PLATE COUNT AGAR (PCA) STANDARD METHODS

AGARGRANULADO

Recuento total en alimentos (FIL, IDF, AOAC, APHA, ICMSF, UNE 34-
553:1983, ISO 2293:1983, UNE-EN ISO 4833:2003)

Composición

 Triptona 5,00 g
 Extracto de levadura 2,50 g
 Glucosa 1,00 g
 Agar-agar 15,00 g
 (Fórmula por litro)
 pH final: 7.0 ± 0,2

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y

ovaladas (por siembra en masa).

Preparación

Disolver 23,5 gramos de medio en 1 litro de agua bidestilada. Calentar,

agitando, hasta ebullición, para la total homogeneización. Repartir en
tubos o en frascos. Autoclavar durante 15 minutos a 121 ºC. El color
final del medio es blanco-crema.

PARA USO EXCLUSIVO EN LABORATORIO.

MANTENGA EL BOTE BIEN CERRADO EN LUGAR SECO, FRESCO Y

OSCURO.

DESHIDRATADO CODIGO: DMT094

Control de calidad del medio

Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su
laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin
usar, tras desinfectar laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando
adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de
caducidad teórica de la etiqueta,…)

Este es el medio standard a cuyos resultados cuantitativos se trazan

los resultados de los demás medios de recuento.

DESHIDRATADO: Granulado, Crema PREPARADO: Estéril, Blancuzco

CONTROL DE CRECIMIENTO 24-48 h a 37°C aproximadamente (o bien

72 h a temperatura ambiente, 21-28°C aproximadamente):

 Bacillus subtilis MKTA 6633***, Excelente, recuperación media

165%
 Clostridium perfringens MKTA 12915***, Muy pobre,
recuperación media 7%, medio inadeduado para aislar este
microorganismo
 coli MKTA 25922***, Correcto, recuperación media 24-123%, no
es un medio medio adecuado para aislarlo sino para recuento
total de aerobios
 E.coli 0157 MKTA 35150***, Correcto, recuperación media 23%,
no es un medio adecuado para aislarlo sino para recuento total
de aerobios
 Enterobacter aerogenes MKTA 13048***, Correcto,
recuperación media 51%, no es un medio adecuado para aislarlo
sino para recuento total de aerobios
 Enterococcus faecalis MKTA 29212***, Excelente, recuperación
media 104-119%
 Listeria monocytogenes MKTA 19115***, Correcto, recuperación
media 53%, no es un medio adecuado para aislarlo sino para
recuento total de aerobios
 Micrococcus luteus MKTA 9341***, Correcto, Amarillo en 48 h,
recuperación media 97%
 Pseudomonas aeruginosa MKTA 27853***, Correcto, Verde-
azul, recuperación media 20-92%
 Salmonella enteritidis–D MKTA 13076***,
Correcto, recuperación media 61%, no es un medio adecuado
para aislarlo sino para recuento total de aerobios
 Staphylococcus aureus MKTA 6538P***, Excelente, Dorado en
48 h, recuperación media 97-125%
 Aspergillus niger MKTA 16404***, Excelente, filamentos crema,
luego negros, recuperación media 114-200%
 Candida albicans MKTA 10231***, Excelente, grandes colonias
blancas, recuperación media 58-127%
 Saccharomyces cerevisiae MKTN 3191***, Excelente, colonias
blancas, recuperación media 101%
*** Cepas comerciales cuantitativas, trazables a la cepa tipo, con
inóculo de 103 ufc. Incertidumbres detectadas entre todos los lotes a
lo largo de un año (la mayoría de la incertidumbre se debe a la cepa y
a la proporción de cepas acompañantes inoculadas, no al medio).

PRESENTACIÓN: TUBOS 20 ml, FRASCOS 100 y 250 ml, MEDIO

DESHIDRATADO.

Medio para recuento total standard de bacterias aerobias en alimentos,

medicamentos, cosméticos y otros productos.

Modo de empleo e interpretación de resultados

Sembrar en la superficie de la placa para aislar colonias. Para siembra

en masa, fundir tubos de 20 ml y frascos y verter 15 ml atemperados
sobre la muestra previamente inoculada (1 ml) en una placa Petri. Tras
homogeneizar y dejar solidificar, añadir otros 5 ml del medio. Repetir
con las distintas diluciones decimales de la muestra. En lácteos, añadir
1 g/l de SKIM MILK MICROKIT para ver halos de caseolisis. Incubar a
30 ºC aproximadamente durante 48-72 horas para la detección de
aerobios mesófilos, a 55 ºC aproximadamente para los termófilos y a
7 ºC aproximadamente para los psicrófilos. Contar todas las colonias.
Para facilitar el recuento puede añadirse por litro de medio, a 55 ºC, 2
ml de TTC estéril (MICROKIT SDA018) al elaborar las placas; así las
colonias se tiñen de rojo y contrastan sobre el medio y las partículas
de la muestra. Si desea aumentar la sensibilidad en el recuento, utilice
un PCA más aeróbico (BCD010), con menos Agar. Para minimizar la
desecación en muestreos de aire y superficies, o para siembra en
Spiral, añadir 2 gotas de antiburbujas (SBL001) por cada litro de agua,
antes de añadir el medio y antes de autoclavar. Para contar por
separado las bacterias, de las levaduras y mohos, añadir a un
duplicado, enfriado a 45°C, 0,05-0,5 g/l de Cicloheximida (SKM200):
En la placa con CEX sólo crecerán las bacterias y en la placa sin CEX ,
la suma de bacterias + levaduras y mohos.
 MAC CONKEY AGAR.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de

fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar
bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y
alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo.

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas,
aportan los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, la lactosa es el
hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que
inhiben el desarrollo de gran parte de la
flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa,
disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del
indicador de pH (rojo neutro), la
absorción en las colonias, y la
precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores
de lactosa producen colonias incoloras.

Fórmula (en gramos por

Instrucciones
litro)
Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0 Suspender 50 g del polvo por
Lactosa 10.0 litro de agua destilada. Reposar
5 minutos y mezclar hasta
Mezcla de sales
1.5 uniformar. Calentar
biliares
suavemente y hervir 1 a 2
Cloruro de sodio 5.0
minutos hasta disolver.
Agar 13.5 Esterilizar en autoclave a
Rojo neutro 0.03 121°C durante 15 minutos.
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 ± 0.2

Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y
agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado
a 45-50 ºC.
Incubación
Durante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica

Resultados

Microorganismos Colonias
Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae ATCC
Rosadas mucosas
700603
Salmonella typhimurium ATCC Incoloras,
14028 transparentes
Incoloras,
Shigella flexneri ATCC 12022
transparentes
Incoloras,
Proteus mirabilis ATCC 43071
transparentes
Enterococcus faecalis ATCC Diminutas, incoloras,
29212 opacas

Características del medio

Medio preparado: rojo púrpura

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código: B02-114-05 x 500g :Código: B02-114-06
 MUELLER HINTON AGAR

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la

prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el
agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos
nutricionalmente exigentes.

Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), recomendó su
uso en forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio
sólido, debido a una serie de factores que se detallan a continuación:
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de
sensibilidad, su contenido en inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos crece
satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han sido evaluados y
avalados usando este medio de cultivo.
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para
realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies
de estreptococos.

Fórmula (en gramos por

Instrucciones
litro)
Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio
Peptona ácida de deshidratado en un litro de
17.5 agua destilada. Dejar embeber
caseína
Almidón 1.5 de 10 a 15 minutos. Calentar
con agitación frecuente y hervir
durante 1 minuto. Esterilizar a
121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45°-50°C y distribuir
a cajas de Petri (o agregar los
Agar 15.0 suplementos que se desee)
hasta un nivel de 4 mm sobre
una superficie horizontal (25-
30 ml en placas de 9 cm de
diámetro).
pH final: 7.3 ± 0.1

Siembra
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”,
la metodología apropiada.

IncubaciónConsultar en la sección “prueba de sensibilidad a los

antimicrobianos”, la metodología apropiada.
Resultados

Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”,

la metodología apropiada.

Notas:

1-Los lotes de agar Mueller Hinton Britania cumplen con las normas
descriptas en el documento M6 - P del NCCLS: ¨Evaluating production
lots of dehydrated Mueller Hinton agar¨. Esto es muy importante pues
algunos lotes pueden variar significativamente y si las bacterias no
crecen adecuadamente, las zonas de inhibición en las pruebas de
difusión son generalmente más grandes, quedan fuera de los límites
de control de calidad y pueden dar resultados erróneos.

2-Los medios que contienen cantidades excesivas de timidina o timina

pueden revertir el efecto inhibitorio de las sulfonamidas y
trimetoprima, produciendo así zonas de inhibición mas pequeñas y por
lo tanto informes de falsa resistencia. Para evaluar el contenido de
timidina del lote de agar Mueller Hinton, se prueba la cepa de control
de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a discos de TMS.
En un medio satisfactorio, se produce una zona clara de inhibición de
20 mm o más.

3-Otro aspecto de cuidado en el control de calidad en el agar Mueller

Hinton es que las variaciones en cationes divalentes principalmente
calcio y magnesio pueden afectar los resultados con tetraciclina,
polimixina y aminoglucósidos cuando se ensayan cepas de
Pseudomonas spp. Por tal motivo, se deben cumplir los límites de
control de calidad publicados por el NCCLS.

4-Los resultados deben ser cuidadosamente observados con todos los

organismos de control para evitar datos aberrantes debido al medio de
cultivo. Para aquellas cepas que fallan de crecer satisfactoriamente
sobre Agar Mueller Hinton no suplementado, se agrega sangre
desfibrinada de carnero al agar fundido y enfriado, a una concentración
final al 5% (v/v).

Para el control de precisión y exactitud del agar de Mueller Hinton se

usan las siguientes cepas control:

S. aureus ATCC 25923

E. coli ATCC 25922
P. aeruginosa ATCC 27853
E. faecalis ATCC 29212
Para evaluar el desempeño de inhibidores de beta lactamasa, se utiliza
la cepa control:

E. coli ATCC 35218

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100 g Código: x 500 g Código:
B02-137-05 B02-137-06
6 x 50 ml Código: 12 x 100 ml Código:
B04-137-84 B04-137-06
 E.M.B. AGAR.

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el

aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y
escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de
Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo
de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La
diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o
sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los
indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto
inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo
metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con
periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son
incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como
colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el
desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en
este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que
Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de
color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean
capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la
incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se
obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y
Shigella.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en
Lactosa 5.0 un litro de agua destilada.
Sacarosa 5.0 Reposar 5 minutos; mezclar,
Fosfato dipotásico 2.0 calentando a ebullición
durante 1 o 2 minutos hasta
Agar 13.5
su disolución. Esterilizar en
Eosina 0.4
autoclave a no más de 121°C
durante 15 minutos. Enfriar
Azul de metileno 0.065 a 45°C y distribuir agitando
suavemente.
pH final: 7.2 ± 0.2

Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para
obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Tipo de Colonia

Verdosas con brillo metálico y
Escherichia coli ATCC 25922
centro negro azulado
Mucosas, rosa púrpura,
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
confluentes
Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras
Incoloras, pequeñas,
Enterococcus faecalis ATCC 29212
puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras

Características del medio:

Placas preparadas: color púrpura.

La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color

naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un
precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido,
ya que es parte esencial del mismo.

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código: B02- x 500g :Código: B02-
6 x 50 ml: B04-101-84
101-05 101-06
 AGAR BAY PARKER

Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial

para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en
alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el

extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el
extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el
piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de
potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora
acompañante. La yema de huevo permite demostrar la actividad
lecitinásica.
Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y
originan colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema
de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a
menudo tiene una zona clara más externa.
Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual
características de colonias pero sin la zona opaca y clara.
Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas
bioquímicas.

Fórmula (en gramos por Instrucciones

litro)
Peptona de caseína 10.0 Suspender 60 g del medio
Extracto de carne 5.0 deshidratado en 940ml de agua
Extracto de levadura 1.0 destilada. Dejar en reposo 5 a 10
minutos. Calentar agitando
Cloruro de litio 5.0 frecuentemente y hervir durante
Agar 17.0 1 minuto. Distribuir y esterilizar
Glicina 12.0 en autoclave a 121°C (15 libras)
Piruvato de sodio 10.0 durante 15 minutos. Enfriar a
45°-50°C y agregar 50 ml de la
emulsión de yema de huevo y
10ml de la solución de telurito
(Código B03-601-61).
Homogeneizar y distribuir en
cajas de Petri.
pH final: 6.8 ± 0.2
Siembra

Dejar secar la superficie de la placa preparada y extender 0.1 ml de

la dilución de la muestra a analizar.

Incubación

24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Apariencia

E. coli ATCC 25922 Inhibido ---
P. mirabilis ATCC Colonias marrones sin zona clara u
Bueno
43071 opaca alrededor
Colonias negras con borde incoloro,
S. aureus ATCC Bueno a
convexas, rodeadas de una zona opaca,
25923 excelente
con una zona clara externa.
Colonias negras, de tamaño irregular.
S. epidermidis ATCC Escaso o
Zona opaca alrededor de la colonia (no
14990 bueno
hay zona clara).

Características del medio:

Medio preparado: ámbar claro opalescente (sin el agregado de yema

de huevo).

Almacenamiento:

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código: B02- x 500g :Código: B02-
141-05 141-06

Precaución

-Solamente para uso diagnóstico in vitro. Uso profesional exclusivo.

-No utilizar el producto si al recibirlo su envase está abierto o dañado.
-No utilizar el producto si existen signos de contaminación o deterioro,
así como tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento.
-Utilizar guantes y ropa protectora cuando se manipula el producto.

-Considerar las muestras como potencialmente infecciosas y

manipularlas apropiadamente siguiendo las normas de bioseguridad
establecidas por el laboratorio.

-Las características del producto pueden alterarse si no se conserva

apropiadamente.

-Descartar el producto que no ha sido utilizado y los desechos del

mismo según reglamentaciones vigentes.
 Bacillus cereus Selectivo Agar (según Mossel)
Medio diagnóstico, utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus
cereus en alimentos.
Fundamento Bacillus cereus, ha sido implicado en toxoinfecciones
alimentarias, particularmente asociado al consumo de arroz
contaminado, y también en algunos procesos infecciosos en seres
humanos y animales.
El medio de cultivo, contiene los nutrientes necesarios para el
apropiado desarrollo bacteriano.
Es diferencial debido a la presencia de manitol. Bacterias
fermentadoras de manitol, acidifican el medio produciendo el viraje del
indicador de pH rojo de fenol del rojo al amarillo, mientras las bacterias
que no lo fermentan, producen colonias del color del medio.
La adición de emulsión de yema de huevo, mejora el aislamiento y la
esporulación de esta bacteria, además favorece y facilita la
visualización de las colonias de B. cereus ya que se produce un halo de
precipitación de la lecitina hidrolizada alrededor de las mismas.
Puede lograrse el aislamiento selectivo de B. cereus, inhibiendo el
desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra, por el
agregado del suplemento para Bacillus cereus con el que se obtiene
una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de carne 10.0 Supender 46,0 g de polvo en 950 ml de

Extracto de carne 1.0 agua destilada. Dejar reposar 5 a 10
Manitol 10.0 minutos. Calentar con agitación frecuente
Cloruro de sodio 10.0 hasta disolución completa. Esterilizar por
Rojo fenol 0.025 autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Agar 15.0 Enfriar a 50°C y asépticamente agregar 50
ml de Emulsión yema de huevo Britania
(código B03-602-61).
Si se desea el aislamiento selectivo de B.
cereus, agregar al medio fundido y
enfriado a 50 ºC, el contenido de 1 vial de
suplemento para Bacillus cereus (código
B03-606-32) reconstituido con2 ml de
agua destilada estéril, para obtener una
concentración final de 100 U de Polimixina
B por ml de medio.
Mezclar bien y distribuir en placas de Petri
estériles.

pH final: 7.2 ± 0.2

Siembra

Homogeneizar 10 g de la muestra de alimento en 90 ml de agua

peptonada 0.1%. Efectuar diluciones y sembrar 0.1 ml sobre la
superficie del medio de cultivo y extender sobre la superficie de la
placa.
Incubación En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24-48 horas.
Resultados: corresponden al medio suplementado con yema de huevo
y polimixina B, siguiendo las instrucciones de preparación descriptas
mas arriba.

Microorganismo Crecimiento Color de la Precipitado

Colonia
Bacillus cereus Bueno Rojo +
ATCC 10876
Staphylococcus Bueno Blanco- +
aureus ATCC Amarillo
25923
Bacillus subtilis Bueno Amarillo -
ATCC 6633
P. mirabilis ATCC Inhibido ----- -----
43071
Escherichia coli Inhibido ----- -----
ATCC 25922

Bacillus cereus presenta colonias de tamaño aproximado de 5 mm,

rojas, rugosas y secas, con halo de precipitación sobre fondo rosa-
púrpura.
Estas características son útiles para diferenciar B. cereus de bacterias
que utilizan el manitol (colonias amarillas), pero no permiten
diferenciar Bacillus cereus de Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,
Bacillus pseudomycoides y Bacillus thuringiensis, por eso será
necesario realizar pruebas bioquímicas para la identificación de este
microorganismo.
Características del medio Medio
preparado: amarillo anaranjado.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.
 AGAR SPS
USO El SPS Agar es un medio selectivo utilizado en el aislamiento
selectivo de Clostridium , especialmente diseñado para la detección y
enumeración de Clostridium perfringes y Clostridium botulinum en
muestras de alimentos.
PRINCIPIO
El medio se prepara según una ligera modificación de Angelotti y cols.,
al medio de Mossel y al medio de Wilson y Blair.
El sulfito sódico presente en el medio es reducido a Sulfuro de
Hidrógeno (SH2) por la mayoría de los Clostridium spp. El Sulfuro de
Hidrógeno reaccionará con el Citrato Férrico y formará un precipitado,
Sulfuro de Hierro, que le da el color negro a las colonias.
El suplemento antibiótico inhibe a la mayoría de bacterias
acompañantes en la muestra, diferentes de Clostridium spp. Por otra
parte, aquellos microorganismos que pudieran crecer no producen SH2
y por tanto no forman colonias con el precipitado negro.
COMPOSICION POR LITRO DE MEDIO EN AGUA PURIFICADA
Citrato férrico 0,5 g
Extracto de levadura 10,0 g
Hidrolizado pancreático de caseína 15,0
g
Polimixina B sulfato 0,01 g
Sulfadiacina 0,12 g
Sulfito sódico 0,5 g
Tioglicolato sódico 0,1 g
Agar 15,0 g
pH =7,0 +/- 0,2
PRECAUCIONES Este producto es para uso exclusivo de
profesionales.
No debe ser utilizado en caso de presentar contaminación microbiana,
roturas u otros signos de deterioro.
Las muestras a procesar pueden presentar otros patógenos
importantes, por lo que la esterilización de los materiales antes de
desechar es obligatoria.
ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL
Una vez recibidos en el laboratorio, almacenar en lugar oscuro y
seco a una temperatura de 8 ºC, en su embalaje original hasta el
momento de uso, se pueden mantener a temperatura ambiente
durante periodos de tiempo cortos, antes de inocular si deben estar los
tubos a temperatura ambiente.
Evitar la congelación y el sobrecalentamiento.
La fecha de caducidad marca la fecha de inoculación máxima.
CONTROL DE CALIDAD
Estos tubos han sido inoculados con las cepas que a continuación se
detallan, obteniéndose los siguientes resultados después de incubar
de 24 a 48 horas a 35+/- 2 ºC en condiciones anaerobias.

Cepa Crecimiento Color colonia

Clostridium perfringens
Bueno Negra
ATCC 3624
Clostridium sporogenes
Bueno Negra
ATCC 3584
Clostridium botulinum
Bueno Negra
ATCC 25763
Staphylococcus aureus
Inhibido -
ATCC 25923
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido -

Pseudomonas aeruginosa
Inhibido -
ATCC 9027

CARACTERÍSTICAS y LIMITACIONES DE USO

El color del medio es beige claro.
La dilución de la muestra con el medio fundido se recomienda
inicialmente que sea de 1:20.
En muestras que se prevean poco contaminadas se recomienda
aumentar la cantidad de muestra y mezclar a partes iguales con medio
previamente fundido a doble concentración.
 VIOLETA ROJO Y BILIS AGAR.

Este es un medio selectivo para la investigación presuntiva y recuento

de coliformes en alimentos y productos lácteos.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan
los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram
positiva, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el rojo
neutro es el indicador de pH.
Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el
medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso.
Debido a esto, se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1
a2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de
bilis precipitada.

Fórmula (en gramos por

Instrucciones
litro)
Extracto de levadura 3.0 Suspender 41,5 g del polvo
Peptona 7.0 por litro de agua destilada.
Sales biliares 1.5 Reposar 5 minutos y mezclar,
Lactosa 10.0 calentando a ebullición 1 o 2
Cloruro de sodio 5.0 minutos. Enfriar a 45°C y
Agar 15.0 verter en placas. Una vez
Rojo neutro 0.03 preparado debe usarse de
Cristal violeta 0.002 inmediato. NO AUTOCLAVAR.
pH final: 7.4 ± 0.2

Siembra
-Para recuento bacteriano: sembrar en profundidad 1ml de la muestra
directa o de la dilución apropiada, agregar aproximadamente 12-15 ml
de medio de cultivo enfriado a 45 ºC, agitar por rotación y dejar
solidificar.
Luego, agregar una sobre capa de medio de cultivo para crear
condiciones anaeróbicas de manera que se evite el crecimiento de
microorganismos Gram negativos no fermentadores de azúcares y el
crecimiento en forma invasiva de Proteus spp.
-Para propósitos generales: sembrar en superficie, una ansada a partir
de los tubos con gas de un medio para coliformes (por ejemplo, de
Verde Brillante Caldo y Bilis 2% ó Mac Conkey Caldo ó Lauril Sulfato
Caldo)

Incubación
Para la detección de Enterobacterias mesófilas, incubar a 30ºC durante
24 horas. Se puede aumentar la selectividad incubando a 42 ºC.
Resultados

Microorganismos Colonias
Enterobacterias Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con
fermentadoras de lactosa halo de precipitación rojizo
Enterobacterias no
Incoloras
fermentadoras de lactosa
Rosadas como punta de alfiler
Enterococcus spp.
(puntiformes)

Características del medio

Medio preparado: púrpura rojizo.

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Presentación
x 100g :Código: B02-143-05 x 500g :Código: B02-143-06
 AGAR XLD
El agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es un medio selectivo
diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de patógenos
entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella.
Composición

Xilosa 3,75 g Rojo Fenol 0,08 g

L- Lisina 5,0 g Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Lactosa 7,5 g Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Sacarosa 7,5 g Citrato Férrico de Amonio 0,8 g
Cloruro de Sodio 5,0 g Agar 15,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g Agua destilada c.s.p. 1000 mL

pH final 7,4 ± 0,2

Preparación
Suspender 57 g de medio en un litro de agua destilada. Mezclar
vigorosamente.
Calentar con agitación suave hasta que el medio llegue a
ebullición. Evitar el sobrecalentamiento ya que puede provocar la
precipitación
del medio. Este medio NO se puede esterilizar por autoclave.
Enfriar a una temperatura entre 45-50°C en un baño de maría y verter
en placas de Petri estériles.
Fundamento
La degradación de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa,
lactosa y sacarosa) genera la producción de ácido haciendo virar el
indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la
xilosa porque es prácticamente fermentada por todas las
enterobacterias con excepción de los microorganismos pertenecientes
al género Shigella.
La lisina se incluye para aumentar la diferenciación de los
microorganismos pertenecientes al género Salmonella, ya que sin la
lisina estos microorganismos rápidamente fermentan la xilosa
produciendo la acidificación del medio y no se pueden diferenciar de
otras especies no patógenas. Como la cantidad de este carbohidrato es
limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen, comienzan
a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinización del medio; este hecho
se evidencia porque el rojo fenol nuevamente vira a un color rojo. En
el caso de los coliformes lisina positiva, para prevenir la alcalización del
medio por la utilización de la lisina, se incorpora en el medio un exceso
de lactosa y sacarosa.
El medio también tiene la capacidad de detectar la producción de H2S,
a través del sistema indicador tiosufalto de sodio y citrato férrico
amonio. Cuando el microorganismo produce H2S se observan colonias
con el centro negro. Los microorganismos no patógenos productores
de H2S no descarboxilan la lisina; cuando están presentes estos
microorganismos la reacción ácida producida por la utilización de los
carbohidratos previene en ennegrecimiento de las colonias. El
desoxicolato de sodio es utilizado como un inhibidor de los
microorganismos Gram positivos.
Colonias típicas
Las colonias sospechosas de Shigella sobre el agar XLD son
transparentes y parecen rojas por el color del medio. Este género
bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa, ni la sacarosa, no da
lugar a que el rojo fenol vire a amarillo. Como estos microorganismos
tampoco tienen la capacidad de alcalinizar el medio por la
descarboxilación de la lisina, no se produce color rojo púrpura
alrededor de las colonias. Las colonias típicas de la Salmonella son de
color rojo con el centro negro debido a la producción de H2S. Mientras
que las de E. coli son grandes, amarillas con o sin precipitado de bilis.
 AGAR MANITOL SALADO
Este medio es utilizado para el aislamiento y enumeración de
microorganismos pertenecientes al género Staphylococcus aerous.
Composición

Proteosa peptona 10,0 g

Extracto de carne 1,0 g
D-Manitol 10,0 g Cloruro de
sodio 75,0 g
Agar 15,0 g Rojo fenol 25,0 mg
Agua destilada c.s.p. 1000 mL

pH final 7,4 ± 0,2

Principios y explicación del procedimiento
Método microbiológico. El agar sal manitol en una fórmula diseñada
por Chapman para la diferenciación de estafilococos positivos a la
coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) de los estafilococos
negativos a la coagulasa. Este agar se utiliza para el aislamiento de
estafilococos a partir de muestras clínicas, de cosméticos y de pruebas
de límite microbiano. El agar sal manitol contiene peptonas y extractos
de carne bovina, que suministran los nutrientes esenciales. Una
concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene como resultado una
inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes
de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio
del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de
estafilococos. Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo,
Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio
circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos
a la coagulasa producen colonias de color rojo y no producen cambio
de color en el indicador de rojo fenol.
Precauciones
 Solamente para uso profesional.
 No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación
microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamiento o
cualquier otro signo de deterioro.
 Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos
biológicos y desecho del producto usado en el documento
Instrucciones generales de uso. almacenamiento y vida útil
 Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una
temperatura entre 2 y 8 °C, envueltas en su envase original, hasta
justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el calentamiento
excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad
(ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de
incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya
abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se
almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C.
Control de calidad del usuario
Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para
obtener los detalles, véase el documento INSTRUCCIONES GENERALES
DE USO).
Incubar las placas a 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia. Examinar las
placas después de 18 – 24 y 48 h para comprobar la extensión del
crecimiento, el tamaño de las colonias, la pigmentación y la
selectividad. Las reacciones típicas son las siguientes:

Cepas Resultados de crecimiento

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Colonias amarillas de tamaño mediano,
amarillo medio
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Colonias amarillas de tamaño mediano,
amarillo medio
Staphylococcus epidermidis ATCC Inhibición parcial (a completa);
12228 colonias incoloras, agrupación activa
inhibida
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibición completa
Sin inocular Rojo

Procedimiento de análisis
Extender las muestras tan pronto como sea posible después de
recibirlas en el laboratorio. La placa de extensión se utiliza
principalmente para aislar los cultivos puros de las muestras que
contienen flora mixta. Si, por el contrario, el material se cultiva
directamente empleando una torunda, hacerla girar en una sección
pequeña cercana al borde, extendiendo luego a partir de esta área
inoculada. También debe inocularse un medio no selectivo tal como el
agar Columbia con sangre de carnero al 5% para proporcionar una
indicación de otros organismos presentes en la muestra.
Incubar las placas a 24 – 48 h a 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia.
Resultados: Después de la incubación, las placas se examinan para
detectar la presencia de colonias de estafilococos La morfología
característica de las colonias en BD Mannitol Salt Agar es la siguiente:
Organismos Resultados de crecimiento
Staphylococcus aureus Colonias amarillas de tamaño medio,
amarillo medio
Staphylococcus epidermidis Colonias blancas de tamaño pequeño a
medio, rojo medio
Estafilococos diferentes de S. aereus y Colonias de tamaño pequeño a grande,
S. epidermidis con zonas de color rojo o amarillo,
según especie.
Micrococos Grandes, de color blanco a anaranjado
Enterococcus. Streptococcus Sin crecimiento a crecimiento muy débil

Bacterias gram negativas Sin crecimiento a crecimiento débil

Las colonias que muestran una apariencia de estafilococos deben ser
sometidas a otras pruebas de diferenciación para confirmar su
identidad.
Características de rendimiento y limitaciones del procedimiento
Mannitol Salt Agar es una fórmula estándar utilizada para el
aislamiento y la diferenciación por fermentación de manitol por parte
de los estafilococos de fuentes clínicas y no clínicas. Se recomiendan
períodos de incubación de 48 – 72 h para detectar todas la especies de
estafilococos presentes en la muestra.
Varias especies de Staphylococcus diferentes de S. aureus son
positivas al manitol y producen colonias de color amarillo, rodeadas de
zonas de color amarillo en este medio (por ej., S. capitis, S. xylosus,
S. cohnii, S. sciuri, S. simulans y otras especies). Por consiguiente, se
necesitan más pruebas bioquímicas para la identificación de S. aureus
u otras especies. Consultar las referencias correspondientes
 SIMMONS CITRATO AGAR

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato
monoamónico es la única fuente
de nitrógeno y el citrato de sodio
es la única fuente de carbono.
Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el
magnesio es cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que
vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial
en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras
de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El
desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a
ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira
al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Citrato de sodio 2.0

Suspender 24,2 g del medio deshidratado
Cloruro de sodio 5.0
por litro de agua destilada. Dejar reposar
Fosfato dipotásico 1.0 5 minutos y mezclar calentando a
ebullición durante 1 o 2 minutos.
Fosfato monoamónico 1.0 Distribuir en tubos y esterilizar en
Sulfato de magnesio 0.2 autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar en posición inclinada.
Azul de bromotimol 0.08

Agar 15.0

pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un
inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Citrato Color del

Microorganismo
permeasa medio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Positivo Azul

S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul

E. coli ATCC 25922 Negativo Verde

S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde

Limitaciones
-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede
variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede
afectar la visualización azul de un resultado positivo.
-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del
mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de
inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier
arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medio

Medio preparado: verde.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
 SANGRE AGAR BASE

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de

numerosos microorganismos.
Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y
cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente
exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la
observación de reacciones de hemólisis.
También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.

Fundamento
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un
alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad
de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-
10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite
detectar hemólisis.

Fórmula (en gramos por litro)

Infusión de músculo de corazón 375.0

Peptona 10.0

Cloruro de sodio 5.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

Instrucciones
Suspender 40 g del polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar
5 minutos y mezclar perfectamente hasta obtener una suspensión
homogénea. Calentar con agitación frecuente y hervir 1 minuto.
Esterilizar 20 minutos a 121°C. Enfriar a 45-50°C agregar sangre
desfibrinada al 5%. Homogeneizar y distribuir en placas.

Preparación de la placa de Agar Sangre: añadir en forma aséptica un

5% de sangre estéril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar
debe estar a 45°C.

Preparación de Agar Chocolate: después de añadir la sangre y agitando

frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80°C por 10 minutos
hasta que adquiera un color pardo chocolatado.
Siembra
Por inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del
medio de cultivo.

Incubación
El tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del
microorganismo que se quiera aislar.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Hemólisis

E. coli ATCC 25922 Abundante --

S. aureus ATCC 25923 Abundante Beta

S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta

S. pneumoniae ATCC 6305 Abundante Alfa

S. pneumoniae ATCC 49619 Abundante Alfa

Limitaciones
-Las reacciones hemolíticas de muchos microorganismos son diferentes
al usar sangre de caballo respecto a la sangre de carnero, tal es el caso
de algunas cepas de estreptococos grupo D, que producen beta
hemólisis en el agar suplementado con sangre de caballo pero no en
agar suplementado con sangre de carnero, y son mal clasificados como
Estreptococos Grupo A al usar sangre de caballo.

Características del medio

Medio preparado: ámbar.
Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
 SABOURAUD GLUCOSADO AGAR

Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de

hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de
levaduras.

Fundamento
Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de
hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel,
pelo, etc.).
En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la
presencia de cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de
hongos por sobre el de bacterias.
Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes
selectivos de crecimiento.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 10.0 Suspender 65 g del polvo por litro de

Glucosa 40.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar
Cloranfenicol 0.05 agitando frecuentemente y hervir 1
minuto hasta disolver. Distribuir y
esterilizar 15 minutos a 118-121°C.
Mantener en lugar fresco, pues la
exposición al calor hidroliza los
Agar 15.0 componentes. Distribuir en placas o
en tubos con cierre hermético

pH final: 5.6 ± 0.2

Siembra
Depende del uso, puede ser tanto en tubo como en placa. Consultar
referencias de métodos recomendados.

Incubación
El tiempo de incubación dependerá del microorganismo que se esté
buscando aislar.
Resultados

Microorganismos Crecimiento

Saccharomyces cerevisiae Bueno

Aspergillus niger Bueno

Candida albicans ATCC 10231 Bueno

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro, ligeramente opalescente sin ningún
precipitado.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación

x 100g :Código: B02- x 500g :Código: B02-

6x50ml: B04-150-84
150-05 150-06
 OXFORD MODIFICADO AGAR BASE
Medio de cultivo, que con el agregado de antimicrobianos, permite el
crecimiento y aislamiento selectivo de Listeria spp.
Fundamento
Medio de cultivo selectivo y diferencial, que contiene los nutrientes
necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano de Listeria spp.
Es diferencial para el desarrollo de Listeria spp, debido a que el
producto de hidrólisis de la esculina en presencia de iones Fe3+ forma
un compuesto fenólico de color negro. La selectividad para Listeria
spp., se obtiene por el agregado del Suplemento Selectivo para Oxford
Modificado Agar Base, debido a que contiene antibióticos que inhiben
total o parcialmente el desarrollo de la flora acompañante presente en
la muestra.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Columbia Agar Base 39.0 Suspender 26.3 g de polvo en 500 ml de

agua destilada. Dejar reposar 5 minutos.
Esculina 1.0
Mezclar y calentar con agitación
Citrato de Hierro y amonio 0.5 frecuente. Llevar a ebullición para
disolución total. Distribuir en recipientes
Cloruro de litio 12.0 apropiados y esterilizar en autoclave a
121 ºC durante 15 minutos.
Enfriar a 50 ºC y agregar asépticamente
el contenido de un vial de Suplemento
Selectivo para Oxford Modificado Agar
Base, reconstituido según instrucciones.
Homogeneizar y distribuir en placas de
Petri estériles.

pH final: 7.2± 0.2

Siembra
Sembrar estriando la superficie del medio.
Incubación
Durante 24-48 horas a 35-37 ºC, en atmósfera con 5-10% CO2.
Resultados

Microorganismos Crecimiento Características de las

colonias

Listeria monocytogenes Bueno Pequeñas, oscuras, con halo

ATCC 19114 oscuro sobre fondo claro

Listeria ivanovii ATCC Bueno Pequeñas, oscuras, con halo

19119 oscuro sobre fondo claro

Escherichia coli ATCC Inhibido -

25922

Enterococcus faecalis Inhibido -

ATCC 29212

Proteus mirabilis ATCC Inhibido -

43071

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación

x 100g :Código: B02-235-05 x 500g :Código: B02-235-06