino, dulce. Tambien esta la Entamoeba hystolitica, parasito
animal que causa la disenteria amibiana y el genero de 10 foraminiferos, ami bias
r
,
I i >­
~ ~
que secretan una concha durante el crecimiento vegetativo y su habitat es
exclusivamente marino.

Ciliata: Se mueven por el impulso que imprime a la celula la ondulaci6n de


ciertas formaciones filiformes 0 cilios. Son, p~r otra parte, exclusivos en el mundo ­
biol6gico por poseer dos tipo de nucleo: micronucleo y macronucleo. Dentro de
este grupo se encuentran los generos Paramecium y Balantidium, el primero de
vida libre y el segundo parasito de ani males de sangre caliente y el hombre.

Mastigophora: Comprende formas que poseen largos apendfces filamentosos 0

fJagelos. ,Dentro de aste grupo se encuentran algunos parasitos animales como la


Giardia lamblia, que-produce gastroenteritis; Trypanosoma gambienzie, causante
del mal de suano y Leishmania causante de la Leismaniasis.

,,-
'-;"~:

'~'\-
ss
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogia Olga In~ Montoya Campuzano

I
i
~___'_P_RAC_T_IC_A_1_2-----------­
__ Sporozoa: Incluye protozoos que forman esporas y que no poseen por 10 general

~olo ~ CJ ~~2 r "l'


medios de locomoci6n en el estado , adulto.
vertebrados
, '1
entre
'
. Todos son parasitos obligados de
ellos tenemos los Plasmodium transmisor de la malaria y el
'\.

: '- ()
,.:: ,>......r
!
<;.
'-
I'V'I
'i / ,
"J.
l U habitat es paludismo; el Toxoplasma gondii que transmite la toxoplasmosis en humanos.
) de materia
OBJETIVO
Observar, diferentes clases de protozoos y sus respectivas formas de locomoci6n.
1en en cinco
MATERIALES
Se utilizan los mismos materiales que en el laboratorio de algas.

-- berancias a
,', leste grupo
·'rn s~ fase
in habitats
ra' parasito
~S, amibias
Ihabitat es

.I1aci6n de
.'.: lim
~
el mundo' '~.';~
Dentro de
I ~i II' I~
jI\
I ..

.lrimero de 1

reo

~ntosos 0

\ como la
1
rusante
Figura 12. Protozoos

.~=~===~---~-~--...",~,-.~,,,,,,,,.~,,
J 89
MatIItlrlIJ;Ie M/croblologla ..'· ~ '•. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/crobiologia

pRACTICA 13
Actividades
CONTROL DE MICROORGJ
Esqoerriatizar los diferentes protozoos de la hluestra analizada. '..

Establecer las·diferencias entre las formas'quistiCas ytrofozoitosde los protozoos


A ccJlo r
parasitos..

I;: ')/~

"'

90
Olga Ines Montoya Campuzano Ml:IIJual. de MlcrobioiOllia .. Olga Ines Montoya Campuzano

pRACTICA 13

CONTROL DE MICROORGANISMOS

protozoos de la muestra analizada.·

Ire las formas 'quisticas y trofozoitos· de los protozoos

INTRODUCCI6N

Existen varias tecnicas para controlar poblaciones microbianas. La


conservaci6n de materiales, el mejoramiento de sustratos mediante cultivos
iniciadores y una buena safud publica se logra, gracias a la combinaci6n de
diferentes metocios fisicoqufmicos y biol6gicos.

OBJETIVO

Emplear .diferentes metodos para reducir, inhibir a eliminar pobfaciones


microbianas.

MATERIALES

>,
Cepas bacterianas: Familia Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Yersinia
sp, Klebsiella sp, Familia Bacillaceae: Bacillus subtilis, Bacillus cereus.
Familia Micrococaceae: Staphylococcus aureus, Micrococcus sp. y de la i
Familia Estreptococaceae: Streptococcus sp.

• Medias de cultivo: caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Sensitive.


• Reactivos: Antibi6ticos, Agua oxigenada, Prepodine, Hipoclorito de sadio,
Extran, Alcohol, Fenol, entre otres.

Equipos
• Mecheros

\
\ 91
Manual de Mlcroblo/ogia' :" ',' Olga Ines MontOya' Campuzano IIIanual de IIIlcrobioiog/a \

• Asas Presi6n Osm6tica


• Pipetas .' ",.
, ... ./)
.' .r:n n·r}
• 4 banos Maria temperadosa'50oC,\6_0?C,t70oC~800C. • Tomar 5 tub~s de ensayocon Caldo ~utritiv(
glucosa en coneentraciones de 5%, 10%, 1S
• Incubadoras
• Discos de papel de filtro esleriles y de antibi6ticos.
• Medidores de pH.
,•. Lamparas de luz Llltravioleta
• Term6metro

PROCEDIMIENTO

pH
• Tomar 5 tubos de ensayo con 6 m( de Caldo nutritivo cada uno.
.'Ajustar, e~pH pa:f~L~da tubo respectivamente en: 5);~~?~~9ffy
11.0 con'!!9,vo"~~~segun el caso. ' .. -~
• Inocular, cada uno de los tubos con 0.1 ml de la muestra del
. microorganismo de interes.
• Incubar a 37°C por 24-48 horas
• Observarcada 24 horas
• Evaluar el crecimiento (Figura 13.1)

AI
' I'
I,
I .j '!
" :! . .... - ,

kd,
.:
,
: .........J
~." '. 'I
j'/. ;t
11.i
:'. I
I,

3.' ,.. 1.' /,.1 .


Figura 13.1. Control de microorganismos por pH
U,

1t.i

92
Olga Ines Montoya' Campuzano "'..uBl de ""crobIoIoglll ., Olga Ines Montoya campuzano

Presi6n Osm6tica

• Tomar5 tub~.s de ensayocon Caldo ~utritivo, ajustarlos previamente con


glucosa en coneentraciones de 5%, 10%, 15%, 20% Yel control.
;esteriles y de antibi6ticos. • Incubar a 37°C durante 24-48 horas .
• ObserVar cada 24 horas
i
.
~Ieta • Evaluar el crecimiento (Figu'ra 13.2)

t
i
"I ,I

1% 5%
L 15% 21%
J

Figura 13.2. Control de microorganismos por presi6n osm6tica


(concentraciones de glucosa)

Temperatura y Tiempo ~e Exposici6n

• Tomar ocho tubos de ensayo con Caldo Nutritivo FOr


. . )?4??
• Inocular cuatro tubo~ con una suspensi6n concentrada de bacterias Gram '
Positivas y marcar cada uno de ellos con las siguientes temperaturas:

500C, 600C, 700C Y800C. Otros cuatro tubos con una solucian de bacterias

Gram Negativas y marcarlos de igual manera que los anteriores.

•. Tomar ocho cajas de petri con Agar Nutritivo. Marcar cada una de elias,
con las siguientes temperaturas 50oC,60°C, 700 C y 800C.
• Dividir ra base de cada caja en cinco cuadrantes. Marcar cada cuadrante
.\

93
Manual de Mlcroblologfa. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobioIogia

Antibiograma
con el tiempo de exposici6n asf: Control, 5 min., 10 min., 15 min., 20 min.,
inocular de cada uno de los tubos en las cajas con Agar, enel segmento • Tomar dos cajas de petl; con Agar Sensitive
marcado con, control. , ,I cada ~qa_coI1J~ cepa de interes.
, I

• Tomar por parejas, tubos con bacterias Gram·positivas y Gram negativas, • InocU
I' 1­
marcados para cada una de las temperaturas senaladas y "evarlas a! . • Coloc
Ii
CJ',il-~ A cui
Bano Marfa calibrado a la temperatura respectiva.
,> ,
,
• ,
difere YI6~S
. I -0, era, 3'1-$ .
• EI tiempo de exposici6n para cada pareja de tubos sera de 5', 10', 15' ,20'. • Incub
I;
Y se procede a inocular en el segmento marcado para cada paso. • Obse[ .
13.4)

i D(.J> .
Agente •
---------'-' y / ----­

1 :.i
I
I '.
Realj
J

;j i Ire ll-c
sensi~ ,!
i
:
A
I con ci
I .'
corres •

\\ ---J I:
t'

f.

I
,·ri' .
(" II,!'

Figura 13.3. Control de mlcroorganismos por temperatura•. J ~


; I'
i !
'I ;/
/ iI : I

I'
• I. i
Pruebas de sensibilidad '.

-1 i
Las pruebas se 'realizan emplean~~_·~ de sensibilida~,. unos
i
j
impregnados con antibi6ticos y otros conagentes qulmicos.

-..-.. .....
~ --,~-,-'~'-'.------.~--,.~-~- ---­ ~I
!

I,
I

/
94
Olga Ines Montoya campuzano Manual de Microblo/ogia . Montoya Campuzano
Olga.",Inils

Antibiograma
sici6n asi: Control, 5 min., 10 min., 15 min., 20 min.,
i

]fe 195 tubos en las cajas con Agar, en.el segmento·


• Tomar dos cajas de petri con Agar Sensitive 0 Agar Nutritivo y marcar
cada una con la cepa de interes. .

--------
;)s con bacterias Grampositivas y Gramnegativas, • Inocularla cepa con escobill6n de algod6n esteril.
~a de las temperaturas~ serialadas y lIevarlas al .'
, '\.. • Colocar, sobre la superficie del Agar inoculado, discos de sensibilidad, de
~...--laJeD"
'.

'va.
\.. ;', . ,.. . diferentes antibi6ticos, manera que haya' una distribuci6n uniforme.
~.;·-l ~ ~2- \ssera de 5',10',15',20', • Incubar a 37°C durante 2448 horas.
L-J
I
'Oara cada paso.
• Observar cada 24 horas la formaci6n 0 no de halos desensibilidad.(Figura
13.4)

Agentes Qulmicos

Realizar elmismo procedimiento del antibiagrama pera en lugar de discos de


",
sensibilidad 0 antibi6ticos se emplean discos de papel de filtra impregnado
con cada· agente quimico. Marcar en la base de la caja con el agente
correspandiente. (Figura 13.4)

'\ \
"
,•
.
'\

Figura 13.4. Pruebas de sensibilidad

95
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrablolog/a

Radiaci6n Ultravioleta
PRACTICA 14
• Tomar d,?s cajas de petri con Agar Nutritivo. MICROBIOLOGiA DEL ~

• lnocular la cepa a estudiar con escobill6n de algod6n estariL


• Asapticamente quitar las tapas de la caja de petri y colocar, en lugar de
estas, una hoja de papel de filtro estaril, a la cual se Ie ha hecho un . .
recorte central, en forma de estrella. ccJlo r:
• Exponer cada caja a la radiaci6n ultravioleta, por 10 minutos. I~'S/~
• Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
• Observar el crecimiento, cada 24 horas.

Nota: Proteger sus oj os a la luz ultravioleta.

Figura 13.5. Control de microorganismos con luz ultravioleta .

Actividades

\. Determinar el tiempo termico letal de cada una de las capas estudiadas.


',. Comprobar laacci6nde un antibi6tico de am plio espectrp.
. I

\ . Determinar los rangos de temperatura, pH y presi6n osm6tica en los que


se pueden desarrollar las diferentes ~pas estudiadas~ ,

96
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Itf/croblologla Olga Ines Montoya Campuzano

PRACTICA 14

:ri
I
con Agar Nutritivo.
. , MICROBIOLOGiA DEL AGUA

liar con escobillon dealgod6n estarit


! tapas de la cajade petri y colocar, en lugar de
I de filtro estaril,a la cual se Ie ha hecho un INTRODuce.ON
1 .
1de,estrella. ',"" ~ ,' ",. ' . , '

~dj!:>~
EI agua es el constituyente esencial para la vida, porque no solo hace parte
\ta, por 10 minutos.
t de nuestro cuerpo sino que tambian es indispensable en la elaboracion de
\~~ t~os alimentos. Puede ser un vehiculo de enfermedades como la
';~almonelosis, 'amibiasis y fi~bre tifoidea entre otras.

Cuando un agua cumple con las normas fisico-quimicas, microbiol6gicas y


organolapticas se hace apta para el con sumo humano. Para conocer la
potabilidad del agua se deben hacer conjuntamente anal isis microbiologicos,
fisico-quimicos,ademas de tener en cuenta algunos parametros como:
.'

• Procedencia de la muestra: Si es de una fuente natural, acueduclo,


piscina, entre otros.
• Usos: alimentacion~ /avado de materiales, industrial y domastico.
• Recipiente: Para recolectar la muestra el recipiente debe ser de material
de vidrio, previamente lavado con agua destilada estari',' esterilizado en
autoclave bajo condiciones'de 121°C/151b de presion a 15 minutos, 0 con
calor seco a 170°C/2h.Si la muestra a analizar viene de una fuente de
agua Clorada, antes qe esterilizar el frasco, se de debe adicionar un
agente inhibidor del cloro residual, como el Tiosulfito de Sodio al 0.01 N
en una cantidad de 0.5-1 ml.
• Toma de muestra: La toma de muestra difiere de acuerdo al lugar de
donde proviene asi:

97
.Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogla c

- Lago 0 represa: Tomar la muestra de un lugar de buena profundidad OBJETIVOS

lejos de la .orilla. Introducir las manos hasta el coda, previa mente lavadas Capacitar al estudiante en los analisis microbiol~
1
y desinfectadas. Crear una corriente artificial. Abrir el frasco dentro del deben realizar ~fJna muestra de agua para ~
agua. Llenar dejando un espacio de cabeza de 3 cm entre la tapa y la Interpretar lOS!:,! ,:
I'
~T "
.
muestra de agua. de contamina~: CJ', i.l.. ~ Ad
~ . Rios 0 quebradas: Recoger la muestra en contra de la corriente,
~'I . Lj,6o.S 1=.
seguir las mismas precauciones del proceso anterior. I: . ~Q),~O,3'1-S.
~,
. ' i ' '
ActividadesJ: .
- Tuberta 0 acueducto: Flamear la boca del grifo si es de material
resistente al calor; sino, desinfectar can claro a alco~ol. Abrir y esperar 5
<l q
HacerLin anc: ~-'- ..- -- -~. - "
i ,. {- 2­
, A, ,',' •

min. que corra el agua. Llenar el frasco. Dejar un espacio de cabeza de 3 estudiadas, ! ~ _

cm. Para proporcionar ox[geno a las bacterias aerobias .


De acuerdo
,
i ; •
'Ju" ,.
:, ' // _ _­

explicaci6n J. I
• Temperatura: La muestra de agua se debe transportar a una
temperatura de refrigeraci6n (4°C) en una nevera de icopor auna balsa -....­
con hielo.·· Las muestras deben ser procesadas inmediatamente; de, no
ser posible, almacenar refrigerada maximo 24 horas, si no se refrigera el
tiempo maximo para procesar es de 6 horas.

A cada muestra de agua se haran los siguientes analisis microbiol6gicos:

Recuento de Microorganismos Viables. La tecnica del' NMP deColiformes

Totales -E. coli, par el metoda clasico y rapido. EI NMP de Enterococos.


~~\l?~ful~
Lfmites Permislbles:
~5
EI agua potable no.debe presentar ningun tipo de microorganismos.
J
En aguas naturales se permiten 100 UFC de microorganismos viables I ml,

"- -"

debe haber ausencia de coliformes y enterococos.

98

Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologla . Olga Ines Montoya Campuzano

Jmar la muestra de un lugar de buena profundidad


I
OBJETIVOS
I

ucir las manos hasta el codo, previamente lavadas Capacitar al estudiante en los analisis microbiol6gicos de rutina que se Ie
I
i
.
\
I! una 'corriente artificial. Abrir
. '
el frasco dentro del deben realizar a una muestra de agua para saber si es potable 0 no.
~n espacio de, cabeza de 3 cm entre la tapa y la
Interpretar los analisis microbiol6gicos, para poder determinar las causales
de contaminaci6n higienico - sanitaria.
!Recoger la muestra en contra de la corriente,

~uciones del proceso anterior.

t Flamear la boca d_eLarifO-Qi..D...-I-,material


Actividades

Hacer un analisis comparativo de las diferentes muestras de aguas

estudiadas, en wanto a los pruebas microbiol6gicas.

De acuerdo a los resultados obtenidosen las pruebas dar una posible

explicaci6n a ellos.

, CU.J.J tar a una

~.""-.- ~ ~
I t--'
~'-J / - - - -
V
v \ . u l n a bolsa
~te; de, no
.efogera el

-::.
0,
. ~.." --
_-.3-~ Cf-{'\ .
\\.
eX (..N"~ " ol6glcos:
~
~
. ~'i·
oliformes
; ,.~s
\ .
\

sImi,

'\
99

Milnual de Mlcroblologfa . Olga InfMs Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa

'eyrE-CAS
.; GOrt$L

. PRACTICA 15
estructura altamente resistente presente en .los mi
..', MICROBIOLOGfA DE LA LECHE
Bacillaceae, como BacilliJs Y Clostridium;tamt
Streptomyces. En el Pienso es mas eomun' encontr~
INTRODUCCI6N CJostripium~ComrdnoJ'I"''''..:...J· ~

La leche es un producto integro obtenido mediante el ordetio de animales sanos,


es considerado un alimento basi co por su contenido de agua, protefnas, lipidos,
carbohidratos··como la lactosa, vitaminas, sales minerales y enzimas.. como
r
I .
~~~
~'~~~tf}'i-5
~ :J
A ~:~;;~

,euJ.)

-- -
lacteninas, lactoperoxidasa y lisozima, que actuan como germicidas;. Peresenta
~
_ q_.. -
..I ...--­
un pH entre 6.5-6.7. ...-.:.--- .

Los tratamientos termicos como la pasteurizacion destruyen microorganismos


psicotrofos y mesofilos, pero activan enzimas que causan alteraciones en el
producto despues de 14 dias del almacenamiento. La leche se congela para
evitar el crecimiento microbiano, aunque a temperaturas entre 0-5°C hay
crecimiento lento de ellos.

La leche en su estado natural presenta una microbiota inicial pro pia del mamifero;
pero puede contaminarse con aquellos microorganismos que estan presentes en
la ubre, en los manipuladores 0 en las superficies extemas.

En la ubre: Se pueden encontrar los siguientes microorganismos: Micrococcus,


,
Streptococcus, Staphylococcus agalactiae. EI Streptococcus lactis y S. cremoris,
no estan en la ubre, pero sf en la leche cruda

. Superficies Extemas: Son varias las superficies extemas que estan


relacionadas directamente con la contaminacion de la leche cruda como estiercol,
tierra, piensoentre otros. En el estiercol, es comun encontrar las bacterias del
grupo coliformes; en tierra, se suelen encontrar las bacterias que forman esporo,

100

Olga Ins Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla ,


.. ,
"';
Olga Ina Montoya Campuzano

'OTECAS
, GOMEZ

I '. PRAC:ICA 15 estructuraaltamente resistente presente en los microorganismos de la familia


~OBIOLOGIA DE LA LECHE .
B.acillaceae, .', como Bacillus y Clostridium; tambien· se pueden encontrar
Streptomyces. En el Pienso es mas comun encontrar microorganismos del genera
;.. .. ----------­ Clostridium. Como los clostridios pueden sobrevivir despues de la pasteurizacion,
es . factible encontrarlos en ciertos productos . 'crudos como quesos produciendo
elio de animales sanos,
alteraciones gaseosas por 10 tanto,pueden producir alteraciones gaseosas en
agua, protefnas, Hpidos,
ciertos quesos crudos· 0 frescos.
(aleS y enzimas como

[germiCidas.. Peresenta
Manipuladores de los equipos de ordeno: Las condiciones higienicas de las
manos de los manipuladores, es importante para una buena caUdad
microbiol6gica de la leche. EI equipo de ordeno debe mantenerse limpio y
~ruyen microorganismos desinfectado para evitar el crecimiento de ciertas baderias como Streptococcus
)san alteraciones en el I~ctis, Pseudomonas, Alcaligenes, Fla~obacterium, Chromobacterium 'y las
Ileche se congela para bacterias del grupo coliforme.
Lras entre O-soC hay
. .,
En la calidad de la leche, es de interes conocer los parametros qufmicos como
microbiol6gicos. En los para metros qufmicos, juegan un papel importante ciertas
}al propia del mamffero; enzimas como la Peroxidasas, Reductasas, Fosfatasas.
)ue estan presentes en
.. \0 /(
I '. Peroxidasa:
.
Es una enzima presente en la leche cruda, .pero la destruye un
proceso de pasteurizacion excesiva. Esta prueba debe dar positiva en leches
lanismos: Micrococcus, hervidas y pasteurizada. ',
s lactis y S.cremoris,

Reductasa: Esta enzima determina la calidad microbioJ6gica cualitativa de la


leche y esta relacionada directamente con la densidad microbiana, al medir el
externas que estan potencial de 6xido-reducci6n. Se realiza para conocer si una leche es de
cruda como estiercol, excelente, buena 0 regular calidad microbiol6gica.
rtrar las bacterias del
IS que forman esporo,

101
"'snua' de ""crobIoiogia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia

Fosfatasa:· Es una enzima que esta presente en la leche cruda y es destruida • Caldo tetrationato
mediante el proceso de pasteurizaci6n, par 10 tanto, al realizarse la prueba de la • Caldo Tripticasa soja
Fosfatasa en leche pasteurizada, esta debe ser negativa. ' • Caldo Voges ProskaVtl8r
• Agar Ba.i~/;LC!!lrltQr~~~,~-----
I i

Para los analisis microbiol6gicos se debe conocer. la procedencia de lamuestra, • Agar Hi


ya sea leche cruda, hervida 0, pasteurizada, se haran los analisis de rutina, • Agar P,
Recuento de Microorganismos Viable , de hongos y levaduras; NMP de Coliformes • Plasm~1I
totales y E. coli., presencia de Salmonella, Usteria y Staphylococcus aureus,
• Agar KI i
coagulasa po~itiva. I' i
• Agar Ll I
I : ~-'.,,- (\
• Agar cil;I
OBJETIVOS. :
• 'Agar ul, .'" - Dc.. r ,'"

Capacitar al estudianteen 'los analisis" microbiol6gicos de mayor inte'res para la • Vodo - - - - - ',-=:-.,-' - ;/ ---­
, ' ,

leche y los productos lacteos.


• Verde,
I ,

Interpretar los analisis microbiol6gicos, para poder determinar las causales de


• TUbaSI: • I
I

contaminaci6n higienico - sanitaria.


• Campa i i',

• PiPeta) i

MATERIALES • ~
Cajas ; •
• Leche cruda, hervida y pasteurizada • Asa de •
/ i
• Azul de Metileno al 0.05% • Meche,' ~)4'\ C" ,,' _ '.'
• Brila Ii' 31
~~
• Glucosa Azida PROCEDI\ • cP.DX~\)~,~fu:"
• Purpura de bromocresol I'
/

• Fluorocult
Preparaci,
\JJS .5 \J'::- : .
• Agitar sl
------ ..
• Plate Count I
--- '"
• Abrir asl /{ 10 I '6 ~ ,
• AgarEMB I. r0
• Tomar I i i , )
• Caldo Eijkman
\ : ~~ K 1 ('('\ - )<
• Caldo cerebro-coraz6n (BHI) 1 rr>?;', ~[,N'I?:,
.
1
, .

I
~

f!" f\I . , .

t-..> \) ..J '"


-k..
.

~~·o jv
102 j

'. 1'=>18·~ 'It



I ':
1" ri' /;--;-?r­
\
Olga In(u; Ifontoya Campuzano Ifanual de If'crob/alogla Olga Ines Montoya Campuzano

~ue esta presente en la leche cruda y es destruida • Caldo tetrationato


i
/rizaci6n, por 10 tanto. al realizarse la prueba de la • Caldo Tripticasa soja
!a. esta debe ser negativa, ',' • Caldo Voges Proskawer
• Agar Baird Parker
ossedebe conocer,la procedencia de lamuestra,
• Agar Hecktoen
; t ' --,~~-'1 '1" d .
~as ,::\u... ~_. ~a ISIS e rutlna,

lr -: cJ "'- ~~ IP de Coliformes
occus aureus,


Agar Palcam suplementado
Plasma de conejo desfibrinado
• Agar KIA
• Agar LlA
• Agar citrato Simons
• Agar urea
teres para la • Vodo
• Verde Brillante
causales de • Tubos tapa-rosca
• Campana de Durham
, ~. '
• Pipetas de 1 y 10 ml.
• Cajas de petri
• Asa de Diglaski

• Mechero

PROCEDIMIENTOS
,i

Preparaci6n de la muestra de leche:


• Agitar suavemente la muestraen su envase durante unos 20 segundos.
• ',. t _. •

• Abrir asepticamente.
• Tomar la muestra con material esteril.

\ 103
Mlltlual de Mlcroblolog/a' ' OIgalnes Montoya Campuzano Aflltlual de Mlcroblolog/a

Pruebas microbiol6gicas.

Pruebas qurmicas _ Presencia de Salmonella.


• Prueba de la Peroxidasa
• Tomar 25 ml de la leche
Aun tubo esteril tapa rosca adicionar
Ad 'lCI'onar a {}qr:-LdCLcaLdo cerebro-coraz6n I
· , . I / i, ---­
• 2 ml de la muestra de leche concentracl~/ 1­
, • 1 ml de H202 al 3% vlv • Incubar a 3~ , CJ i tl- ~
• 2 ml del reactivo de guayacolato
• Tomar 1 mil! ' Lf 162 S
Nota: Positiva si se produce un color curuba. Negativa si no cambia de color.
• Inocular a ~,' : ~ -'0, 3"+-$
contamina11

"'->

i (l

• Prueba de la Reductasa
• Incubar a! i
A un tubo estenl tapa rosca adicionar
• Tomar ury , ~-
• 10 ml de leche.
• 1 ml del reactivo azul de metileno al 0.05% v/v.
j petri cont,f, _ _ _ _~. .:. ., y /

• Incubar,
DCJ,>'

• Mirar cada media hora si h"ay decoloraci6n de la leche


Nota: Si hay decoloraci6n de la leche antes de media h~ra, su calidad
• Observ{
traspar1 ,)..
---
microbiol6gica es mala. Si la leche es cruda y damora mas de cuatro horas para
• ReaIiZJ"
decolorarse debe hacersele la prueba de antibi6tico.
• Confirr I
negar: "

I
~ J
- Prueba de la Fosfatasa
I , '
,
A un tubo estenl tapa rosca adicionar
Pre$' i,
I'
• 2,5 ml del reactivo 4-para nitrofenil fosfato dis6dico
• 0.5 ml de leche
• TO'/. ~~\)V~~-T
· ~:l
\ /

• Incubar a 35°C durante una hora


Nota: Si no hay cambio de color la prueba es negativa,Si se presenta cambio de
\JJS:s \J':.­ -1,

color a amaril!o y sube ha~ta verde la prueba es positiva. J

104
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Mlcroblologia . Olga Inas Montoya Campuzano

Pruebas microbiol6gicas.

- Presencia de Salmonella.
• Tomar 25 ml de la leche
icionar
• Adicionar a 225 ml de cal do cerebro-coraz6n (BHI) a la mitad de la
concentracion especificada par el media.
• Incubar a 37°C durante 16 a 24 horas.
• Tomar 1 ml de la muestra incubada.
cambia de color.
• Inocular a 9 ml de cal do tetrationato (adicionar 3 gotas de yodo para evitar
contaminati6n y verde brillante para inhibir flora acompariante).
• Incubar a 37°C durante 16 a 24 horas.
• Tomar una asada e inocular par el metoda de siembra en placa, en cajas de
petri can agar Hecktoen.
• Incubar a 37°C durante 24 horas.
• Observar colonias trpicas de Salmonella (punta negro rodeadas de un halo .
hora, su' calidad
trasparente).
cuatro horas para
If,
• Realizar las prueba bioquimica a estas colonias (KIA, LlA, Citrao y Urea):
• Confirmar la presencia de Salmonella. KIA: KlA+H2S, LlA: KlK + H2S, Urea
negativa, Citrato positivo.

- Presencia de Staphylococcus aureus


• Tomar 0.1 ml de la muestra de leche
• Inocular par el metoda de superficie sabre una caja de petri con agar Baird
Parker.
nta cambia de
• Incubar a 37°C durante 24 a 48 horas.
• Observar colonias tipicas de Staphylococcus aureus (punta negro con dobfe
halo trasparente).
• Tomar la colonia e inocular en 6 ml de caldo cerebro-coraz6n (BHI)

£~-, • Incubar a 37°C durante 24 horas.

-1. K~
~~\,~\)J 105

Manual de M/crobiologia
Manual de Microblolog/a ' Olga lriu Montoya Campuzano

PAACTICA 16
, MICROBIOLOGiA DEL R
• Inocular 0.5 ml en 0.5, ml de plasma de conejo desfibrinado.
• Incubar a 37°C durante 4 horas.
INTRODUCCION
• Observar producci6n de coagula para eonfirmar la presencia de
~---"--------

StaphylococCus aureus, coagulasa positiva. i:


I , I

EI rumen es ~' 1­
una temperat! CJ',il-~

- ,Presencia de Listeria. :1 , L-J,6~'5


salivares de!
~O/?:>~-$·
I
• 'Tomar 25 ml de la muestra de leche.
desarrollo YI:

• Adicionar a 225 ml de CaldoTripticasa Soja.


facultativos ~ CJ
=-q ­
• Incubar a 30°C durante 24 horas.
considerado f, ~->~-- I

• Inocular una asada par el metoda en superfieie sabre un agar Paleam -:--­

suplementado.
I i
hongos, coni: ' I Uv ,.
fase gaSeOs8 i • ----'-,--;;,..;..'7/ ----­
• Incubar a 30°C durante 24 horas.
t~ ,
• Observar colonias lipicas de Usteria (punto negro, halo verdoso).
En una mue
-...-
• Realizar pruebas bioquimicas (KIA, VP, RM, SIM, Urea). \'
protozoos di ;..,

• Confirmarla presencia de Usteria. KIA: AlA, VP: negativ~, RM: positiv~, SIM:
se eneuentrc

,positivo al hierro, Urea negativa.


300 Ilm, P1I

Actividados.
(Annison, 19,

,I
! '
i

Hacer un analisis Comparativo de las diferentes muestras de leche estudiadas, en


Los protozl
o/O<j~V"~n
I,'

cuanto ~ los pruebas ,microbiol6gicas. observarlos I '

r'
I ,
De aeuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas dar una posible explieaci6n diferentes t1 '

a elias. protistas irl


\JJS5. \J'
control sobrl
!
La clasifica)
que

~ !
I:
t

106
O/ga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia Olga Ines Montoya Campuzano

pRACTICA 16

'e plasma de conejo desfibrinado. . MICROBIOlOGiA DEL RUMEN

I .
iloras.

)agulo para confirmar la presencia de


INTRODUCCION
~agulasa positiva.

L­ EI rumen es un ecosistemaanaerobio, abierto, continuo, muy reductor, con


!-- ­ una temperatura de 39°C y pH entre 6 - 7, amortiguado por secreciones
\
1
­
salivares de bicarbonato y fosfato; estas caracterfsticas favorecen el,
~. desarrollo y crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos, 0

facultativos altamente especializados. Lo anterior, hace que el rumen sea


considerado un verdadero fermentador; en donde bacterias, protozoos y
hongos, convierten la fibra en acidos grasos y amonio, produciendose una
fase gaseosa donde los constituyentes principales son: ,C02. NH4 Y N2.

En una muestra de rumen es mas factible encontrar bacterias, hongos y

v, ositivo, 81M: protozoos de la clase ciliada y flagelada. Los ciliados son mas abundantes
, .f

se encuentran en un promedio entre 10-10 celulaslml,


,
,su tamalio es de 200­
'

300 Ilm, por 10 que se pueden observar mas faci! que los flagelados.

'~71 'l
(Annison, 1965)

~.~~.:y _.. \Udiadas, en, Los protozoos propios del rumen son muy dificiles de aislar y para
~1' \\,:fy'"e, (\y-06 .. observarlos se requiere de coloraciones especiales; porque ell os presentan
p.f(,;""- ,0v P . . ~ ,~ " 'explicaci6n
diferentes tamalios y los de menor ,talla se confunden con las bacterias. Los
" A protistas ingieren bacterias, ruminales y se cree que ejercen a/gun tipo de
\' . ~-'~\J~~
--. \f1 control sobre la poblaci6n bacteriana.
, ,
:""1 , La clasificaci6n de las bacterias ruminales se realizan con base en el sustrato
que degradan, por ejemplo: celuloliticas, hemicelulolfticas, sacarofiticas,
\

\
107
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia

amiloliticas, proteoliticas, lipoliticas 6 tambien de acuerdo al producto


Se hace con el fin de extraer el f1uido' ruminal
sintetizado, en: metanogenicas y aCidoliticas.
desinfectar y afeitar el animal; hacer una perton
que va desde el exterior hasta el rumen.
Los hongos ruminales, son anaerobios que alternan una forma flagelada y
" ,
".-('
otra inm6vil, empiezan a colonizar el rumen despues de ocho a diez dras de 'I

haber nacido la cria del rumiante, presentando gran afinidad por los tejidos Est! I 1:­
I

lign'ocelul6sicos 'de las 'particulas vegetales y tienen la' facultad de degradar flui~ 0',1).-<;
I

Lj,b0..'5
celulosa yhemicelulbsa produciendo acidos grasos volatiles como el acetico, po~l
~O,?J'i-$·
propi6nic'o 'y buUrlco.' AI no presentar citocromo, ni mitocondria, ellos tom~n dife
'I'

.=CJ _
la enetgia de los'procesos fermentativos. del,
(T9!
~-.--,- ......... -
" ­
Metoda'de Muestreo ,0:- Lr, '". c:
Ii 1 , ­
2. f , ----',-,-:,--'-' 7/ ------­
Para 16s anallsis microbiol6gicos las muestras del rumen se pueden obtener ! i
t
mediante 'tres metodos: fistulaci6n 0 canula, sonda nasofaringea y de
i:
inyeeci6n pentoneal. ' I ;'
I; ~.
Ii

1. "'Metodo de Fistulaci6n 0 Canula:

pAllo DE CAIIPO

') \
"
'y\
'iii

Figura 16.1. M6todo de fistulac(6n 0 cAnula•

...,.~.
:~'."~ \ 108
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga InesMontoya Campuzano

rs
,iipolfticas
0 tambien de acuerdo al producto
" :.'

y.aCidOHticas. Se hace con al fin de extraer el f1uido ruminal, pero primero se prqcede a
desinfectar y afeitar elanimal; hacer una perforacion cutanea de unos 20cm,
!
i anaerobios que alternan una forma flagelada y que va desde el exterior hasta el rumen.
adiez dias de
I

pnizar el rumen despues de ocho


~iante! presentando gran afinid~d por los tejidos Esta metodo es de facil manipulacion, se puede obtener gran cantidad de
r'·'~"'-· - ~d de degradar f1uido ruminal, pera alaislar los microorganismos, estos, se podrian afectar
~
I,
_Cl
~-
-: : .-' P--Z omo el acetico,
t"
por la diferencia de las presiones entre su medio natural y el exterior; estas
J_ r0, a, ellos toman diferencias se manifiestan en cambios metabolicos y aumento 0 disminucion
~. de la poblacion, con mayor incidencia en los microorganismos patogenos.
JJ (To ranzos , 1972)
CV
) -.. ~ ~,\
r~
If-
V
()I/ ------------­
lC;
\
~den obtener
2. Sanda Nasafarfngea: A traves de una sonda na~ofaringaa, que se
introduce por ,via nasal, se extrae, una buena cantidad defluido ruminal.
, 1

rI ~
ex
-!3--."
t.."".:;. - cF" .
, .'ngea y de Si se utiliza materialas estenlas y un buen procedimiento no causa ningut;'l
trastomo al animal. En cambio, una mala practica puede ocasionar un
desvio de la sonda a otro lugar y ocasionar obstruccion por presencia de

~.
~. '

solidos disueltos en el f1uido ruminal. .



J

,;
tl Figura 16.2. Sanda nasafarfngea

-.- .~Ji- /' ~~


Cf"("~ :\:,
"I-
K5
,
,)
I
-1
~ ~ \. J\))
.!.....- \ ~~ \O~lj' \ 109
Manual de M/croblologia. Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Mlcrobiologia

3. Metodo de Inyecci6n Peritoneal: Se utiliza una jeringa con aguja esteril


de N° 14616, que se introduce en ellado izquierdoy parte peritoneal del rR9~rfi~~'mEJilJe~tra de' fluido ruminal, ya se
rumen, el tamano.de las agujas depende de la cantidad'de ,Ia muestra a sonda nasofaringea 0 por inyecci6n periton
examinar; sin embargo, la cantidad de rumen extraido es. poco.. Es un • Realizar recuento de hongos y bacterias
metodo rapido y simple de realizar, tiene la ventaja, que el contenido • Aislar bacterias celuloliticas.
.

.. ruminal extrafdo,. se encuentre de una vez aislado, sin requerir de. un


equipo .sofisticado, debido al sistema presurizado interno· de la' jeringa;
• Di1° 1­
. flaf
pero ,muchas veces' la aguja se puede obstruir por la presencia de C:>',tl--~
'I L.j ,6~ $
I' .
. material s6lido.
~O,?>~$
Activi:
OBJETIVOS
Com~
I :'· g
~-,- ­ - -:.

--
...

Conocer las diferentes tecnicas de muestreo para obtenci6n de fluido


flage,); '.
.:..

, Du" ".
-
rumina!.
EsquJ :'
r
---',--
Diferenciar por microscopia 6ptica la microbiota normal del rumen.

Diferenciar entre protozoos ciliados y flagelados.

l' ... ....:-. '"//

MATERIALES
• Utensilios adecuados para el tipo de muestreo.
• Microscopio
• Soluci6n salina al 0.85%
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Capilares
• Lugol
• . Filtro de membrana.

~. . '
110
lC\
. Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano

·eritoneal: Se utiliza una jeringa con aguja esteril


,troduce en ellado izquierdo;y parte peritoneal del
I
rR98JTc9~'rUE~\~tra de' fluido ruminal, ya sea de un animal fistulado, con
.~ agujas depende de la cantidad 'de·la muestra a
I
i
. .
sonda nasofaringea 0 por inyecci6n peritoneal.
'i la cantidad de' rumenextraido es. poco. Es un
• Realizar recuento de hongos y bacterias
de realizar, tiene .Ia ventaja, que el contenido
- .-~ • Aislar bacterias celuloliticas.
requerir de un • . Diferenciar por medio de coloraciones especiales los protozoos ciliados y
.de la' jeringa; flagelados.
presencia de

Actividades

Compar~r 10 observado al microscopio, con los esquemas de ciliados y

pi6n de fluido flagelados del·manual y de otros teXtos;'

Ien. Esquematizar los microorganismos observados.

1
I

1
1
'1

Figura 16.3. Protozoos flagelados.del Rumen

III
Manual deMlcrob/oiogJa Olga In~ Montoya Campuzano
. " . ~ . , Manual de Microb/oiogJa

:~
.........
..
.

ISO~
. . .'''~:~..'-.' ..

COLORANTES YREAC'

Coloraci6n de Gram

o
E.sMIpIac
o
'E~ £CIIICtJ.... 1- A ccJlo r ~ [
o',t?-<;
~ 'S/\!!3.
E......... '

L1lb~5 I
~Ol?:>'i--S
.C1.....l

, . 3--- ~ ~--~
.:;;J.-'- r'c 1"'­
I - ­
.:.-­
~ - DLI >'~-II'
-------..!.--j/ ----­
~
~
~\

OsI1acodlnlllm

I;
I

Figura 16.4. Protozoos ciliados del rumen

112
Olga In~ Montoya Campuzano
Manual de Microblologla,' Olga In~ Montoya Campuzano

,~. COLORANTES Y REACTIVOS

Coloraci6n de Gram
1. Cristal Violeta (1litro)
Violeta de Genciana (Cristal Violeta) 10gr
Acido Fenico 0 Fenol 20gr
Alcohol absoluto etmco (Etanol) 100ml
Agua destilada 900ml.

Preparaci6n: Diluir en parte del alcohol el cristal violeta y luego, ir


adicionando, con agitacion los demas componentes.

2. Lugol
E."" Yodo metalico O.5gr
"EIIdIp/odhthIm Yododuro de Potasio 1.0gr
Agua destilada 100ml
Preparaci6n: En un mortero colocarel yodometalico y el yoduro de potasio
, .
Osbacodlnlum luego triturarlos. Cuando el polvo este fino, al mismo mortero se Ie adiciona
el agua y luego se envasa.

3. Alcohol acetona
Alcohol 95%, 3 partes 75ml
,I
Acetona 25%, 1 parte 25ml

4. Safranina
Safranina 19r
Alcohol Absoluto , 40cc

men Agua destilada 360ml


"",/' ~~
C"ttV'

,J\j)
\Q~v), 113
~)(
..--:--:

K
1 c:J
Manual de Microbiol~/a" . ' ,
Manual de Mlcroblologia ' Olga Ines Montoya CamPuzano

Preparaci6n: Disolver el Azul de Metileno en el


Nota: Importante dejarlo madurara 37°C, mfnimo 48 horas, con agitacion
" ,~ \ '

agua destilada y se filtra.


ocasional.

Nota: Antes de usarse todos los colorantes debt


Coloraci6n Simple
'" de Metileno
Azul
Coloraci6n de Esporo
Azul de Metileno
Alcohol puro
4'gr
200ml
-----------------
Agua destilada (Desionizada) 1800ml.

Coloraci6n de Zielh N~elsen


1. Fushina bAsica .

Fushina basica 4gr

Fenol (liquido 8ml) 8gr

Alcohol Absoluto 20m!.

Agua destilada 100ml.

Prep~raci6n: S~ filtra y se deja madurar a 37°C por 24horas se envasa en


frasco oscuro.

2. Alcohol Acido
Alcohol absoluto 95gr
Acido clorhfdrico 5ml
Sa mezcla con cuidado.· Evilar quemarse

3. Azul de Metileno de (Ioefier)


Azul de metileno O.3gr
Etanol al 95% 30ml
Agua destilada 100ml

114
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblol~/a,." '. Olga Ines Montoya Campuzano

1adurar·a. 37oe, minimo 48 horas, con agitacion Preparaci6n: Disolver el Azul de Metileno en el alcohol, luego se adiciona el
; v .< \

agua destilada y se filtra.

Nota: Antes de usarse todos los colorantes deben filtrarse.

Coloraci6n de Esporo
1. Verde de Malaquita
Verde de Malaquita 5gr
Agua destilada 100ml

2. Safranina al 1%. Colorante de contraste.


Safranina 0.05gr
Alcohol Etilico 10ml
Agua destilada SOml

Coloraci6n simple 0 Nigrosina


Es una coloracion acida, la cual colorea el medio y no la celula.
Nigrosina 10gr
Agua destilada 100ml
Preparaci6n: hervir durante 30 minutos por refJujo. Una vez hierva y se
enfrie se Ie afiade 0.5 ml de formol, luego se filtra dos veces y. se envasa en
un frasco oscuro.
..

La tinta china reemplaza la Nigrosina.

Se hace como un extendido de sangre, haciendo una muestra del

microorganismo y el colorante

· /\.

\
Coloraci6n para hongos
Colorante Azul de Lactofenol
\ Acido Lactico 20ml

\ \
Fenol 0 acido Fenico 20ml

115
/

Manual de,Mlcrobiologla .' Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Mlcroblologia '

, Glicerin'a ,'40ml '


I Azul de algod6n ," O.OSgr BIBLIOGRAFiA
Agua destilada 80ml
ALVAREZ ,Liliana y otros. Manual de L:
Universidad de Antioquia, 1990. ,,',
Se lIeva todo al bano Maria, mezclado con cuidado y se envasa en frasco.

,
A ccJlo r -: C
\ '

I ;; 'S/\!!3 '
\ G..JJ ,
~ 5-.-~
-­1--­
:. '

/;r~
~
~ '/} K:

116
,.

Olga In~ Montoya Campuzano , Manual de Mlcrobiolog/a " Olga Ines Montoya Campuzano

",O.05gr BIBLIOGRAFiA
80ml
ALVAREZ ,Liliana" y otros. Manual de Laboratorio de Bacterialagia.
I, mezclado con cuidado y se envasa en frasco. Universidad
. , .. de Antioquia, 1990.
"

ALZATE, Ruben. Microbiologia: Practicas de Laboratorio. Universidad


Nacional de Colombia Sede Palmira, 1996.

BRADSHAW I, Jack. Microbiologia de laboratorio. EI Manual Modema.


Mexico, 1976.

BROCK, Thomas D. y otros. Microbiologfa. Ed. Prentice Hall


Hispanoamericana S.A, septima edicion, 1996.

GARCiA G., Gustavo y otros. Manual de Microbiologia General. Universidad


de Antioquia, 1992.

J.P., Jovany. Rumen Microbial Metabolism and Rumiant Digestion. Institud ,


National of Recharche Agronomical. Paris, 1991.

J.w. CZERKAWSKI. An Introduction to Rumen Studies. First Edition. Gran


,', >,

Bretaria. 1986.

Mac FADDIN, J~an. Pruebas Bioquimicas. Ed. Medica Panamericana,


Argentina, 1980.

\
Manual de Medios de Cultivo de Merck. Alemania,1994.

117
)

Manual de Mlcroblologla '. Olga InesMontoya Campuzano

MAYEA, Sergio. Microbiologra Agricola. Ed.' Pueblo y Educaci6n, Cuba,


1989.

MONROY·H.,Oscar; VINIEGRAG., Gustavo y cols. Biotecnologra para' el


Aprovechamiento de los Desperdicios Orgariicos.:A. G:' T.Editor, S. A.
Mexico. 1981.

NOLAN J.V.; LENG R. A.; DEMEYER D.L The Roles of Protozoa and FUr.lgi A (c.J10 r:. [
in Ruminant Digestion. Ed. Penambul Books Armidale NSW. New England.
i I;;SY~
1988. 'i

(,
II
. ~ ("
't.I

'\:, [', CI, 3-- ~ ~-,- 1


HUNGATE, Robert E. The Rumen. and its Microbes. Ed. Academic Press.
New York. 1966. II,
~ ----- ("
. ...-- (~
,:'~
~~--
C, .,'
\ ,'" - DLr"~ II
.'. PASCUAL, Marra del Rosario. Microbiologra Alimentaria. Ed. Dfaz de Santos \ _----;-J-'-7/ ----­

II .
S.A. , Madrid, 1992. '
\\ - ~
~
,.
PEREZ, Mirta y otros. Microbiologfa Veterinaria. Ed. Pueblo y Educaci6n,
, . >.
,,-

I' ..
Cuba, 1992. '

RUIZ,' Manuel. Notas sobre tecnicas de fi~t\Jlaci6n del rumen y duodena en


pro~dilTlientos
Bovinos y afines: del'laboratorio. Universidad de Antioquia,
~!, \ JS&' ,.:;:-.
\' ~~~?~1)Ji?'
1990

YAUNNER, Sara y DELGADO,'Maria Isabel. Practicas de Microbiologia. Ed.


Pueblo y Educaci6n, Cuba, 1988.
/ ~ 5, , f\~ . ~ '\ 1,
\J~~-
\:
\"
i"

___- J \
t: ---­
WISTREICH, George; Max D. Lechtman. Prasticas de Laboratorio de ". .!/b/'b ~
Microbiologia. Ed. Umusa, Mexico, 198~.
\ , ~'"' ~U 1 f'0 ~ Y. 1;J!::.
i'
EXPE~IENCIA PROFESIONAL DEL AUTOR.
\ .~- ~ ~ p(fi\~' r1

118
\:.
I :!
til \.
\ I / ., ,'- '- )
~(;O
I' '
.\",\0\

You might also like