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SEDE MEDELLIN
MANUAL DE
,
MICROBIOLOGIA
Elaborado por:
1999 . j
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Ilurrii~IIII~I~!II~II'lli .
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4000
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Manual de M/crobiologia Olga Ines Montoya Campuzano ,~ 6::; Manual de M/croblologfa
,'1,;
INDICE
, I! ~-~- ..
pRACTICA 2. OBSERVA! I ' r';-
<,~.~Atodos rnis estudiantes que con sus aspiraciones e inquietudes I. I
, en el desarrollo de las practicas de laboratorio, a traves de todos pRACTICA.3. COLORA~' 1,/ . \
AI estudiante Alvaro Penagos Quiceno quien fue el que elaboro pRACTICA 6. CULTIVo'
r
-
los dibujos ilustrativos. ' PR.ACTICA 7. RECUE~ • ';-.
pRACTICA 8.' ESTUDI,i., '
II I I
BIOQU! i '
A las personas'qu'e han revisado el manual, por sus sugerencias y
sus grandes aportes. pRACTICA 9. GENET;,
pRACTICA10. ESTU~ i
pRACTICA 11. ESTUr!
Olga Ines Montoya Campuzano , II '
PRACTICA 12. PRO~! i .'
I pRACTICA 13. CON1' '
Ii ;
pRACTICA 14. MICF' i II '
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·1 BIBLIOGRAFiA .• J!
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Olga Ines Montoya Campuzano 65 Manual de M/croblologfa Olga In~ Montoya Campuzano
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1,
i INDICE
I ,,". ,,.'., ; ' ,",.
I
tieo ~sid basadoen revisiones bibliografieas y Page
experieneia .piaetiea de la autora durante
INTRODUCCION .................................................................................. 7
PLAN DE TRABAJO •••••.•.••••••••••.•••..•..•••.••••.••...•.••••..•..••••••...•••.••••••••.. ~, 7
NORMAS GENERALES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO... · '8
PRECAUCIONESPARA EL USO DEL MICROSCOPIO ......................... ' . 8
icrobiologia
rna' . PMCTICA 1. DISTRIBUCION DE MICRORGANISMOS EN
... AMBIENTES NATURALES .................................... 10
PMCTICA 2.
OBSERVACION DE BACTERIAS .............................~. 16
quietudes
s de todos PMCTICA.3.
COLORACION DE GRAM '............................................ 22
PMCTICA 4.
COLORACION DEL ESPORO BACTERIANO ............ .25
PMCTICA 5.
COLORACION DE CApSULA ..................................... 29
'elaboro I
I
PMCTICA 6.
CULTIVO YAISLAMIENTO DE,MICROORGANISMOS. 32
pRACTICA 7.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS ...................... 50
. It,
PMCTICA 8.
ESTUDIO DE LAS CARACTERfsTICAS
rencias y
PMCTICA 9.
GENETICA BACTERIANA .......................................... 76
PMCTICA10.
ESTUDIO DE HONGOS ......... ;~ ...........................~........ 79
.mpuzano
I -
PRACTICA 12. PROTOZOOS ••.••••..•.•••••....•••••••••.....•••••...••••••••.•...•.••••• '., 88
II
REACTIVOS •••••••••••••.•.•••••••.•••••••..•••••••.•••••••••.••••..••••••....•••••...••....•••...... " 113
I
BIBLIOGRAFfA ••.••••••.....••••••...••.••..••...•...•••...•.••••..••••..•..••••.•••••••...•..•••.. 117
!
3
,Manual de Mlcroblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia
15
-I: !.
I
I.
1X_~~r
(l
Figura 5.1.
Coloraci6n de capsula................................................... 30
Figura 10.4. Estructuras.
Figura 5.2.
Pasos para realizar una coloraci6n negativa .......... ~ .•• " 31
Figura 10.5. Rh'IZOpUS, ten
i i
Figura 6.1.
Incubaci6n en caldo •..•••••••••.••••••...••.....•.•.•..•....•.•........... 35
(a) macros) ;
Figura 6.2.
Incubaci6n en bisel .••••••..••.••••...••..••.•••..............•...•.•...... ·36
Figura 11. Algas ....~ r
.
!! , ,
I
Figura 6.3.
Incubaci6n en agar s6lido ............................................ 37
Figura 12. Protozoos' r . \.)SlS '
Figura 6.4.
Siembra por exposicl6n ................................................ 38
Figura 13.1. Control d{ ,•.
Figura 6.5.
Toma de muestra ............................................................ 38
Figura 13.2. Control d1 . ~~0~
Ii '
Figura 6.6.
Pasos para la siembra en el m6todo Franc6s ............ 40
(concen~r ;
;i
\JJS
I
Figura 6.7.
Siembra metodo clasico ............................................... 41
Figura 13.3. Control C;I i
If! ____
Figura 6.B.
(a) siembra metodo radial (b) desarrollo de su colonia, 42 Figura 13.4. PruebasU I
r'
1
,fo,c6 kN
Figura 6.9.,
(a) siembra metodo en cruz (b) desarrollo de su colonia 43 Figura 13.5. Control J f ' r0~
Figura 6.10. Extendido de la muestra metodo por diseminaci6n ..... 44
Figura 16.1. M6todot· .~9
Figura.6.11. Siembra metodo en profundidad ..................................... 45
R x ~
Figura 16.2. Sondar'( , rn3
Figura 6.12. Desarrollo de colonias en un medio Uquido (a) en
1b/ 8,K-')(
N 1r
4
'""" 10
Olga Ines Montoya,Campuzano Manual 'de" Mlcrobiologia Olga Ines Montoya'Campuiano
,f
ptico Y sus partes ................................... 9
Figura 7.1. Recuento de microorganismos (metodo de las
·~lo r -:
d ~ bL-2
1
.. 13
r....... 13
Figura 7.2.
Figura 7.3.
Numero Mas probable ............................. ~......................
Resultados en la prueba del NMP ...............................
58
58
''S/~. I.... 14
Figura 8.1. ioma de muestra en la serie Bioqufmica .................... 73
. ~..J.J
5---- u\
15 Figura 8.3. ,Pruebas de (a) caseinasa (b) hem6lisis ..................... 74
~-,
C ,", ',;
.-:-; ~ _ _ _- -
21 Figura 9. Agar tripticasa de soja con oxitetraciclina ................. ' 78
~'J/-- 24
Figura 10.1. Pasos para realizar el microcultivo de un hongo ...... 81
27
Figura 10.2. Estructuras de un Basidiomiceto ............................... 82
-- 27
30
83
38
Figura 13.2. Control de microorganismos por presi6n osm6tica
40
(concentraciones de glucosa) .................................... 93
41
Figura 13.3. Control de microorganismos por temperatura ............ 94
fa42
Figura 13.4. Pruebas de sensibilidad .......... ........... ............. ............. 95
,47
!" • • • •
! Figura 16.4.. Protozoos ciliados del Rumen ...... ......... .................... 112
f
I
I
5
.Manual. de Microblologia , . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia
INTRODUCCI6
Lista de Tablas
. y/
VI
PLAN DE TRAB~! .1 .
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1. Las prueb~i
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I
I
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dependien{ ,
2. Un miCrOS;! .
los respofl,1 i
3. Antes def:.'
relacionac'
/i
4. AI iniciar f
5. Los estu(l
II
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realizada''I,i
I'
6. Las prac: .
'I
curso tei
II
7. EI estu(
, /.:
patogen
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Olga In~ Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga In~ Montoya Campuzano
INTRODUCCI6N
Lista de Tablas
) I"
2.
dependiendo de los objetivos de la practica.
Un microscopio se aSignara a cada dos estudiantes, los cuales seran
los responsables.
3. Antes de empezar cada practica, se realizara una prueba corta
relacionada con la practica anterior y con la que se va a efectuar.
4. AI iniciar una sesion practica, se hara una demostracion de la misma.
5. Los estudiantes elaboraran un preinforme y/o informe de la practica
realizada segun indicaciones.
6. Las practicas, se dictaran en el mismo orden que se desarrolla el
curso teorico.
7. . EI estudiante trabajara con los microorganismos patogenos y no
4/
-1 K~
patogenos de importancia, en la areas de asistencia tacnica, Que Ie
~j ~ ~ I. J\»)
IO)CJ'
II 7
Manual de Microblologfa , Olga Ines Montoya Campuzano . M8IJual de Mlcroblologfa
corresponde prestar como: calidad de agua, de alimento, de leche, del s. Oejar el microscopio con la platina ab~
semen entre otras. con el de menor aumento que presente
6. Colocar el plastico 0 forro de proteccion
NORMAS GENERALES PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO 7. Guardar en el cajon con los lentes hacic
como: calidadde agua, de alimento, de leche, del 5. Oejar el microscopio con la platina abajo y con el objetivo de 10X, 0
con el de menor aumento que presente el microscopio,
6: Colocar el plastico 0 forro de proteccion.
lARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO 7. Guardar en el cajon con los lentes hacia delante.
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\ fhO.· \
~ ~'2- \' antes y despues de cada
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oratorio. . . .
\ en fresco, ni derrames en
\ infectarse.
~e cultivo destapado.
IMAGEN --;r-+~
INVERTlOA
TORNILLO
\terial de desecho" MA.CRO
.
,
BASE
ESPEJO BOMBILLO
'cuen'tra alguna
trol.
\ de usarlos.
\10.
9
. Manual de Mlcroblologla Olga In~ Montoya Campuzano
Manual de M/croblologla
. pRACTICA 1
En el_IJ.~f!9!....~~~icio de la denticion· sa ~9(J
DISTRIBUCI6N DEMICROORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES.
~~-Eacteroides '1_ bacilos !fu~1/l)t~~s; al
.' ~erobios. Posteriormente, con el· camb;d;
cambia y en los er..J("1'- ._,......._.._
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INTRODUCCI6N .
/e~aduras. - ,'
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I,
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y 160. '5
aun en ambientes hostiles, como las aguas termales, el Gran Lago Salado, La micro biota dj! ~O,6':}$·
----. ~J ...., - - •• - -••- - _ _ _ " ... :
El.............
~
intestino
,
contiJi
...•. __._--- ~/'
organos internos como el corazon,. los rinones,el ce~~t:>r.9L.geben estar Bact~ri~~;;-~ragJ . )-.
exe~tos mi~~o~~~~,~i;~p~;~to' que ~u pre~encia
- - - - . - - -.. , I
de en ellos causaria '!1icroQ[g_c:nis.!!"o~l :
!
I'
Una de las maneras mas sencillas para demostrar, en el laboratorio, la OBJETIVOS f'
~;isteQcia de g~lTl1E3nes en un, c!r!l_bl~~~-.Q~!~[~~~q9, es por !~'~~t~'dc;~~ F
.'
I PAACTICA 1 En el _I}I~!...., al
inicio de Ja dent!~i<?!:!3_~___ ~yede~~ilcontrar esprrg~uet~s
s ambientes
---
bgo Salado, L~_~~r9.Qiot~9_!Lt{~~ lQ~~~ ...nasalesPLJ~ge cont~ner, c~ry~r:!~I?!I_9!~~!~S,
I
rOnde no_ha estafilococos y estreptococos. Los bronquios y los alvaolos pulmonares
olcanes en ~an~~r~ai-~~~~~.~~~;;-~~~_e._!!li~[Q~ml~rno.s~d';tQ~mo~~ad~ f;;~~cr~~;9Clfll$l nos?
Candidas otros.
OBJETIVOS
11
Manual de Mlcroblologfa Olga Inu Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa
• Estufa a 300C
• Tapar adecuadamente. (Figuras 1.2.,1.3). '
• Mechero
fl,
• Tubos con soluci6n salina estanl.
'PROCEDIMIENTO
i
I
I
!
MICROBIOTA DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO
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F
MicroorganisnlOS del Aire:
• Destapar I,Ina caja de petri con Agar Nutritivo en cualquier lugar del I
I
I'
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laboratorio. I
i:
• Oejarla expuesta por unos 15 minutos. ' Oespues de este periodo, ' I,
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Microbiol r0'O
• Aplicar el escobill6n sabre un extrema del medio de cultiva en la caja de j!
siguientej
petri. l ~9-x .. 1r{"\)
• Hacer estrias en tada la superficie, sin romper el medici de cultivo. "
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rr2~ ~c..""~
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• Sin la';,
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Olga Inms Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Inms Montoya Campuzano
il/. . ..
a esteril. .
• Sin lavarse las manos, colocar los dedos sobre el Agar Nutritivo de una
\
13
Manual de Mlcroblologla
Manual de MlcrobiOiogla' Olga Ines Montoya Campuzano
Microbiota de la Piel. ~
• Humedecer el escobill6n en soluci6n salina esteri!.
• Frotar una pequeria zona de la parte interior del brazo 0 de la cara.
• Aplicar sobre el medio de cultivo, formando estria.
• Tapar adecuadamente la caja de Petri,(Figura 1.5).
14
Manual de M/croblologia Olga InOs Montoya Campuzano
OIgalnes Montoya Campuzano
birculos en su superficie.
I
Microbiota de las Mucosas.
~ agua del grifo, sin usar jab6n
• Introducir un escobill6n humedecido en soluci6n salina esteril en las fosas
~e el Agar" de otra caja de petri y realice la acci6n
nasales 0 en la cavidad bucal.
\r
cara. • Rotular adecuadamente con la informaci6n necesaria en la base de la caja
de petri (parte extema),.
• Incubar en la estufa a 300C durante 24 a 48 horas.
• Colocar invertida la caja de petri.
Actividad
15
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla
OB_Ic.."IU-ft~ v~-
.,
. .
INTRODUCCI6N
ccJlo r:.
Con el fin de aumentar el contraste y facilitar la observaci6n de las muestras '~')Y0
de campo claro, se pueden utilizar colorantes. Los colorantes son
compuestos organicos que presentan afinidad por determinadas estructuras,
la cual esta basada en la carga positiva y negativa presente en el. Todo ~- . . -
colorante, se caracteriza por presentar un grupo crom6foro que tiene como
funci6n teriir la estructura y un grupa auxocromo, el cual participa de la
reacci6n, para que se de la tinci6n.
16
Olga Inis Montoya Campuzano Manual de M/crab/alogla Olga Inis Montoya Campuzano
! pRACTICA2
I " de Metileno.
;ERVACI6N DE BACTERIAS
,
-----,.,.,.
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,
OBJETIVOS
,!~Ii2.-
_rr
f Diferenciar una preparaci6n en fresco de una coloreada.
\r determinadas estructuras,
Apreciar la acci6n de los colorantes, de acuerdo con el caracter quimico de
f______
\ crom6foro que liene como
mo, el cual participa de la
MATERIALES
• Portaobjetos - cubreobjeto
icos), ani6nicos (acidos);
. tl,
• Cultivos bacterianos de cocos y bacilos, de no mas de 48 horas.
m6foro. Los colorantes
• Mechero
. , \e un campo electrico se
• Frasco lavador
,rnbina fuertemente con
\~o los acidos nucleicos y • Puente de coloraci6n
r .
. .tegativamente, por 10
•
•
Gasa.
Microscopio.
•.
'"FS de las estructuras Para la observaci6nal microscopio de bacterias vivas ylo muertas, se utilizan"
~e el medio donde se dos metodos:
/
.(~
17
Manual ete Mlcroblologfa Olga InesMOI1toya Campuzano , Manual de Microblologfa
PREPARACI6N COLOREADA
• Montaje en Hlimedo .
• Preparaci6n Coloreada Las bacterias sin c%rear tienen e/ mismo indie
10 tanto, se observan transparentes al mierc
~---~~-~.~-~~-~-.~~.
MONTAJE EN HUMEDO.
~'
Este metodo se utiliza para la observacion de la forma y movilidad de las
e, 1 ccJlo r:
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bacterias vivas, Ej: coco, bacilo, espirilo.
18
Olga Ines MOntoya Campuzano , Manual de M/croblologla Olga Ines Montoya Campuzano
Las bacterias sin colorear tienen el mismo indice de refraccion de la luz, por
10 tanto, se observan transparentes al microscopio. Sin embargo, las
preparaciones coloreadas permiten observar claramente sus form as ,
~sa y f1amear.
\1 ponerse aI rojo.
. Los pasos a seguir en una preparacion coloreada, Figura 2.1 :
19
Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa
1. ESTERIlllAo6M
DELASA
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• Exten" CJ~tl-~
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5. FLJAQON DE
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LA MUESTRA
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DIUlE
, ~STRA
I ( NOTA: La muestra no se fija con la llama, ni se lava el exceso de colorante.
\ AI observar, se debe bajar el condensador para reducir la intensidad de la
!
luz.
Actividades
. I
I
observados.
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\O~N ,. 2J
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Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia
MATERIALES
PRACTICA3 • Cultivos jovenes de bacterias Gram Positivas
COLORACION DE GRAM • Mechero Bunsen
• Raectivos: Lugol y alcohol acetona
INTRODUCCION
• COlor,n~,tes:
cris.!~leta y Safranina "
• porta1ti -'-~
Las tinci~nes _diferanciales se caracterizan porque no tilien '. de forma
hom()genea a todos los tipos de celula. La, tincion de Gram
.--... ,~-.---"
una de las
---- • puente
l
'I
' !112- <; C)
~
I ') CCJ (
I
•. Asa, Y,6'lS
mas importantes en microbiologia porque p(3rmite _!-!if~i~il~~~~~~ las bact~!i(3s
an _q~~~_ ~~l1~~~~~_Y C?!am Positivas, con relacion a la diferencia de la pared
• MicrosI ~--0 , 3'". ,-$,
celular. • PanuE
• Gasa: '! t X _ '(j
-.
r (-,
En esta coloracion los reactivos actuan de la siguiente manera: ~I cr~t§1 IIi
PROCE: :. .
C0,\olontc - vi.oleta c()~(~rant~.pl:i.r.:nartq Jiilen J~~bacterias y 1!_~_ol\J~i~~_~yg..c:!ada hace de
bfl.,cC0 mordi~f1te. 0 _fij~~.~r d~_c()l.or y las bacterias se observaran teliidas de un azul • preri
IJ
/1
del deoolorante. En consecuencia las Gram Negativas no
<-.------- .-.- ,.. -,-- --- . '
se observan }tlas
. • Cu;,
~.
• I; ,
., .Ad,' ~
La
--- safranina, colorante secundario
.
tendra la funcion de hacer el contraste__~1
---.----_._ ~-- -."'----,.-~ .--~---. • La'
teliir las bacterias Gram Negativas decoloradas en el paso anterior. I
• or
I
!
Act
OBJETIVO
l[ \f __ ~-:
J ".
Dife
, #i '
\
Diferenciar las bacterias Gram Positivas de las Gram Negativas, utilizando la Estf;
Gr8 f
tecnica de coloraci6n Gram.
22
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano
I f
I
I
I PRACTICA 3
:OLORACI6N DE GRAM
. \ MATERIALES
• Cultivos j6venes de bacterias Gram Positivas y Gram Negativas.
• Mechero Bunsen
• Raectivos: Lugol y alcohol acetona
• COlor,ntes: Cristal Violeta y Safranina
!
• Portadbjetos
,:~s se caracterizan porque no tirier) ; de forma
........ _-.. _.. _. - --" -.. -_ ...... - .... -.-.:..~---~~~
biologia
I porque
. . permite
.----.-.. . diferenciar a las bacterias
. -....
-.~-..;--.---.---.-
• Microscopio
rSiliva"-";..---- I cia de la pared
0· era: EI cristaI
\jada hace de
\---.~-~
PROCEDIMIENTO
-'
Actividades ,
. Diferenciar las bacterias Gram Positivas y de las Gram Negativas.
Establecer las diferencias entre una. coloracion simple y una coloracion de
andola
Gram. '
23
Manual de Microblo/ogla ~ Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologla
,~
INTRODUCCION
". ~~~~~--
La (
,I
1
6. Contrastar con ~ dl~<;
gen~
~~/~q-5
, slfranina durante
\ I
1 minuto porq~
La~J
\
~-.
"
- -
vagat,
~i~
~-~'~~~i, >.
~~Q~ ,
Para c '
\
calor co
OBJETI
1
Diferenci l~,
Distinguir
Figura 3. Coloraci6n de Gram' ,
24
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano
I ~-"--.' . pRACTICA4
l~.'~
....'
• o· \
COLORACION DE ESPORO BACTERIANO
1",. " . ..
_
INTRODUCCION
I
I
t
La endospora bacteriana es una estructura que caracteriza a algunos
~., '0 ~. !:~r~~ I generos bacterianos como Bacillus, Clostridium y Sporosarcinas. Importante
-
L7 ~P--2
~---'--
';- de
..
tamatio 19ual a menor que el de . la celula
...... --- - _....
--.-.--------~.~-~.~"~."----------.,--. .'
vegetativa
.
y-'-puede estar ubicada
~- .. _..... ....
~ "... .~.---- . " -
I 9SReCIaUcon
-'"
~-, . -'
dos colorantes basicos: Verde
,---.
cje Malaquita,
.,'" ." ,-'
la Safr~nina
..
y"-----.
el
---~'"-~-,,~~.--,"--~">--. ---~.'"- ,~-,-.-~ -.-~~-- '-~"
OBJETIVOS
I
Diferenciar en una bacteria esporulada el tamatio y la posicion del esporo.
Distinguir una bacteria esporulada de una no esporulada.
25
or
Manual de Microblologla Olga InfMi Montoya Campuzano Manual de Microb/ologia
MATERIALES
• Bano Maria
• Puente de coloracion - bandeja
• Colorantes: Verde de Malaquita y Safranina T A ccJlo r: [
e>',V-~
• Tubos con solucion salina esteril
L-J ,b0. '5 I-~/~
• Asa metalica ~O/?:>~$
• Frascolavador q 'Ci..~
3-.- ~ _,_.1)
• Panuelos desechables
~-
(\
PROCEDIMIENTO.
, I
Metoda de Schearffer~Fulton
• Preparar y fijar un frotis en la forma usual
• Cubrir con Verde de Malaquita /
• Flamear la muestra hasta qu~ salgan los primeros vaporesJ
• Repetir la operacion durante cinco minutos; /'
I
•I ,
• Procurar qua el Verde de Malaquita, no se seque, ni ebulla./
• Enfriar la preparaci6n durante/cinco .minutos/
• Lavar el exceso de colorante
• Agregar Safran ina durante un minuto /
• Lavar el exceso de colorante /
• Dejar secar la preparacion /
• Observar almicroscopio con los objativos de 40X - 100X. (Figura 4.1)
L 26
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobio/ogla Olga Ines Montoya Campuzano
i
'!§..y Bagllt!.s subtilis de 48 a 72 h.
bandeja ,.,.- ,
t
.
'. ...
alaquita y 'Safranina )
,
~ ,
, '" ~, .,.
)1a esteril' Figura 4.1. Forma de flamear la muestra.
I , ,
Metodo..g.oPW' Modificado'
• Inocular una muestraen O.Sml. de soluci6n salina esteril
~ ,
• AcUqi?nar O.S mJ. de colorante .~~d.ELM!3IC!.quit.a y lIevarlo al Bario de
Maria' a .100°C durante '1 0 minutos
metodos:
• Preparar y fijar un frotis en la forma usual. ,
\ '
.• Lavar.
el exceso de colorante(
" If,
r
./ .
I
I
• Observar al microscopio con los objetivos de 40X - 100X. (Figura 4.2)
Ii
[
(vJ I
- J .'
27
Manual de Microblologia Olga In&> Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia
Actividades pRACTICA5
~ Cual metodo es mas practico? COLORACI6N DE CAp!
Anotar las dificultades encontradas en la practica
Esquematizar 10 observado y hacer la diferenciacion entre: Una bacteria 'r~--~~=~~
no esporulada y un~ esporulada - Los tamalios y la posicion deJge~b~~i~j~t) INTRODUCCIO 1
:; C9it2-~
La capsula,
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Y16 Q 5
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presente en tC,
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compleja, seo. 0
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polisacarido, r:
Para su obse.
1 Dl..(', . •.
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tambien se 8.
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cultivarla e~
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Olga Inlls Montoya Campuzano, Manual de M/croblologla Olga Inlls Montoya Campuzano
pRACTICA5
I
ractiCO? COLORACION DE CApSULA
ncontradas en la practica
:ado y hacer la diferenciacion entre: Una bacteria
?orulada - Los tam alios y la posicion de,:esRorb;'~r'J INTRODUCCION
rt ~------
p/J U2X::.,lCl
_ _ _ __
~"'
,.....,..
C,')
--
Para su observacion se requiere de una tecnicaespecial como la de Antony;
-
tambien se puede visualizar con la coloracion negativa.
---- ............. ~--,--.---
, >,
OBJETIVOS
MATERIALES
• Mechero
, .
29
Manual de Microblologia . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologia
• Asa metalica
• Frascolavador PROCEDIMIENTO
• I
,• I
I
T A colo r:
• Safranina 0',1.2-<;.
• I L.J ,60.5 I;:,)/~
.PROCEDIMIENTO . ~O,?:>'i-S'
7, ',,:
• c,
• Preparar un frotis y dejarlo secar al aire. ~'-'- .. - - 3
(:~ ~-
• Agregar lentamente 'el GristalVioleta a temperatura de 34°C por cuatro' -:::---
__--c-~;I
--
'.
minutos 0 sumergir en una caja 0 frasco de coloracion par dos minutos.
, . .~ " , .. \. ,
(Figura 5.1.)
• Lavar la placa, sumergiendola en" una soluci6n de Sulfato de Cobre al
:Jc
20%.
,< , ,.
, '
30
Olga Ines Montoya Campuzano . Manual de Mlcrobiologia . Olga Ines Montoya Campuzano
PROCEDIMIENTO
• Colocar sobre la superficie de un portaobjetos limpio y desengrasado, una
. I
. . I
:.------ ------"
J.
. or cuatro !
minutos. \
breal
\
. ..
Figura 5.2. Pasos para una cOlor~ci6n
I
negativa
Actividades
!
Esquematizar 10 observado y hacer la diferenbiaci6n entre una bacteria
'I I
31
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya' Campuzano . Manual cJ.e Microblologia
Segun la
- . _ _ _ _ _ _ ----~- •• _ _
consistencia, se habla de medios Jfquidos (sin agar agar), ~ _ _ .. ~_, _ _ _ "_.~~_._~~ . . ., _. __ •• _ .. h'~ ....... _ _ _ , _ _ .~"". _ _ _ _ _ _ __
semiso/idos (0.5% p/v de agar agar) solidos (1.5% p/v de agar agar) .
.. -_._----- .-- ..-_ ...... -- .- .......
-.-\; ... --- ---' --. ------.------
,"J
estas bases se pueden preparar los otres tipos de medios por adicion de
----.---------.-----; - _ •••• ~ _ _ _ _ _ ~_ ,". _d_' _.,. _ _ _ .~ .. _ _ _•_ _ _- ._ _ •_ _ _ _ .... _ _ .~ ____________ ~~- _ _ _ • , - - _ _ _ _ ...
.32
Olga In(n; MontoYa Campuzano Manual de. Microblologfa Olga In(n; Montoya Campuzano
colorantes.
flie aporta!!.
e.~ natural;
~uestras de
_
/Los Medios de'Transporte, se utilizan para transportar frotis 0
microor~~~!§fu6;~~;~6~~~6~--~~rno
- - --------..,,- St;~t~~~~~~:-N;i;seria,-H~emophif~;
.. -"-' .. ,-. ..,-
... '-. ''''''''''-''' .. """----.'"'~ --.,~~.~-,,--- .. "~ -,~~--' . -.. .' -..-
,t_
.\
microorg~mp.§ ..
aga2 ' --"'-,---- .. ... ~
:r).
Las tecnicas
~--~-.,
de cultivo microbiano'
-----"" -- .. -.. ...- .
sirven "- para-----,-".-
aislar..
un tipo de '"------'~-----,,-~.--.- -,~" '-'-'-'- ---~. -------,~------
basicos,
\
microorgan!~mo_~~p~e:~~~~_~.~_.~_na fue~~~. ~~!~~~!!~~~~tir~~~~1 nu_~~~o d~
micro~rg~nis.r:T.lg_s.
.
-'---.~"-'
..:gue se encuentren en,.-... un material
-.,~' - .. ..... - .. dado'
-...•
(rumen, leche,
-,._--------'_._
'''- -"-,,""",,"'~"-'-'''~'~' -, ~~--- --'-~-,-.- -, -"'"~-~--~--"---~-, ~-~--.~-
agua,
. - -..... entre
..
otros),....... _---,-
incrementar el-" numero de.... poblaciones microbianas
--.~~'.-" ,.-"~.-'". . "" .....
0 .~' .~-~~.~.--~ ,"",~" --.'-.---'----~-'-
kcame,
, artir de
mantener un cultivo,en condiciones estables.
_ _ ._~ _ _..."'..,_:...- ... ~'~ ........ ""~~.'":-7,."""---,~ ... "...--'---~,""",o,-''''"'''''' " ... ~-'.-"'->"""' __ ,.".'""',_'_...~r_'~·~- ..
!
icion de OBJETIVOS
, rdo con
Inocular un microorganismo en' diferentes medios de cultivo y observar sus
caracterrsticas d~ crecimiento.
33
Manual de Microbiologia . .Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia'
Practicar los diferentes metod os de siembra de cultivo. • Flamear nuevamente los bordes de los tubas, C
,.
tapas a los mismos.
MATERIALES • Flamear el asa.
• Cepas puras de bacterias Gram positivas y Gram negativas • Incubar a temperatura de 37°C por 24 a 48 hare
• Mechero
,
...
• Asas y agujas de inoculacion
-=-r A colo r
• Incubadora . C)',tl-~
--. Cinta de enmascarar l-j ,60.5 I:: '5/\
• Espatula de Digrasky
~O, '.j-:t-S·
PROCEDIMIENTO . c
·,r (.(',· .
_----."'7".:-......·-7/ ')' --- ---'-
Para aislar y cultivar un microorganismo de acuerdo a la procedencia del
, '\ < ' " •
i
la llama. . /\ antel
,
• Flamear los bordes de ambos tubos e introducir el asa dentro del tubo con
. ~
• HacE I':
. ~
34
...
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.Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia' ~\ Olga Ines Montoya Campuzano
I.
netodos·de siembra de cultivo .. • Flamear nueva mente los bordes de los tubos, colocandoles los tapones 0
tapas a los mismos.
• Flamear el asa.
~rias'Gram positivas y Gram negativas • Incubar a temperatura de 37°C por 24 a 48 horas. (Figura 6.1)
iculor~
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Figura 6.1. Incubaci6n en caldo
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. . . "..
.a, medio Siembra de Cultivoen Tubo con Agar Inclinado
Para est~ sJembra hay que ~er en cuenta los mismos easo~ que s~ ~gu~n
~,?;di~re:en la man~i~_~~Ciliza la siem~r§.
ultivo Y • Tomar el tubo de ensayo esteril con el agar inclinado de manera que el
bisel 0 pico de flauta quede al frente destapandose del modo ya explicado
I anteriormente.
I
: • .Hacer un movimiento cuidadoso con el asa.
! • Inocul~r erl zigz~g enla superficie del medio de cultivo.
• Flamear la boca del tubo y taparlo.
'? )<d~..; "/ • Incubar a temperatura de 37°C p~r 24 a 48 horas (Figura 6.2)
"" ~ . 'J -1 K 5
~v \ ~ ~ ~ ~ \' J\l)
35
Manual de Microblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de. Microblologfa
Siembra
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par ---
Picadurll
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semisolido,
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._.,~,
se .,._-
usa "_~_,, .•
para .qeterrlJll]ar
_.~,_, ___ -- - .. _"__ '"' "'~--_"_A
el___,....___
comportamiento' de
~._ ._........ ___ ~_~.~ __ ~.--~.~_,~-_
los
,
microorganismos en ~reselJc~a d~ oxigeno, para observar su crecimiento y
~_ ••• ______ ~_*_.".' __ ._.......... - . , .__ ____ r
~ - - ____ .. -,,- ," •• ~- _ _ _ "'_ ' ' ' - __. _ ' __ .M ___ ._~_~_ . . .- - '_ _' _
ti,emp_o.
36
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de,Microbioiogia , Olga lties Montoya Campuzano
\()~v).
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Manual de M/croblologia ;." Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de M/croblologia Cl
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EI Metodo Frances es el mas utilizado en Microbiologia, porque favorece el ____' --"...-,-"",/ I
r. Flamear el asa, enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo esteril;
tomar la nluestra del material que utilizara.(Figura 6.5)
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f ~).slS '
r· ~~~V~~j
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, . "
38
Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano
• Extender la muestra en forma continua, hasta una cuarta parte del medio
• Flamear de nuevo.
• Enfriar el asa y proceder a hacer 4 0 5 estrias formando un angulo recto
desde donde se hizo la primera siembra, hacer otras 3 0 4 estrias,
siempre formando angulo recto con el origen.
• Repetir esta operacion hasta formar una especie de C.
• Rotular correctamente la caja de petri.
• Incubar a temperatura de 37°C durante 24-48 horas. (Figura 6.6)
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Manual de M/croblologia Olga
Manual de Microblologia .' Olga Ines Montoya Campuzano
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Olga Ines Montoya Campuzano > Manual de Microbiologia , Olga Ines Montoya Campuzano
r:
de microorganismos en una muestra dada .
...-----.~-"---,-.~.------"".,--~--,,----"~-""-------..-->
s • Tomar la muestra.
.• Colocar el in6culo en uno de los.extremos de la caja de petri.
• Extender la muestra de un extremo a otro, en zigzag hasta una tercera
parte del area de la caja.
• Flamear de nuevo, enfriar el asa y proceder a hacer zigzag, d~1 extrema
izquierdo partiendo 'del inoculo inicial.
ydt . I
41
Manual de Mlcroblologia' . Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia
r:-
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2-cP c..
23)0
2 S'C
9 Qg,2-'X
. Figura
"'l
(a) (b)
4.3 Siej'
6 .~--
~~~
Figura 6.S. (a) Siembra metodo radial (b) desarrollo de su colonia 1~'O-, ~-qOO'
• Flamear .el asa y enfriarla en uno de los bordes del medio de cultivo.
--~-
sObrl
• Este
-03
--rob)er
-210 -j .
A-LJ_
C
por I
• Tomar la muestra.
• Enfrf
~ <J f) .l J f4 I (t,.<AJ,e.)
• Proceder a sembrar como 10 indica la figura 6.9
HIe-lAC! vt I-\- / f0;D
: ~:~
• Fla
- - - - - f -----_
b/3+S'
0112S
L// s
6)/ , 2-~--
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Olga Intis Montoya Campuzano Manual de Microbiologia Olga Intis Montoya Camplizano
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(a) (b)
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Manual de Microblologia " Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblolog/a o
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20"':)(
23-'0
2 s' C
Fi
. IOf) fX-_ ~
SUMERGIR LA VARILLA
EHAlCO,HOl EXTENDER SOBRE
LAPLACA Observaci6n d
--
FLAMEAR LA VARILLA
Una colonia es
Figura 6.10. Extendido de la muestra metodo por diseminaci6n.
cel~a..9~_h~
Siembra en Profundidad
Las diversas E
forma y color
caracteristicas
I
.Ci~sificaci6nj
Esta. tecnica, se utiliza para aisl?lr microorganismos procedentes de una
~ • ~~ _ _ _ _ O_ _ _ " ' _ ' _ ' _ _ ' _ _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _ - - - ' - _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _ _ _ ' _ _ _ _
• - _ _ ~_. ~,
- - - - - --j
En ,esta tecnica, primero se adiciona la muestra dentro de la caja de petri c!~~!d.0 ~I~~~ .
·.," ~~~:~
r
Tomar 1 ml de la muestra,previamente preparada.
unas de otl
Adicionar a una caja de petri vacla, debidamentemarcada
• Mezclar 20 ml del medio de cultivo fundido. (SQoC)
Forma: aI
• Hacer movimientos circulares con la direccion de las manec!"as ,del reloj,
Tamail0=l
devolver el movimiento al contra rio. Hasta que el medio solidifique
-, " " t '.: " " " " "
unas fra~
• Incubar con las condiciones indicadas. (Figura 6.11)
a 10 m~
colonias
44
Ito", '.
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microb/ologia Olga Ines Montoya Campuzano
;
EmNDER SOBRE
LAPlACA Observaci6n de las Colonias Microbianas
Una colonia es una__.'_poblacion
., ..
de celulas microbianas, originada por una
.._" __.___ _._._~_~.~~.~",n ._,""F~ __ ~_' ____··_ , ""'~ __'""-""'-_ _ _ _ ~ _ _ _ _ _- - _
Por 10 general colonias (ormadas al interior del agar toman la forma lenticular,
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _••,.. _.,_~ _ _ .. _ _ . . _._~ ______,.,_ _ • _ ~~_. ._ • _ _ ._"...._ _ _ ,~'""_:_ _ ~_ _ ' " : _.... _ _ w' _ _ _ _ _ _ • _ _ ~ ••• ~~ _ _ .... _ _ --""""---~"
debido a la presion que la colonia sufre dentro del medio, p~r 10 tanto, no se
--,,"._"" ~",","~--..---.....:.,,,.-,---,-.-------,,,.-----.-.,.~-..,- "'~'''''''~--''''''''-'':'---'--.''''-'''''"-~~-''-'''"'-''-----'--
tiene
"',-
en cuenta para su evaluacion.__ .
. '-·-" ..- - . - - . ·_ _ _ _ _ _ __
.-'~"- ~:'n,. "~.,~~.
CARACTERlZACI6N DE LA COLONIA
Las caracterlsticas que se evaluan en las colonias que crecen separadas
-~-~-- .. - . - - - . - - .
45
Manual de Microbiologia '. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa
~--:~'''''"~
f ~
i:
Cromogenesis Pigmentaci6n: Una de las caracterlsticas mas notables :i·.
- ..--~--.--.---
0
.
,
,
'.
j:j~C!..rDJ.n_e!l~.
, .
C~l1s~tencia: Cremosa,
. . . . . ..___. _... ___'_ -viscosa,
-~.--:--_"'~ ~ .-' -_._, _granulada.
__._4_.'_'__ __ "_.
~_·_. _~_
0112~
1-11 S
())/ ,2-S
46 ..
, Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologfa , ' , Olga Ines Montoya Campuzano
.
'j
"l~_'->''';'
'
, minar si el color
\.
I
I
~_!-_ ~~ ~ .""'""""--~ ____ .- r_ ~ • _____ ~_w .,_~_ _,_~, ~
• 47
Actividades
Observar las caracteristicas de crecimiento en ca
.
~""~,! ...~'~\
(a) (b)
6.13~·· Desarrollo de una colonia en un medio semis6lido
(a)inm6vil,(b)m6vil
.r... .1
lii\ %~\
I ~,' "it ,
48
Olga Ines Montoya 'Campuzano Manual de Mlcroblo/ogia Olga Ines Montoya Campuzano'
Actividades
siembra.
, '
Cual metodo de siembra en caja de petri considera mejor y por que?
,q1-1 b~lJ-~~~~ \ .
recimiento en un medio
ESPARCIDO
,Iio s6lido
49
..
. ... ,,~.,,~,"1>
pRACTICA 7
Se puede considerar este metodo indirect~deb
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
celulas, puede dar origen\a una
... ') -._- _
"'.-;'. .,' ~ "",,,"~, .....-. _
COlo~j~:'~po'r
...--_.
,)., .... ,," ~--- .,."" .-~
'10 ~
- ------ - ~-
,
_ ,-,'
, '. ~
INTRODUCCl6N .'
~
2cP(
EI numero de microorganismos en una muestra (agua, suelo, aire, alimento entre 2 3)0
otros), es un parametro importante porque permite evaluar la calidad microbiana
2S'C
de esta. Los metodos mas emp\eados son: Numero Mas Probable (N.M.P.),
Recuento en Placa, turbidimetria, Conteo Directo al microscopio, que tiene la
desventaja que incluye celulas muertas y vivas a no ser que se utilice una tincion
. '
especial.
RECUENTO EN PLACA
0112s.
LJ/ S
-Q).II2-~-
50
Olga Ines Montoya Campuzano ,
Manual de MlcTobloJogla '-,;, ;\', Olga lnes MOlltoya C,mpuzano
"'\'<'y).J
rJ.»~
, 't_'
PRACTICA 7
UENTO DE MICROORGANISMOS Se puede considerar este metodo I indirecl9 debldo a que una agrupaci6n de
\ , ',' " , ' " ';',' ,,' - - >
co~_adas p,uecje ser rT1E!not qU~1 numero real de celulas Indivlduales presentes 0
algunas b_acleri~S no son' capaCfi-~de ror~a, r colonias visibles bajo las condiciones
,
r'-' , empleadas en el procedlm lerno ormal debldo a danos fiSjOIOglco~ ocaslonados
~' alimento entre
8\ ~ ,dad microbiana por condiciones ambientales '~~Lec"u~dasl po~a disponibllldad d,e nutrlentes, 0
.. /
PROCEDIMIENTO
• A cada dos estudiantes se les entregaran cuatro lubos de ensayo, cada unQ
a celula
, \ '
• Homogeneizar la mueslra mez,clandola cUidadosamente, invirtiendo varias
ruestra
veces el recipiente q~e la contenga, a fin de tener uniformidad.
rner un
• Hacer diluciones 10 1- 10 2 -10 3 dependie ndo del origen de la mueslra a
analizar.
• Tomar con una pipela esteril, 1 ml. de la mueslra y pasar a/ primer tubo (Tubo
\ 51
Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla
~'o/t~etodo en Profundidad
• Llevar por separado 1 ml. de cada diluci6n a la caja de petri
• Verter 20 ml. de agar Cuenta Germenes 0 Nutritivo Temperado a 45°C.
• Mezclar, con 4 movimientos circulares suaves en la direcci6n de las agujas
del reloj, y Luegoen el sentido contrario para aislar bacterias presentes en
la muestra.
• Oejar enfriar el Agar hasta que solidifique
• Incubar las cajas invertidas a 37°C durante24-48 horas.
Metodo en Superficie
\ )-t)?Y'-C
O,OOIOcYl It OJCOlcO~
Inocular en las cajas de petri sobre la superficie del Agar as!:
4=b -I . Cc-~
circulares, hasta que se agote la muestra.
1
• Incubar las cajas, invertidas a 37°C durante24-48 horas. aprecia '/
Se consi
l
3 .2
·---robler
10
A-L1. '
de estud
Nota: La espatula se esteriliza pasando por alcohol absoluto y f1ameandola. Se
~ 0f'1'l j /4 I ( "",-cJ ,z)
enfrra y se utiliza
EsteJ 01c-~c<v( 4 / /?~C>(~
numerol - - - - f ____
Probabl b/3+S'
52
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de "'Icrob/alogia Olga Ines Montoya Campuzano
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Manual de Mlcroblo/ogfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblo/ogia
I
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de cultivo diferencial como es el caldo Eijkman que contiene Lactosa y Triptofano, I'
incubados a una temperatura de 44.5 °C; los Coliformes Totales aunque contien,
! ! bI3i-~
• Agitar sl LII~
muestrl '6J, ,2.-S"
if
54
I ---
t ~,~-
Ol"a In~ Montoya Campuzano Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano
~ 4 «) ~) ,a en cuatro fases
• Cajas de petri con Agar EMB
-------- .
. I ~~
• Muestra analizar
f),1 ('0/
~ /'f'\C?J
1.. "\
),
~, inoculandolos
Procedimiento
Prueba Presuntiva: Se hace con nueve (9) tubos con Caldo Lactosado, mas
'>:! \ ',~ .. nriquecimiento.
campan~ de Durham introducida en el tubo en forma invertida. dispuestos asi:
-1 ')<:.-- 1,002hX I Cl les, se inoculan
~electivo Caldo • 3 tLibos con 10 ml. con Caldo Lactosado de doble concentraci6n.
,OO\OO'l- _ qq9-)4)~\diferencia las • 6 tubos con 9 ml. con Cal do Lactosado de la preparaci6n inicial
J:..- ~1:. -
\ ,001..'0'
.' IY\"'"
,
io de cultivo • Pr~parar el homogeneizado de la muestra.
L('V'I- ct -v\ .,1g en un medlo • Depositar en cada uno de los tubos que contiene 10 ml. del medio de cultivo.
. J YTriptofano, • Tomar 3 ml. de la muestra y depositar de a 1 ml. en cada uno de los tubos que
es aunque contiene9 ml. del medio de cultivo..
• Tomar 0.3 ml de la muestra e inocular de a 0.1 ml. a cada uno de los tubos
restantes, con 9 mi. del medio de cultivo
• Agitar suavemente los tubos para asegurar una buena homogeneizacion de la
muestra con el.medio de cultivo.
. 06t 55
r
.Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano 'Manual de Microbiologfa
• Incubar a37 °C. durante 24 - 48 horas. • Observar la formacion de colonias tfpicas de coli
• Leer a las 24 horas, los tubas cuidadosamente. briIJante.
• Reportar como positivo cada tuba que presente gas en la Campana de Durham
. ·'Testder
• Reincubar par otras 24 horas si no hay produccion de gas.
• Examinar de nuevo para observar presencia de gas. • Tom
• Remitir directamente a la prueba confirmativa todo tuba positivo. •. Inoc
• Descartar los tubas, si despues de las 48 horas siguen siendo negativos.. • Incu'
'. Adic
--
Prueba ~onfirmativa: Se realiza esta prueba a todos los tubes positivos en la, • Obsj
prueba presuntiva. • Seo
• Tomar un ml. de cada uno de los tubas positivos can Cal~o Lactosado, par
separado inocular en cada uno de los respectivos tubas con 9 ml. de Brilla', EINMR,
con Ca l\ ) - ,) T '/" l~
• Incubar a 37 °e. durante 24 - 48 horas.
O,OC10o'l. '"X. O/CX::)lCO~
• Observar en los tubas can Caldo Brilla la produccion de gas en la campana de
Durham.
• Registrar como tubas positivos, los que presenten gas en la campana de
Durham. Can estos tubas positivos se busca el numero de Coliformes Totales
I
en la tabla del NMP.
I[ .
Prueba Completa: Se realiza esta prueba a todos los tubas que dieron positivos I
en la prueba completa.
• Tomar una caja de petri con Agar EMB y divida la base de la caja en 5 a6 I
partes, can lapiz vidriograff, segun los tubas positivos que hayan dado, i
• Marcar en cada parte con el tuba respectivo,
b!3-1-~
s
f~
1-//
'6)/ ,2-.:::::,-
56
Olga Ines Montoya Campuzano "Manual de Microbiologla Olga Ines Montoya campuzano
~e 24 - 48 horas. • ·Observar la formaci6n de colonias tipicas de coliformes, que son de color verde
!
II tubos
. cuidadosamente.
... . brillante.
cada tubo que presente gas en la Gampana de Durham
[horas si ~o hay produccion de gas. Test de Mackenzy
~ observar presencia de gas. • Tomar con un asa la colonia representativa de lacaja de petri con Agar EMB.
la prueba confirmativa todo tubo positivo. .' Inocular en un tubo con Galdo Eijkman.
~espues de las 48 horas siguen siendo negativos .. • Incubar a 44.5 °G. durante 24-48 horas.
·uothl,g..cO.....,..-....-.',·.,. . ... I .• ' Observar a cada tube con Galdo Eijkman producci6n de gas.
j
,• Adicionar 5, gotas de Reactivo de Kovac's
:2- U - lenla
i
• , Observar aquellos tubos con produccion de gas y anillo rojo (indol po~itivo)
C\q'} ~ 'Qw,2:"T 1 • . Se confirma que en la muestra hay E. coli.
! por
7-, -_ qq ~, 4 ~~lIa EI NMP de Enterococos se realiza en dos fases: en la primera se utilizan 9 tubos
qq ~, b? k~ Ire> ~l lana de 3 tubos con 10 ml. de Galdo Glucosa Azida de doble concentraci6n.
57
r
Manual de M/crablalogfa : Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Itt/croblalogfa
I .
\.
'\
\.
20
-\-
'-'. .J1
~ - ' 4 '-
Mtj .
l~
000'00'). "'X- o,CO\OO'b
\ , -1
L --r--; N 'S
\ QIJ (A-~ ---:'6":" "_OOO\OO'l..
- ~
\ 1.'1'\0 A"
~ J:..":!
\0-;.. J;-
\ . f)
\ .-i,. ...)':.. ~ \1001
Posltivo Positivo
r Yd9· 2 10 j 0~J~
Figura 7.3. Resultados en la prueba NMP • ---lOb\e)' A~c J
'-...\unv.) 11\ c~ 1 (
Metodo Rapido
•
))A IC<\A~ \ I,/), J P00 e.S
t.. v
I
58
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya' Campuzano
[1' Smi de 360. nm; esta enzima solo esta presente en la Ecoli. EI medio de cultivo
producir indol.
Materiales
• 9 Tubos con 10 ml. de Caldo LMX
• Reactivo de Kovac's
• Lampara de Luz Ultravioleta 360 nm
'\ • Pipetas .1. ml.
• Papel desechable
• Cinta de enmascar
• Mechero
D. 1 _ -=..qq9-ILJ}~ • Muestra analizar.
,J -1:. 'Y\"".:.
I, OO'tb ~ I 0
PROCEDIMIENTO
6~J -vI. 0 ~o\ • Preparar las diluciones 101 _102 - 103 de la muestra a analizar.
• Pipetear1ml de la ·diluci6n 101, inocular a los tres primeros tubos con Galdo
f'1 «) .
ne una alta
LMX.
i f~e>{c.s
• Pipetear 1 ml de la diluci6n 102 , inocular en 3 tubos que contienen el Galdo
I . . I r
\to rapido de
Positivas.
Fluorocult LMX.
• Pipetear 1mlde Is diluci6n 103 , inocular en los 3 tubos restantescon el Galdo
~'''O) Cc.I"\
y E coli!
Fluorocult LMX.
I o~t o\\~ .
I _~ ~r~1 -1 c9--2-B 59
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia '
[J
Tubos de 'color verde - azul ,presencia de f1uorescencia y anillo de color rojo.
I
I
!
0
____ f ----
-~
Anotar el Numero Mas Probable de coliformes fecales y'E. coli por diluci6n.
b/3i-S'
Buscar en la tabla del NMP anotar el resultado correspondiente.
0112-S;
L/I S
I~ o 6J1 r2..S
60
t
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia • Olga Ines Montoya Campuzano
) 10veces., '
i Tabla 1. Numero Mas Probable.
124 horas. ,',
.
,NMP en 100 ml Bajo Alto
/' 0-0-0 <3 0 0
~n~a lampars d~LUzu'tr~'T 111 0 -0 -1 <3 0.5 9
'/1 0-1-0 3 0.5 13
II 0-2-0 3 0.5 13
~3~
I
.. , I
PI 1-0-0 4 0.5 20 I
Iz.D - \uperfiCie de la capa /I' 1-0-1
1-1-0
7
7
1
1
21
23
I
1-1-1 11 - 3 36
\ 1-2-0 11 3 36
x _q q q.., Lf CO ~ .) ,
l.,.,\ ~.
2-0-0 9' 1
. 36
~- \ 2-0-1 14 3 37
,,
qq ~I b?-.I<:.~,Ir(> ~ n
\, \ de color rojo.
. 2-1-0 15 ·3 44
2-1-1 20 7 89
2-2-0 21 4 47
'. anismos coliformes ! 2-2-1 28 10 150
I
\ 2-3-0 28 10 150
3-0-0 23 4 120
.. 3-0-1 39 7 130
3-0-2 64 15 380
3-1-0 43 7 210
3-1-1 75 14 230
3-1-2 120 30 380
3-2-0 93 15 380
3-2-1 150 30 440
3-2-2 210 35 470
" 3-3-0 240 36 1300
de, fluorescencia
3-3-1 460 71 2400
3-3;.2 1100 150 4800
. \
3-3-3 >2400 150 ,4800
iluci6n.
,I----f
61
Manual de M/croblolog/a Olga Ines I'tfontoya Campuzano
. Manual de MicrobioiogJa
Cajas de petri
pRACTICA 8
INTRODUCCI6N
·r
• I -r
:Lc)':> L
EI estudio. de las caracteristicas bioquimicas de los microorganismos • 23 J0 " ""'X",
( l /'
constituye un aspecto importante para la clasificacion microbiana. ~
:2 S'C
----
fundamento radica en la dotaci6n enzimatica bacteriana, visualizadaa traves
-------_.-----_ ......
I
- '"
revel adores. cor
, • Per6xido de Hidr6geno .
racteristicas ~io<!~lcroorganismos • Plasma de conejo
I'im~~
. J>c..' . . tfObiana. §!:!.
~.A
, .
) ; 3 'zada a traves Fermentaci6n'de Carbohidratos
~ r-~
con agentes Los diferentes Grupos de· microorganismos aer6bicos y anaerobios varian
la , isP~~~Q .. g~_ el, que difiere s610 en la agrupaci6n de los atomos deH y de los
grupos OH alrededor de los atomos de C:
\,
63
r 11"'10'>
Manual de M/croblologfa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologfa
: ~b~1
La prueba de Rojo de Metilo, utiliza como indicador de pH el rojo de metilo,
----.--~-.-- . ---.-.-,------ ...~--- ------- -. -. ----~ .. ~-.....,.. -- ~......~----,---
~L9ual
- tiene la propiedad de det~rminar .. - - - la concentracion de tlidrogeniones - ~---.-----.
Agarh
Los organismos que producen estos acidos en concentraciones altas de Estos
---------------.--- -. -- ~--.,-----.------~---~~.""--
" , ----
hidrogeniones de manera estable cuando son incubados bajo condiciones del rni
optimas d~ cultivo a 37°C/S dras y alhacer!~J~ajan ,~~H h~sta}4AJ son RojQ concen
~~4
eroducen estos acidos, pero tinalmente s~ obtiene una concentracion menor presen
~-,-----.------ .. - - - ' -----~-~" "'~~ .', ."--,-" - - _....- ' : ' " :
-.- ---- "--"y aumenta la concentracion· C02. Esta prueba se detecta a las
hidrogeniones -----,-,-------~~.-,-.---~'"-.--------- . ")
------ ------------
t
Interprej' bI3:r~
KlK: N . 0112~
a
1-// S
6)'1 I z,~-
64 I
.. I
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/croblologia Olga Ines Montoya Campuzano
,Proskauer.(VP/RM) 1, . ,
PROCEDIMIENTO
l~ali~~ilJ~r:!!~~e!l__~~~'!1~_~~dio de_~~ltivCLque
-hac~~; basado en
en que 10.. _----.
:. --_._--
)
la-pr~se~~i;d~--'as • Tomar 5 ml. de cultivo microbiano.
f~=yJlli?2=-~~-\~~~:' ~~~:~!~
•
•
Observar a los 2 minutos la aparici6n de un color rojo.
Incubar nuevamente el medio de cultivo a 37 C 1120 horas.
.~, / / /
Agar hierrro
Estos
--.. medios.-------_.----_.
de cultivo son. -diferenciales.
------- permiten comprobar la capacidad
._----=--
gel, microorganismo .Rara desdoblar un carbohidratoespecffico en la
. medios se diferencian
.
entre sf porque en el TSI estan Rresente los tres , ~~--~--.------'-.- ---.~'---
.
'
'..
l
Igualmente/con esta prueba es posible determinar produccion de acidO
_sulfidri~ cuando el microorganismo desdobla el tiosulfato de sodio para
coloraci6n negra. ..
r
t
Interpretacion de resultados.
KlK: No hay desdoblamiento de ningun carbohidrato, no hay producci6n de
acido sulffdrico.
65
. Manual de Mlcrobiologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologla
KiA:" Desdoblamiento de glucosa pero no de lactosa, no hay producci6n de Utiliz,aci6n del Citrato de Sodio
Gas.
KIA+: Desdoblamie~to de glucosa pero no de ladosa y producci6n de gas.
AlA: Desdoblamiento de glucosa y lactosa.
H2S: Producci6n de acido sulffdrico.
\ .
Nota: Todas las Enterobacterias desdoblan la Glucosa, s610 ias del grupo
{ Coliforme desdoblan glucosa y lactosa
qQ8,.2-'X
.
presencia del sustrato Iisina para poder sintetizarse, pero el medio debe estar
-_._ _
~"--~- .. - - - - - , . .
en cadaverina
......
(amina)
------
--.--~'---,- ---~--~-----------~--
.....
-'7-";"'-''''--''-
,
~.- ------~-.---
-~.-.
sobre ....
- ~ -<--w"_ __
el grupo carboxilo,
+ C02. Estos productosalcali~!zan
-,-_. el
---~ ..... --~,-
.
t-'
__ __
.
._---
,--~.-.-
m~dio:
Para esta prueba, se utiliza tubos con medio de cultivo Lisina - Hierro con
\ .
Los tubos positivos deben dar KlK + H2S: descarboxil6 la lisina y produjo
- .
acido sulfidrico, 0 KlK.
..
66
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblolog/a ' Olga Ines Montoya Campuzano
\18S del grupo EI Citrato de Simon's es un medio de color verde, cuyo il1dicador de pH es el i}
I
,azul de bromotimol que permite evaluar, cuando la bacteria utiliza el citrato,
qq1 'Y:.. 'qCf6,Z'i
tornandose el medio de color azul intenso. .
q~be estar
La prueba es positiva c!,Jando se observa en el tubo de ensayo el fondo verdei
'l\ '--'_ 0
y enel bisel azulPrusia, solamente cuando el microorganismo crece;- J
aq1-1 ~/)- Y-JJlrP~~~. ~~,
0
\ calinizan
..._-_.,-el
J'!:QcJucci6nde Indol- Acido Sulfurico y Movilidad . '>'U,\
EI Agar §IM, proporciona fuentes necesaria para determinarla caeacid.?ld,de_ •
oduce en un microo~g~ismo~ear~A.p!9du9lr: !~~~,~)~~cido Sulfhfdrico. Adicionalmente,
permite ~~l!:Jar si la baCteria es m6vil 0 ~.
67
'Manual de MlcrobioiogJa Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobioiogJa
, metales;:Resadq~ como Hi~rro, Nrquel, .Cobalto, Bismuto o"Plomo,gue al La gelatina es una proteina obtenidapor la hidrc
reaccionar con este forman un precipitado negro. en los tendones y cartilagos. Cuando ·se dii
~--~~-. ·t---:.._-,·_··· utilizada por aquellos microorganismos"que pOi
, J-/lS'
Movilidad: se observa por la aparici6n de un velo blanco difuso alrededor de gelatinasa dando lugar a su licuefaccion.
.. -, - - .--~- -' ---''''i'-~''----- -'-~'~-~------'--- '--' ,.~
~~~-
la linea de inoculaci6n. Cuando la bacteria es productora de--------..!.----~-~-.--
--.-~"--,------"
la lectura ~~J~_rTl~~!li~ad,
H2 S se dificulta
por 10' tanto, se recomienda sembrar en un agar
\! ..... ~~S A
--'-'-_. ' , -"1
blando..
_ "\i, I l4 b 0- 5
I '1 1'\ ,(f!"
\' ~O, :;-r.;;;>' ,euJ.
Reducci6n de los Nitratos Cp C\ --if
\ 4~:- -~i ,. --:.'1
; I _
',La reducci6n de nitratos incluye a todos los procesos en los que el NitratO..§!3 ..
'-----.------ "
nutrientes y
-,------ productos de ...desecho,
- .. ,--".:: -aumentando
.... ........
las ---.-
------..,~-.-----"~
actividadas
......
reductoras --'-'- " ~--~---.- , ~-,--.......:.---. -~,--.-~
,
·Griess se forma un anillo rojo en la superficie del.medio.
~ _ ,_ ,~. _____ ~" ........ '_~_""'"' __ ~ ... _ , . ., . _ ...' - . , _ _ _ _ _ ,
., _ _ _ _ _, v • ".L___ ."_._ _'___ ~_A____
Descomposici6n de la Urea ~~ .
La, .Urea es una carba~ida del acido carb6nico que es hidrolizada por la
~nzimaureasa. EI medio'de cultivo ,urea contiene como indicador de pH el
I Rojo de Met~lo, au cambio de color de rosa palido a fucsia permite observar si
I
l '
la reacci6n es positiva.
.
68
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano
Para una mejor observaci6n, se emplean medios de cultivo que no sean ricos
~.. ---.~
qJr~9t~me_I]!~.;_eJl. tubo_g~_Ems.ClYQ.._~L.9..uaL~_IIlj.~JJf3_12%_~g~~~~~_X, ~
Iicuefacci6n aparece desp-uesde24
------.. .-.---- horas de. . . ----.".
-~~-.------------.---,....<-------
incubaci6n,
.-.---- sin quelareacci6n
--..-~-----,.-~~-
. "~ 0 el agar nitrato revierte aun, cuando el,medio perma"nezca refrigerado a 4°C, durante por 10
',\e, la reproduccipn menos 3 horas..
, ------'-
rapidamente los
..
-~-- -~------- ~
69
soluble, la cual puede penetrar al interior de la celula,' donde es utilizada agregar una gota de plasma sobre uri inocula pI
---- ------.-.'
,Hem6lisis de La Sangre
,Se utiliza el. Agar ,Sangre para observar como algunos microorganismos
-'-'~--'--~-"--'.-- -----~-.-.~- >~-..
,destruir ,Ia
-'.
hemoglobina y producir el dari0ge los· globulos, rojos. -._--- ~~-
La
formacion de un halo transparente alrededor de la colonia, indica la hemolisis
- - - - - - - - _•• _ _ _ _ .~_ .._ A_''''_ _ ._--_.~.~_._, ___ ~_~--"'-------·-
_ _'.. - -
i •
!
a de la cadena a de la hemoglobina; y la ~~arici9n...9~~UJ!l.halo tr.?ns~
-"--"'-'~--'"--.-~,.-.. - " ,-,-,.--.~---------- --~, --....--
verdoso, hemolisis pde lacadena P de la hemoglobina. Dada esta cualidad,
'-~." "'~ "'- ' •. ' , ~-,-- ..... -.... ~-~ -,,.~- ".~---.,#'~
70
retrar al interior de la celula, donde es l:I.!!!i!adC! agregar una gota de plasma sobre uri inoculo proveniente de Caldo Cerebro~
ira ~I_proceso respirato~.<?- EI revelador empleado Corazon. --,
-
~ ---- - --------------------.. -~~-
; ya que ?~acci~onar co~. el almid~Qroduce. un
...
lr de
"'--
la colonia se forma 'un haio ·no coloreado se
-____ . -.. . .-
-~
Prueba de la Catalasa: ) 2
La Catalasa: esuna hemoproteina que 'al desdoblar el peroxido de hidrogeno ~
u oxidar los substratos secundarios retiene su estado oxidado. EI peroxido de
F ta cualidad,
.\
Procedimiento
• Tomar una colonia con el asa esteri!.
ticos. Se
• Depositarla en el centro de un porta objetos limpio.
-."
•
•
Adicionar una gota de peroxido de hidrogeno al 30%.
Observar. producci6n de burbuja.
\
71
Manual de Mlcrobiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologfa
Esta prueba se realiza utilizando una varilla que contiene N,N ..---.,-
dimetil-1,4 I '
- - - - ____________._6 __________ __ ~___ . __ .____ ~.-.---,-
)
fenildiaminocloruro 1-naftol actua aSI: ) ;
l :
I "
I .'
,-.;
Enzima :
oxidasa+oxlgeno atmosferico + citocromo +reactivo oxidasa; al
~ ' , ,
1
--
oxidar el reactivo produce un compuesto coloreado,el indofenol, el cual
~.~'-'-- .. ------------.-.-- .. ' ... - ..•. ---- ...---~-'-- CJ~V-~
actua a su vez como aceptor y dador de electrones.
...-...
, - _._._--_ -:.._--_._.--_. -
-------~".--'~-.:...-. .. . -- ---.-------'.-----~ --- Y,62S
~O,3't-~
PROCEDIMIENTO GENERAL DE LA SERlE BIOQUiMICA
descargar el inoculo.
; .j
• Esterilizar la aguja de inoculaci6n y tocar el coraz6n de la colonia de la ::", .
muestra para analizar.(Figura 8.1 )
• Inocular en elfAgarRIAO-~~ introduciendo la aguja hastael fondo y
luego sactll1dola haciendo una estrla en zig zag en la superficie del Agar
inclinado.
• Inocular el~~trato_ Simon~ haciendo zig zag en el bise!.
• Inocular en elt~~_~~J por picadura hasta el fondo.
• Inocular el tubo con~ por picadura hasta la mitad. .
•.. I nocular el tubo con§gar ur~ por punci6n hasta el fondo:' Siembre en
zig zag en el bis~1 0 pico de flauta.
• Inoc~lar el tubo con~dov~es-p~~~k~edlavando el asa (Figura 8.2)
• En las cajas con jA98Lalmid6n-y-s~grel se hacen IIneas cortas en cada
uno de los cuadrantes(Figura 8.3)
• . En :el .h.ibo con ra9~~~in~cLl'ar la muestra para analizar con el
asa(Figura 8.4) . . ' . .
,;- .~
.. !
I
72
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano
; rvJJ
I C) ,__. ~,\
1
--
.-1-- ~V de cultivo a Figura 8.1. Toma de muestra en la serie Bioquimica ,
l£',I---
.3---'
\
, clnterior para
ryr.
I "
~~-;. rrAs.
V' , ~,
Ionia de la
~
e/,fondo y
\ del Agar
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,
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\
73
Cl
Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologla
1
~!
- .9--
"
CI, ""'
J Is. Serratia:_-: , '.
. ; ; t - , .. - n
Proteus ' I
fJ
'
(' ,
11 Pseudomonas
i ', ,.. .>
)c r ' " ,
II ,- , i "
~ (~ KIA Agar K\i '
Figura 8.3. PruQbas de (a) caseinasa (b) hem6lisis LlA Agar Lil,
C.S AgarCl.,
Mov Movilid{\
A 'Acldez . :
A Acidezc"
K Alcalino \
V Variable 'i, \
'
, '
.' "
Actividades
Reportar en una tabla los resultados, obtenidos de su cepa con cada una de '
. .
,,' .'las, pruebas bioquimicas.
',' Buscar sus resultados en la tabla de caracteristicas bioquimicas.
Olga In~s Montoya Campuzano Manual de Microblologfa Olga In~ Montoya Campuzano
-
11;;;"1;(;1 't'l/~Jt/I~~/ V
/1 .'" ,
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N..Q,,,,,oq,,o.:.;.,. ~G-'O~~v.'O oI v
V.f/_~ l~) \ '
(75-.
~-"" • • • .'>',
...•.
Manual de Microblalogla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Micrablalogla
• Asas
PRACTICA9 '
• Varillas de vidrio de 2mm. de diametro.
GENETICA BACTERIANA
• Cajas de petri.
OBJETIVOS
Practicar el metoda de Gradiente en Placa para detectar cepas mutantes
Diferenciar una cepa resistente y una sensible al antibi6tico oxitetraciclina.
MATERIALES
76
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblo/ogla Olga Ines Montoya Campuzano
, ,
PRACTICA9
• Asas
GENETICA BACTERIANA
• Varillas de vidrio de 2mm. de diametro.
• Cajas de petri.
~~-
ex -..3-'~ agar Tripticasa Soja
~.CP'. • Esparcir la muestra bacteriana con una espatula de vidrio
• Incubar a 37 C por 24-48 horas
• Examinar el desarrollo de las colonias resistentes en las areas de mayor
concentraci6n del antibi6tico
• Tomar varias colonias
• Hacer una suspensi6n en caldo Tripticasa Soja
• Incubar 3 tubos con caldo Tripticasa Soja conteniendo 0.001 mg y 0.05 mg
de oxitetraciclina
• Incubar a 37 C par 24 horas
• Observar crecimiento por turbidez.
,
77
Manual de MlcrobiOiogla " .Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologfa .
AGARCQII
pRACTICA 10
OXITElRACIClItA
. ESTLI 010 DE HONG(
~~~~~~;~i~~~~~-
:'f··:·········":-:··:.."c:"~·:";::::;:;:::::::-;~·::·~:.:·";:=~=:~'::;=-':::=···i:\
i:1!\~~\m~*~2I~'f:~~¥~~it
~-l AGAR
. AGAR CON "
z.- NUtAENTE TRPTICASA DE SOJA
Actividad
. ".
Realizar un cuadra especificando las caracteristicas 'morfol6gicas de la
colonia de una cepa resistente can la cepa sensible.'
78
.Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia .• Olga Ines Montoya Campuzano
pRACTICA 10
. ESTUDIO DE HONGOS
INTRODUCCI6N
r ina
1icas de la
Los hongos no poseen clorofila, adquieren su energia de los compuestos
organicos que estan en el suelo y en el agua. EI alimento 10 pueden obtener
de los materiales muertos (saprofitos) 0 se nutren como parasitos de
. huespedes vivos. Por eso consideran heterotrofos.
OBJETIVOS
79
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano . Manual de Microb/ologia '
MATERIALES
• Cajas de petri con Agar selectivo para hongos(OGY-SaboL!raud)
• Cubreobjetos y portaobjetos
• Papel filtro
culo r:
\ ,
• Puente de vidrio
I=,)Y~
• Estilete
• Lugol
PROCEDIMIENTO c,
-
Preparaci6n de un Microcultlvo
• Colocar en una caja de petri un pedazo de papel de filtro, untado de
glicerin~.
80
Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Microblologia Olga Ines Montoya Campuzano
\
\
~-
t cub r ~ cJ -: :. ~'L
I;: ~/\!!1.
1. AImeIr .....
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5. CoIocw etln6allo
IIObre. eI truzo de JI
y
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. . -.
......-....
~L". ...-..........
,-~-, ", ~~
I \
BASDoMIcETO
Figura 10.2. Estructuras de un Basidiomiceto
COllidloforo
82
Olga Inu Montoya Campuzano . Manual de Itt/croblologia Olga Inu Montoya Campuzano
lamelas
Actividades
Preparar una placa: Tomar con un estilete esteril una' muestra de cultivo .
reproducci6n.
83
INTRUDUCCI6N caracterrsti\~=~'~
'. Naturale2i 1
'r O',~<;
Las algas son organismos Eucarioticos, unicelulares 0 coloniaJes, estos ultimos • producto~:i Li,b 0. '5
forman agregados celulares; las hay macrosc6picas y microsc6picas, presentan • Tipo, nurrl! ~Ol'b'i-S'
"
como las plantas pigmentos clorofflicos y carotenoides que actuan en procesos • Composici
I C\
fotosinteticos oxigenicos, utilizando el agua como donador de electrones. • Caracterii '.
• Ciclos de Ii .;1.->,- ~~
! /" - Ou',>'
Muchas ,algas son fototrofas obligadas y por ello incapaces de crecer en la
, -
. , ~ :--j/1, _____
oscuridad con fuentes organicas de carbono. Sin embargo, algunas algas' pueden OBJETIVOS :";.
crecer en la oscuridad, de manera quimiorganotrofa, catabolizan azucares \
Observar las, i
sencillos y acidosgrasos. l
\- I
o/Olj~V~fu
indicar el grado de contaminaci6n 0 de limpieza en la cual se encuentra. ,Algunas
de elias pueden producir olores 0 sabores indeseables; otras pueden actuar como • Gaieros y pl.,'
barreras para el intercambio gaseoso del medio ambiente, 0 ejercer una acci6n • Claves parar, , , (\
~:) , ,
"
~ Ab '0 ~ ,
Las algas, son utiles en la fertilidad del suelo, como alimentos por su alto valor • Panuelos de' ~I ';, r0~
nutritivo (Chlorela). En el ambito industrial, las 'Diatomeas, se utilizan como li ~. 1{'{\')
filtradoras, aislantes y abrasivas; las algas rojas del genero Gellidium se usan en t·" 4 ~.,.., -1,/5 --;
! rf>'3 ,/\J C/<'"
la elaboraci6n del Agar Agar, pOlisacarido util en la preparaci6n de medios de III
I'
\, •• ""_ •
84
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogia Olga Ines Montoya Campuzano
II .
I pRACTICA 11
cultivo microbiol6gicos. En cosmetologfa, se utilizan como base, la elaboraci6n de
!ESTUDIO DE ALGAS jabones y talcos .
.
Para la clasificaci6n de las algas, se tienenen cuenta las siguientes
caracterfsticas:
,
• Naturaleza y composici6n qufmica de los pigmentos.
eIO,niaJ~~, estos ultimos • Productos alimenticios de reserva.
\CrOscoPlcas, presentan • Tipo, numero, implantaci6n, morfologfa del fJagelo.
\e actuan en procesos • Composici6n quimica de la pared celular.
e electrones. • Caracterfsticas morfol6gicas de la calula
ls de crecer en la
·l9unas algas "ueden
• Ciclos de vida y reproducci6n.
OBJETIVOS
.' ~\tabolizan azucares
~,
Observar las algas microsc6picas en una muestra de agua estancada.
Clasificar cada una de los g{meros de acuerdo con las claves taxon6micas.
• Gasa
. su alto valor
• Pariuelos desechables
. Jizan como
, se usan en
85
Manual de M/crolJlologfa ,.' Olga In~ Montoya Campuzano , Manual de Microblologfa
Actividades
PROCEDIMIENTO EsqlJematizar 10 observado
• Tomar un portaobjetos desengrasado Clasificar las algas de acuerdo con las claves tax~r
• Aqicionar con una pipeta 0 con un gotero la muestra de agua para analizar: . ,.,-I'"
I
(\
-
"' ~---
- {
Dc.. _"_'_ _C-~'I
r
_ _-'_'.. .,. .___. '-1/ ___
.,..i / ~
~C
-
A
,.
Figura 11. Algas
86
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/crobiologia Olga Inu Montoya Campuzano
Actividades
I . Esquematizar 10 observado
sengrasado
Clasificar las algas de acuerdo con las claves taxonomicas.
) con un gotero la muestra de agua para analizar
ubreobjetos encima, sin producir burbujas
!
pn objetivo de 40X. .,
87
.-
_Manual de MlcrobIoiogia, _ Olga Ines Montoya Campuzano Mlllllual de Mlcroblologla
De acuerdo con los mecanismos de locomoci6n, los protozoos se dividen en cinco I, ~o,?:>'i-5 - ,G;J
~- .3---- ~ ~-.- -0
clases: Sarcodina, Ciliata, Mastigophora, Sporozoa y Suctona. _
CI,
I,' ~-. i ..
--('-"-.:-:~;}~/~
Sarcodina: Forma ameboides, las cuaJes se mueven emitiendo protuberancias a
modo de apendices tentacuJares, J/amados pseud6podos. Dentro de este grupo
se encuentra el genero " Amoeba " que siempre esta desnudo en su fase
\
vegetativa, siendo un microorganismo qe vida libre, encontrandose en habitats
acuaticos de tipo marino, dulce. Tambien esta la Entamoeba hystolitica, parasito
animal que causa la disenteria amibiana y el genero de 10 foraminiferos, ami bias
r
,
I i >
~ ~
que secretan una concha durante el crecimiento vegetativo y su habitat es
exclusivamente marino.
,,-
'-;"~:
'~'\-
ss
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogia Olga In~ Montoya Campuzano
I
i
~___'_P_RAC_T_IC_A_1_2-----------
__ Sporozoa: Incluye protozoos que forman esporas y que no poseen por 10 general
: '- ()
,.:: ,>......r
!
<;.
'-
I'V'I
'i / ,
"J.
l U habitat es paludismo; el Toxoplasma gondii que transmite la toxoplasmosis en humanos.
) de materia
OBJETIVO
Observar, diferentes clases de protozoos y sus respectivas formas de locomoci6n.
1en en cinco
MATERIALES
Se utilizan los mismos materiales que en el laboratorio de algas.
-- berancias a
,', leste grupo
·'rn s~ fase
in habitats
ra' parasito
~S, amibias
Ihabitat es
.I1aci6n de
.'.: lim
~
el mundo' '~.';~
Dentro de
I ~i II' I~
jI\
I ..
.lrimero de 1
reo
~ntosos 0
\ como la
1
rusante
Figura 12. Protozoos
.~=~===~---~-~--...",~,-.~,,,,,,,,.~,,
J 89
MatIItlrlIJ;Ie M/croblologla ..'· ~ '•. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de M/crobiologia
pRACTICA 13
Actividades
CONTROL DE MICROORGJ
Esqoerriatizar los diferentes protozoos de la hluestra analizada. '..
I;: ')/~
"'
-
90
Olga Ines Montoya Campuzano Ml:IIJual. de MlcrobioiOllia .. Olga Ines Montoya Campuzano
pRACTICA 13
CONTROL DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCI6N
OBJETIVO
MATERIALES
>,
Cepas bacterianas: Familia Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Yersinia
sp, Klebsiella sp, Familia Bacillaceae: Bacillus subtilis, Bacillus cereus.
Familia Micrococaceae: Staphylococcus aureus, Micrococcus sp. y de la i
Familia Estreptococaceae: Streptococcus sp.
Equipos
• Mecheros
\
\ 91
Manual de Mlcroblo/ogia' :" ',' Olga Ines MontOya' Campuzano IIIanual de IIIlcrobioiog/a \
PROCEDIMIENTO
pH
• Tomar 5 tubos de ensayo con 6 m( de Caldo nutritivo cada uno.
.'Ajustar, e~pH pa:f~L~da tubo respectivamente en: 5);~~?~~9ffy
11.0 con'!!9,vo"~~~segun el caso. ' .. -~
• Inocular, cada uno de los tubos con 0.1 ml de la muestra del
. microorganismo de interes.
• Incubar a 37°C por 24-48 horas
• Observarcada 24 horas
• Evaluar el crecimiento (Figura 13.1)
AI
' I'
I,
I .j '!
" :! . .... - ,
kd,
.:
,
: .........J
~." '. 'I
j'/. ;t
11.i
:'. I
I,
1t.i
92
Olga Ines Montoya' Campuzano "'..uBl de ""crobIoIoglll ., Olga Ines Montoya campuzano
Presi6n Osm6tica
t
i
"I ,I
1% 5%
L 15% 21%
J
500C, 600C, 700C Y800C. Otros cuatro tubos con una solucian de bacterias
•. Tomar ocho cajas de petri con Agar Nutritivo. Marcar cada una de elias,
con las siguientes temperaturas 50oC,60°C, 700 C y 800C.
• Dividir ra base de cada caja en cinco cuadrantes. Marcar cada cuadrante
.\
93
Manual de Mlcroblologfa. Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobioIogia
Antibiograma
con el tiempo de exposici6n asf: Control, 5 min., 10 min., 15 min., 20 min.,
inocular de cada uno de los tubos en las cajas con Agar, enel segmento • Tomar dos cajas de petl; con Agar Sensitive
marcado con, control. , ,I cada ~qa_coI1J~ cepa de interes.
, I
• Tomar por parejas, tubos con bacterias Gram·positivas y Gram negativas, • InocU
I' 1
marcados para cada una de las temperaturas senaladas y "evarlas a! . • Coloc
Ii
CJ',il-~ A cui
Bano Marfa calibrado a la temperatura respectiva.
,> ,
,
• ,
difere YI6~S
. I -0, era, 3'1-$ .
• EI tiempo de exposici6n para cada pareja de tubos sera de 5', 10', 15' ,20'. • Incub
I;
Y se procede a inocular en el segmento marcado para cada paso. • Obse[ .
13.4)
i D(.J> .
Agente •
---------'-' y / ----
1 :.i
I
I '.
Realj
J
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sensi~ ,!
i
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A
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I .'
corres •
\\ ---J I:
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f.
I
,·ri' .
(" II,!'
I'
• I. i
Pruebas de sensibilidad '.
-1 i
Las pruebas se 'realizan emplean~~_·~ de sensibilida~,. unos
i
j
impregnados con antibi6ticos y otros conagentes qulmicos.
-..-.. .....
~ --,~-,-'~'-'.------.~--,.~-~- --- ~I
!
I,
I
/
94
Olga Ines Montoya campuzano Manual de Microblo/ogia . Montoya Campuzano
Olga.",Inils
Antibiograma
sici6n asi: Control, 5 min., 10 min., 15 min., 20 min.,
i
--------
;)s con bacterias Grampositivas y Gramnegativas, • Inocularla cepa con escobill6n de algod6n esteril.
~a de las temperaturas~ serialadas y lIevarlas al .'
, '\.. • Colocar, sobre la superficie del Agar inoculado, discos de sensibilidad, de
~...--laJeD"
'.
'va.
\.. ;', . ,.. . diferentes antibi6ticos, manera que haya' una distribuci6n uniforme.
~.;·-l ~ ~2- \ssera de 5',10',15',20', • Incubar a 37°C durante 2448 horas.
L-J
I
'Oara cada paso.
• Observar cada 24 horas la formaci6n 0 no de halos desensibilidad.(Figura
13.4)
Agentes Qulmicos
'\ \
"
,•
.
'\
95
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrablolog/a
Radiaci6n Ultravioleta
PRACTICA 14
• Tomar d,?s cajas de petri con Agar Nutritivo. MICROBIOLOGiA DEL ~
Actividades
96
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Itf/croblologla Olga Ines Montoya Campuzano
PRACTICA 14
:ri
I
con Agar Nutritivo.
. , MICROBIOLOGiA DEL AGUA
~dj!:>~
EI agua es el constituyente esencial para la vida, porque no solo hace parte
\ta, por 10 minutos.
t de nuestro cuerpo sino que tambian es indispensable en la elaboracion de
\~~ t~os alimentos. Puede ser un vehiculo de enfermedades como la
';~almonelosis, 'amibiasis y fi~bre tifoidea entre otras.
97
.Manual de Mlcroblologla Olga Ines Montoya Campuzano Manual de MlcrobIoiogla c
lejos de la .orilla. Introducir las manos hasta el coda, previa mente lavadas Capacitar al estudiante en los analisis microbiol~
1
y desinfectadas. Crear una corriente artificial. Abrir el frasco dentro del deben realizar ~fJna muestra de agua para ~
agua. Llenar dejando un espacio de cabeza de 3 cm entre la tapa y la Interpretar lOS!:,! ,:
I'
~T "
.
muestra de agua. de contamina~: CJ', i.l.. ~ Ad
~ . Rios 0 quebradas: Recoger la muestra en contra de la corriente,
~'I . Lj,6o.S 1=.
seguir las mismas precauciones del proceso anterior. I: . ~Q),~O,3'1-S.
~,
. ' i ' '
ActividadesJ: .
- Tuberta 0 acueducto: Flamear la boca del grifo si es de material
resistente al calor; sino, desinfectar can claro a alco~ol. Abrir y esperar 5
<l q
HacerLin anc: ~-'- ..- -- -~. - "
i ,. {- 2
, A, ,',' •
min. que corra el agua. Llenar el frasco. Dejar un espacio de cabeza de 3 estudiadas, ! ~ _
explicaci6n J. I
• Temperatura: La muestra de agua se debe transportar a una
temperatura de refrigeraci6n (4°C) en una nevera de icopor auna balsa -....
con hielo.·· Las muestras deben ser procesadas inmediatamente; de, no
ser posible, almacenar refrigerada maximo 24 horas, si no se refrigera el
tiempo maximo para procesar es de 6 horas.
"- -"
98
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologla . Olga Ines Montoya Campuzano
ucir las manos hasta el codo, previamente lavadas Capacitar al estudiante en los analisis microbiol6gicos de rutina que se Ie
I
i
.
\
I! una 'corriente artificial. Abrir
. '
el frasco dentro del deben realizar a una muestra de agua para saber si es potable 0 no.
~n espacio de, cabeza de 3 cm entre la tapa y la
Interpretar los analisis microbiol6gicos, para poder determinar las causales
de contaminaci6n higienico - sanitaria.
!Recoger la muestra en contra de la corriente,
explicaci6n a ellos.
~.""-.- ~ ~
I t--'
~'-J / - - - -
V
v \ . u l n a bolsa
~te; de, no
.efogera el
-::.
0,
. ~.." --
_-.3-~ Cf-{'\ .
\\.
eX (..N"~ " ol6glcos:
~
~
. ~'i·
oliformes
; ,.~s
\ .
\
sImi,
'\
99
'eyrE-CAS
.; GOrt$L
. PRACTICA 15
estructura altamente resistente presente en .los mi
..', MICROBIOLOGfA DE LA LECHE
Bacillaceae, como BacilliJs Y Clostridium;tamt
Streptomyces. En el Pienso es mas eomun' encontr~
INTRODUCCI6N CJostripium~ComrdnoJ'I"''''..:...J· ~
,euJ.)
-- -
lacteninas, lactoperoxidasa y lisozima, que actuan como germicidas;. Peresenta
~
_ q_.. -
..I ...--
un pH entre 6.5-6.7. ...-.:.--- .
La leche en su estado natural presenta una microbiota inicial pro pia del mamifero;
pero puede contaminarse con aquellos microorganismos que estan presentes en
la ubre, en los manipuladores 0 en las superficies extemas.
100
'OTECAS
, GOMEZ
[germiCidas.. Peresenta
Manipuladores de los equipos de ordeno: Las condiciones higienicas de las
manos de los manipuladores, es importante para una buena caUdad
microbiol6gica de la leche. EI equipo de ordeno debe mantenerse limpio y
~ruyen microorganismos desinfectado para evitar el crecimiento de ciertas baderias como Streptococcus
)san alteraciones en el I~ctis, Pseudomonas, Alcaligenes, Fla~obacterium, Chromobacterium 'y las
Ileche se congela para bacterias del grupo coliforme.
Lras entre O-soC hay
. .,
En la calidad de la leche, es de interes conocer los parametros qufmicos como
microbiol6gicos. En los para metros qufmicos, juegan un papel importante ciertas
}al propia del mamffero; enzimas como la Peroxidasas, Reductasas, Fosfatasas.
)ue estan presentes en
.. \0 /(
I '. Peroxidasa:
.
Es una enzima presente en la leche cruda, .pero la destruye un
proceso de pasteurizacion excesiva. Esta prueba debe dar positiva en leches
lanismos: Micrococcus, hervidas y pasteurizada. ',
s lactis y S.cremoris,
101
"'snua' de ""crobIoiogia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia
Fosfatasa:· Es una enzima que esta presente en la leche cruda y es destruida • Caldo tetrationato
mediante el proceso de pasteurizaci6n, par 10 tanto, al realizarse la prueba de la • Caldo Tripticasa soja
Fosfatasa en leche pasteurizada, esta debe ser negativa. ' • Caldo Voges ProskaVtl8r
• Agar Ba.i~/;LC!!lrltQr~~~,~-----
I i
Capacitar al estudianteen 'los analisis" microbiol6gicos de mayor inte'res para la • Vodo - - - - - ',-=:-.,-' - ;/ ---
, ' ,
• PiPeta) i
MATERIALES • ~
Cajas ; •
• Leche cruda, hervida y pasteurizada • Asa de •
/ i
• Azul de Metileno al 0.05% • Meche,' ~)4'\ C" ,,' _ '.'
• Brila Ii' 31
~~
• Glucosa Azida PROCEDI\ • cP.DX~\)~,~fu:"
• Purpura de bromocresol I'
/
• Fluorocult
Preparaci,
\JJS .5 \J'::- : .
• Agitar sl
------ ..
• Plate Count I
--- '"
• Abrir asl /{ 10 I '6 ~ ,
• AgarEMB I. r0
• Tomar I i i , )
• Caldo Eijkman
\ : ~~ K 1 ('('\ - )<
• Caldo cerebro-coraz6n (BHI) 1 rr>?;', ~[,N'I?:,
.
1
, .
I
~
f!" f\I . , .
~~·o jv
102 j
lr -: cJ "'- ~~ IP de Coliformes
occus aureus,
•
•
Agar Palcam suplementado
Plasma de conejo desfibrinado
• Agar KIA
• Agar LlA
• Agar citrato Simons
• Agar urea
teres para la • Vodo
• Verde Brillante
causales de • Tubos tapa-rosca
• Campana de Durham
, ~. '
• Pipetas de 1 y 10 ml.
• Cajas de petri
• Asa de Diglaski
• Mechero
PROCEDIMIENTOS
,i
• Abrir asepticamente.
• Tomar la muestra con material esteril.
\ 103
Mlltlual de Mlcroblolog/a' ' OIgalnes Montoya Campuzano Aflltlual de Mlcroblolog/a
Pruebas microbiol6gicas.
"'->
i (l
• Prueba de la Reductasa
• Incubar a! i
A un tubo estenl tapa rosca adicionar
• Tomar ury , ~-
• 10 ml de leche.
• 1 ml del reactivo azul de metileno al 0.05% v/v.
j petri cont,f, _ _ _ _~. .:. ., y /
• Incubar,
DCJ,>'
I
~ J
- Prueba de la Fosfatasa
I , '
,
A un tubo estenl tapa rosca adicionar
Pre$' i,
I'
• 2,5 ml del reactivo 4-para nitrofenil fosfato dis6dico
• 0.5 ml de leche
• TO'/. ~~\)V~~-T
· ~:l
\ /
104
Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Mlcroblologia . Olga Inas Montoya Campuzano
Pruebas microbiol6gicas.
- Presencia de Salmonella.
• Tomar 25 ml de la leche
icionar
• Adicionar a 225 ml de cal do cerebro-coraz6n (BHI) a la mitad de la
concentracion especificada par el media.
• Incubar a 37°C durante 16 a 24 horas.
• Tomar 1 ml de la muestra incubada.
cambia de color.
• Inocular a 9 ml de cal do tetrationato (adicionar 3 gotas de yodo para evitar
contaminati6n y verde brillante para inhibir flora acompariante).
• Incubar a 37°C durante 16 a 24 horas.
• Tomar una asada e inocular par el metoda de siembra en placa, en cajas de
petri can agar Hecktoen.
• Incubar a 37°C durante 24 horas.
• Observar colonias trpicas de Salmonella (punta negro rodeadas de un halo .
hora, su' calidad
trasparente).
cuatro horas para
If,
• Realizar las prueba bioquimica a estas colonias (KIA, LlA, Citrao y Urea):
• Confirmar la presencia de Salmonella. KIA: KlA+H2S, LlA: KlK + H2S, Urea
negativa, Citrato positivo.
-1. K~
~~\,~\)J 105
Manual de M/crobiologia
Manual de Microblolog/a ' Olga lriu Montoya Campuzano
PAACTICA 16
, MICROBIOLOGiA DEL R
• Inocular 0.5 ml en 0.5, ml de plasma de conejo desfibrinado.
• Incubar a 37°C durante 4 horas.
INTRODUCCION
• Observar producci6n de coagula para eonfirmar la presencia de
~---"--------
EI rumen es ~' 1
una temperat! CJ',il-~
• Inocular una asada par el metoda en superfieie sabre un agar Paleam -:--
suplementado.
I i
hongos, coni: ' I Uv ,.
fase gaSeOs8 i • ----'-,--;;,..;..'7/ ----
• Incubar a 30°C durante 24 horas.
t~ ,
• Observar colonias lipicas de Usteria (punto negro, halo verdoso).
En una mue
-...-
• Realizar pruebas bioquimicas (KIA, VP, RM, SIM, Urea). \'
protozoos di ;..,
• Confirmarla presencia de Usteria. KIA: AlA, VP: negativ~, RM: positiv~, SIM:
se eneuentrc
Actividados.
(Annison, 19,
,I
! '
i
r'
I ,
De aeuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas dar una posible explieaci6n diferentes t1 '
~ !
I:
t
106
O/ga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcrobiologia Olga Ines Montoya Campuzano
pRACTICA 16
I .
iloras.
v, ositivo, 81M: protozoos de la clase ciliada y flagelada. Los ciliados son mas abundantes
, .f
300 Ilm, por 10 que se pueden observar mas faci! que los flagelados.
'~71 'l
(Annison, 1965)
~.~~.:y _.. \Udiadas, en, Los protozoos propios del rumen son muy dificiles de aislar y para
~1' \\,:fy'"e, (\y-06 .. observarlos se requiere de coloraciones especiales; porque ell os presentan
p.f(,;""- ,0v P . . ~ ,~ " 'explicaci6n
diferentes tamalios y los de menor ,talla se confunden con las bacterias. Los
" A protistas ingieren bacterias, ruminales y se cree que ejercen a/gun tipo de
\' . ~-'~\J~~
--. \f1 control sobre la poblaci6n bacteriana.
, ,
:""1 , La clasificaci6n de las bacterias ruminales se realizan con base en el sustrato
que degradan, por ejemplo: celuloliticas, hemicelulolfticas, sacarofiticas,
\
\
107
Manual de Mlcroblologia Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microbiologia
haber nacido la cria del rumiante, presentando gran afinidad por los tejidos Est! I 1:
I
lign'ocelul6sicos 'de las 'particulas vegetales y tienen la' facultad de degradar flui~ 0',1).-<;
I
Lj,b0..'5
celulosa yhemicelulbsa produciendo acidos grasos volatiles como el acetico, po~l
~O,?J'i-$·
propi6nic'o 'y buUrlco.' AI no presentar citocromo, ni mitocondria, ellos tom~n dife
'I'
.=CJ _
la enetgia de los'procesos fermentativos. del,
(T9!
~-.--,- ......... -
"
Metoda'de Muestreo ,0:- Lr, '". c:
Ii 1 ,
2. f , ----',-,-:,--'-' 7/ ------
Para 16s anallsis microbiol6gicos las muestras del rumen se pueden obtener ! i
t
mediante 'tres metodos: fistulaci6n 0 canula, sonda nasofaringea y de
i:
inyeeci6n pentoneal. ' I ;'
I; ~.
Ii
pAllo DE CAIIPO
') \
"
'y\
'iii
...,.~.
:~'."~ \ 108
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Microblologia Olga InesMontoya Campuzano
rs
,iipolfticas
0 tambien de acuerdo al producto
" :.'
y.aCidOHticas. Se hace con al fin de extraer el f1uido ruminal, pero primero se prqcede a
desinfectar y afeitar elanimal; hacer una perforacion cutanea de unos 20cm,
!
i anaerobios que alternan una forma flagelada y que va desde el exterior hasta el rumen.
adiez dias de
I
rI ~
ex
-!3--."
t.."".:;. - cF" .
, .'ngea y de Si se utiliza materialas estenlas y un buen procedimiento no causa ningut;'l
trastomo al animal. En cambio, una mala practica puede ocasionar un
desvio de la sonda a otro lugar y ocasionar obstruccion por presencia de
~.
~. '
,;
tl Figura 16.2. Sanda nasafarfngea
--
...
, Du" ".
-
rumina!.
EsquJ :'
r
---',--
Diferenciar por microscopia 6ptica la microbiota normal del rumen.
MATERIALES
• Utensilios adecuados para el tipo de muestreo.
• Microscopio
• Soluci6n salina al 0.85%
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Capilares
• Lugol
• . Filtro de membrana.
~. . '
110
lC\
. Olga Ines Montoya Campuzano
Manual de Microbiologia Olga Ines Montoya Campuzano
Actividades
1
I
1
1
'1
III
Manual deMlcrob/oiogJa Olga In~ Montoya Campuzano
. " . ~ . , Manual de Microb/oiogJa
:~
.........
..
.
ISO~
. . .'''~:~..'-.' ..
COLORANTES YREAC'
Coloraci6n de Gram
o
E.sMIpIac
o
'E~ £CIIICtJ.... 1- A ccJlo r ~ [
o',t?-<;
~ 'S/\!!3.
E......... '
L1lb~5 I
~Ol?:>'i--S
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, . 3--- ~ ~--~
.:;;J.-'- r'c 1"'
I -
.:.-
~ - DLI >'~-II'
-------..!.--j/ ----
~
~
~\
OsI1acodlnlllm
I;
I
112
Olga In~ Montoya Campuzano
Manual de Microblologla,' Olga In~ Montoya Campuzano
Coloraci6n de Gram
1. Cristal Violeta (1litro)
Violeta de Genciana (Cristal Violeta) 10gr
Acido Fenico 0 Fenol 20gr
Alcohol absoluto etmco (Etanol) 100ml
Agua destilada 900ml.
2. Lugol
E."" Yodo metalico O.5gr
"EIIdIp/odhthIm Yododuro de Potasio 1.0gr
Agua destilada 100ml
Preparaci6n: En un mortero colocarel yodometalico y el yoduro de potasio
, .
Osbacodlnlum luego triturarlos. Cuando el polvo este fino, al mismo mortero se Ie adiciona
el agua y luego se envasa.
3. Alcohol acetona
Alcohol 95%, 3 partes 75ml
,I
Acetona 25%, 1 parte 25ml
4. Safranina
Safranina 19r
Alcohol Absoluto , 40cc
,J\j)
\Q~v), 113
~)(
..--:--:
K
1 c:J
Manual de Microbiol~/a" . ' ,
Manual de Mlcroblologia ' Olga Ines Montoya CamPuzano
2. Alcohol Acido
Alcohol absoluto 95gr
Acido clorhfdrico 5ml
Sa mezcla con cuidado.· Evilar quemarse
114
Olga Ines Montoya Campuzano Manual de Mlcroblol~/a,." '. Olga Ines Montoya Campuzano
1adurar·a. 37oe, minimo 48 horas, con agitacion Preparaci6n: Disolver el Azul de Metileno en el alcohol, luego se adiciona el
; v .< \
Coloraci6n de Esporo
1. Verde de Malaquita
Verde de Malaquita 5gr
Agua destilada 100ml
microorganismo y el colorante
· /\.
\
Coloraci6n para hongos
Colorante Azul de Lactofenol
\ Acido Lactico 20ml
\ \
Fenol 0 acido Fenico 20ml
115
/
Manual de,Mlcrobiologla .' Olga Ines Montoya Campuzano , Manual de Mlcroblologia '
,
A ccJlo r -: C
\ '
I ;; 'S/\!!3 '
\ G..JJ ,
~ 5-.-~
-1--
:. '
/;r~
~
~ '/} K:
116
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