SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS NANOMATERIALES DE ZnO / PEG

MODIFICADOS CON DOXORRUBICINA Y SU ACCIÓN FOTODINÁMICA

RESUMEN

El objetivo de este estudio es investigar una nueva estrategia de aplicación combinada

de nanoesferas de ZnO / PEG con el fármaco anticanceroso de la doxorrubicina (DOX)
en la terapia fotodinámica (TFD). Pudimos fabricar nanoesferas de ZnO / PEG como el
portador de fármacos de DOX en el sistema de administración de fármacos. La
combinación de nanocompuestos de DOX-ZnO / PEG indujo la mejora notable en la
actividad antitumoral, que se ha demostrado por la actividad antibacteriana, la
liberación del fármaco y el estudio de escisión del ADN. Además, el posible
mecanismo fue explorado por estudios espectroscópicos ópticos y EPR - técnica de
trampa de espín. Se observó que la actividad fotodinámica del nanocompuesto ZnO /
PEG cargado con DOX no citotóxico podría aumentar considerablemente la lesión
celular cancerosa mediada por especies de oxígeno reactivo (ROS) bajo irradiación
UV. En nuestras observaciones demostramos que la nanoesfera de ZnO / PEG podría
obviamente aumentar la concentración intracelular de DOX y aumentar su potencial
eficacia antitumoral, lo que indica que la nanosfera de ZnO / PEG podría actuar como
un portador eficiente de administración de fármacos que implique DOX en células
cancerosas diana. Casi el 91% del fármaco cargado se liberó dentro de las 26 h de
incubación de los conjugados in vitro en un ambiente ácido. Sugiere que existe una
liberación de fármaco e fi caz de DOX a partir del nanocompuesto DOX-ZnO / PEG. La
DOX cargada en nanomateriales de ZnO / PEG mostró actividad antibacteriana más
pronunciada con bacterias Gram-positivas que Gram-negativas bajo luz visible. Los
nanocompuestos DOX-ZnO / PEG fueron efectivos contra las líneas celulares HeLa en
condiciones in vitro y fotocleavage de DNA. Este resultado indicó que los
nanomateriales de ZnO / PEG se pueden usar como nanovehículo para el sistema de
administración de fármacos para PDT.

1. INTRODUCCIÓN

PDT es una nueva modalidad prometedora para el tratamiento del cáncer porque
promete una mejor selectividad para el tumor que sea accesible a la luz y baja
toxicidad sistémica con menos efectos secundarios en comparación con la radioterapia
y la quimioterapia [1,2]. Utiliza el hecho de que ciertos compuestos llamados
fotosensibilizadores (PS), cuando se exponen a la luz de longitud de onda específica,
son capaces de generar oxígeno singlete (1O2) para matar bacterias [3] y células
cancerosas [4,5].

Muchas investigaciones se centraron en la actividad fotocatalítica ventajosa del ZnO a

escala nanométrica en biomedicina, y se ha informado que los nanomateriales de ZnO
tienen un efecto de destrucción de células significativo in vitro por los efectos
fotocatalíticos [6-8]. Sin embargo, todavía existen algunos inconvenientes para las
nanoestructuras de ZnO en el uso clínico, como la alta concentración y la baja
eficiencia. Por lo tanto, es necesario modificarlos con otras moléculas como
modalidades combinadas de terapia del cáncer que pueden superar la insuficiencia de
la eficiencia de la modalidad única y mejorar el resultado de la lucha contra el cáncer.
Con la iluminación UV, el nanocompuesto DOX-ZnO / PEG puede generar oxígeno
singlete y otras especies de oxígeno reactivo (ROS), lo que posibilita la aplicación de
fotoinactivación de células bacterianas y células tumorales. Varias nanopartículas
como un nanovehículo, como los conjugados de polímeros, las micelas poliméricas y
los liposomas se utilizan como nanovehículo para administrar varios agentes
anticancerígenos en el tumor de forma pasiva [9,10]. Sin embargo, es más eficaz, pero
hay una falta de sistema de orientación activo. Nuestros resultados revelan una
localización dual del fotosensibilizador (DOX-ZnO / PEG nanocompuesto), fuera (unido
a la pared celular) e interior (unido a los ácidos nucleicos) de la célula. Ese
fotosensibilizador genera oxígeno singlete e inactiva en ambos lados (exterior e
interior) de la célula bacteriana y célula tumoral.

En vista de estas investigaciones, nos inspira naturalmente explorar la posibilidad de

que los nanomateriales fotodinámicos carguen agentes quimioterapéuticos como
estrategia en la terapia contra el cáncer [11]. Para demostrar este concepto, DOX, un
agente quimioterapéutico de uso frecuente conocido por causar daño celular e inducir
apoptosis y muerte celular [12] y el DOX se cargó en la superficie de la nanoesfera de
ZnO / PEG como sistema de administración de fármacos. Por lo tanto, los
nanocompuestos de ZnO / PEG podrían no solo aplicarse como el transportador de
fármacos para administrar DOX en las células cancerosas, sino también la eficiencia
de la nanoesfera de ZnO para la sinergia de PDT podría inducir una mejora notable en
la actividad antitumoral. Por lo tanto, en el estudio pertinente, hemos preparado y
caracterizado inicialmente la nanoesfera de ZnO / PEG, luego la encapsulación de
doxorrubicina (DOX) en la superficie del nanotransportador de ZnO / PEG puede
obviamente aumentar la concentración de nanocompuesto DOX-ZnO / PEG y
aumentar su eficacia contra el cáncer.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales

El sulfato de cinc (ZnSO4), el bicarbonato de sodio (NaHCO3), el polietilén glicol

(PEG), el etanol y la azida sódica se compraron en productos químicos SD, India. La
doxorrubicina (DOX) se compró a Himedia. Se obtuvieron 2,2,6,6-tetrametil piperidinol
(TEMPL) y DMSO de Merck, India. Se adquirieron bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)
-2,5-difeniltetrazolio (reactivo MTT), suero bovino fetal (FBS) de sigma químico. Medio
esencial mínimo (MEM) se obtuvieron de Aldrich. Todos los demás compuestos se
usaron tal como se recibieron.

2.2. Síntesis de PEG con nanomateriales de ZnO

ZnSO4 7H2O (1 M) se disolvió en agua destilada. Mientras tanto, la solución de PEG

600 se preparó disolviendo 100 mg en 20 ml de agua destilada y se añadió a la
solución de ZnSO 7H O. Se preparó NaHCO (2 M) por separado y se añadió gota a
gota a la solución de ZnSO4 anterior bajo agitación constante. Después de agitar a
temperatura ambiente durante 2 - 3 h, los precipitados formados se filtraron, se lavaron
con agua destilada y etanol y finalmente se secaron en un horno de aire caliente a
80ºC para obtener nanopartículas de ZnO modificadas con PEG. Las nanopartículas
de óxido de zinc se sintetizaron de acuerdo con nuestro informe anterior con la
modificación del polímero [13].
2.3. Preparación del nanomaterial de ZnO / PEG modificado en superficie por
sensibilizador (DOX)

La cantidad requerida de nanomateriales de ZnO / PEG se dispersó por sonicación en

20 ml de agua para formar una solución coloidal. La cantidad de doxorrubicina añadida
al nanotransportador de ZnO / PEG usando etanol mientras se agitaba continuamente,
el peso de DOX era un décimo del peso del nanovehículo de ZnO / PEG
(nanomateriales de relación DOX: ZnO / PEG 1:10). La reacción se llevó a cabo a
temperatura ambiente durante 48 h. El nanotransportador de ZnO / PEG cargado con
DOX se secó a continuación a 50 ° C durante 24 h. Para determinar la DOX libre, la
solución centrifugada se recogió y se diluyó a 100 ml con agua desionizada en un
matraz de capacitancia. El peso de doxorrubicina libre (Wfree DOX) en la solución se
determinó por medición de absorción UV-visible. La cantidad de DOX se determinó
mediante absorción UV-visible a 481 nm. Se preparó una solución estándar de agua
DOX (1,0 mg / 100 ml) para el análisis cuantitativo. La eficiencia de carga y
encapsulamiento DOX se calculó de la siguiente manera:

2.4. Caracterizaciones de materiales

Las muestras se caracterizaron por difracción de rayos X en polvo (XRD) utilizando

PAnalytical X 'por difractómetro de rayos X PRO con radiación Cu Kα. Las imágenes
del microscopio electrónico de barrido (SEM) se realizaron con un HITACHI Modelo S-
3000H. Las imágenes del microscopio electrónico de transmisión (TEM) se tomaron en
un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2 20 STWIN de alta resolución.
Los datos UV se obtuvieron utilizando el espectrofotómetro de haz doble UV-visible
JASCO V-530. Los datos espectrales de IR se obtuvieron utilizando el
espectrofotómetro Perkin Elmer FT-IR 1725x. La fotoluminiscencia se midió usando el
espectrofluorómetro JASCO FP-6500.

2.5. Fuente de luz

La fuente de luz utilizada para la irradiación era una lámpara de vapor de mercurio de
media presión de 150 W y una lámpara de halógeno de tungsteno (Heber Scientific,
Chennai). Se utilizó una combinación de filtro de solución de yoduro de potasio de 10
cm (1 g en 100 ml) y piridina de 1 cm para cortar por debajo de 300 nm y lograr una
ventana espectral de 300-700 nm. La irradiación se llevó a cabo generalmente en una
cubeta abierta, en equilibrio con la atmósfera. La mezcla de reacción en una cubeta de
cuarzo colocada a una distancia de 12 cm de la fuente de luz se agitó continuamente
durante la irradiación.
2.6. Detección de oxígeno singlete mediante ensayo óptico

El método de blanqueo RNO se utilizó para determinar el oxígeno singlete ( 1O2) que
generaba e fi ciencia [14]. La suspensión del nanovehículo se irradió en presencia de
imidazol (10 mM) y RNO (50 mM) en un tampón de fosfato 50 mM (pH = 7,4). La
formación de 1O2 se controló fotométricamente siguiendo el blanqueo de RNO a 440
nm con el intermedio de peróxido transanular formado a partir de la reacción entre 1O2
fotogenerado e imidazol. La mezcla de reacción en una cubeta espectrométrica de 1
cm, colocada a una distancia de 12 cm, se irradió de forma continua utilizando un láser
de 632,8 nm.

2.7. Detección de oxígeno singlete por técnica de atrapamiento de espín EPR

Se utilizó un espectrómetro JEOL JES-TE100 de banda X para mediciones de EPR.

Se establecieron los siguientes parámetros para las mediciones: potencia de
microondas, 10 mW; amplitud de modulación, 0,01 mT; frecuencia de modulación, 100
kHz. La detección de 1O2 por EPR también se utilizó como un método alternativo para
determinar la fotogeneración de 1O2 por nanocompuestos de ZnO / PEG. El
experimento EPR-TEMPL se llevó a cabo para nanocompuestos RB, ZnO / PEG en
condiciones idénticas. La mezcla de reacción (1 ml) que contenía TEMPL 0,02 M y
sustrato 0,1 mM en DMSO se irradió y se siguió el aumento en la intensidad de la
señal EPR en función del tiempo (Esquema 1). Las muestras se inyectaron en un tubo
capilar de Teflon permeable al gas (0,8 mm de diámetro interno, 0,5 mm de espesor
de pared) que se dobló e insertó en un tubo de cuarzo estrecho y se colocó en la
cavidad EPR para las mediciones [15].

2.8. Estudios antibacterianos

La actividad bactericida de los nanocompuestos DOX-ZnO / PEG se ensayó usando

estudios de inhibición del crecimiento frente a Gram-negativos tales como Escherichia
coli (E. coli KCCM 11234) y bacterias Gram-positivas tales como Staphylococcus
aureus (S. aureus KCCM 12256). Los microorganismos (E. coli y S. aureus) se
cultivaron en un caldo de cultivo LB esterilizado y luego se incubaron durante la noche
a 37 °C con un incubadora de agitación. La concentración de E. coli y S. aureus fue de
105 CFU ml-1. Para investigar los rendimientos antibacterianos de Nanomateriales ZnO
/ PEG y nanocompuestos DOX-ZnO / PEG en la oscuridad y bajo irradiación con luz
visible, nanomateriales idénticos ZnO / PEG y nanocompuestos DOX-ZnO / PEG (a 0,
2, 4, 6 μg/ml concentración ) se tomaron primero en una placa de Petri esterilizada
mediante la adición de 40 ml de agua DI autoclave. Luego se añadió 1 ml de solución
bacteriana bien cultivada a la placa de Petri. Para cada material (nanomateriales de
ZnO / PEG o nanocompuestos de DOX-ZnO / PEG), se colocó una placa de Petri en la
oscuridad, y la otra se colocó bajo una luz visible. Después de 10 min. Se extrajeron
0,2 l de sobrenadante de las placas de Petri y se extendieron sobre placas de
nutrientes de agar bien solidificadas. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, las
colonias se midieron [16]. Los experimentos se repitieron al menos tres veces y se
promedió el valor.
2.9. Respuesta de liberación de fármaco in vitro

La respuesta de liberación del fármaco del nanovehículo cargado con DOX en ZnO /
PEG se estudió a la temperatura fisiológica de 37 ° C y a pH diferente (pH = 5.0, pH
aproximado en endosomas o lisosomas, pH = 6.0, pH del entorno alrededor del tumor
y pH = 7.4, pH de la sangre fisiológica). La solución tampón con diferente pH se
preparó usando tampón acetato (pH de 5,0 y 6,0) y solución de tampón fosfato (pH
7,4). En cada experimento, se sellaron 2,0 mg del portador del fármaco en un tubo de
membrana de diálisis. El tubo de diálisis se sumergió en 10 ml de tampón de acetato
(pH de 5,0 y 6,0) y tampón de fosfato (pH de 7,4) y se colocó en un tubo de ensayo
con un tapón más cercano. El tubo de ensayo con el más cercano se colocó en un
baño de agua mantenido a 37 ° C. A intervalos de tiempo seleccionados (cada 2 h
hasta 26 h) se tomó el medio de liberación para análisis de absorción UV-visible (481
nm) y se reemplazó con solución tampón nueva y se midió la absorbancia para
calcular una concentración de soluciones de doxorrubicina liberadas para una curva
estándar. Todos los experimentos de liberación de fármaco se repitieron al menos tres
veces.

2.10. Citotoxicidad in vitro

El efecto citotóxico de ZnO / PEG, DOX libre y DOX-ZnO / PEG nanocompuestos se

determinó mediante ensayo de colorante de metil tiazol tetrazolio (MTT), según lo
descrito por Mosmann [17]. El ensayo se llevó a cabo por triplicado de la siguiente
manera. Para el ensayo MTT, las células HeLa se sembraron en placas de 96 pocillos
a una densidad de 5x103 células bien-1 en 100 μl de MEM que contenía 10% de FBS.
Las células que alcanzaron un 70-80% de con fl uencia después de las 24 h fueron.
Después de 24 h, se eliminaron ZnO / PEG, nanocompuestos de DOX y DOX-ZnO /
PEG libres en el medio y se añadieron 50 lL de MTT (2 mg / ml en MEM) y 200 uL de
medio y se incubaron durante 24 h en crecimiento normal condiciones Cuatro horas
después, se retiró MTT y se añadieron 150 ml de DMSO en cada pocillo y se midió la
absorbancia a 570 nm usando una absorción UV-visible. Los grupos de control se
cultivaron en las mismas condiciones sin adición de nanocompuestos de ZnO. La
viabilidad celular se determinó como porcentaje usando la siguiente ecuación: