Practica #9

Enzimas microbianas
Introducción
Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones químicas en los seres vivos . Las enzimas
son catalizadores, es decir, sustancias que , sin consumirse en una reacción , aumentan su
velocidad

Son biocatalizadores pero también pueden considerarse como aditivos altamente específicos para
aplicaciones en alimentos
Las Enzimas bacterianas pueden clasificarse según su lugar de acción en: ENDOENZIMAS y EXOENZIMAS. las
endoenzimas son aquellas enzimas que actúan en el interior de la célula, Ej. oxidasas, reductasas y
transaminasas. las exoenzimas son enzimas que siendo también sintetizadas en el interior de la célula para
ejercer su función deben ser exportadas al medio extracelular en bacterias Gram positivas y al espacio
periplasmico en la bacterias Gram negativas. Su función principal es degradar macromoléculas, las que por
su tamaño, no atraviesan las capas superficiales de la célula procariota. Ej. proteasas, lipasas.

 Industrias azucarera, textil y papelera:

 Industria de detergentes:
 Industria farmacéutica:
 Biología molecular:
 Industria minera:
 Industria del reciclaje

Las enzimas han sido empleadas en la industria desde hace muchos años. Para la producción de
estas enzimas, la selección del microorganismo debe cumplir aspectos como :

El microrganismo no debe ser patógeno , ni asociado con la producción de toxinas , por esta razón
un gran número de enzimas comerciales son producidas por A.niger , A.oryzae , B.subtilis
(Garibay, Ramírez, & Canales, 1993)

En principio es preferible que la enzima sea producida extracelularmente.

La enzima debe ser producida con altos rendimientos, por lo que en general, el desarrollo del
microorganismo implica algún tipo de mutación clásica

El costo de producción debe ser razonable, lo que implica que el microorganismo puede crecer
rápidamente , en sustrato grado industrial

También hay que considerar que hay factores que influyen en la producción de enzimas
microbianas como :

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Uso eficiente de nutrientes del medio de cultivo

Producción de enzimas microbianas “de origen vegetal o animal “

Sobreproducción de enzimas mediante el incremento del número de genes que codifican para sus
síntesis

Mayor tolerancia a p H , modificación de especifidad , resistencia a la inhibición por iones

Algunos ejemplos de definición de actividad enzimática basada en una consecuencia de la acción

de la enzima

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Procedimiento
Exoenzimas

1. Sembrar una sola estría de Escherichia coli en un extremo y Bacillus subtilis

en el otro , tanto sobre la placa con agar almidón como en la de agar leche.
2. Incubar las placas a 37ºC por 48 horas.
3. Al terminar la incubación bañe la superficie de la placa de agar almidón con
la solución diluida de lugol. Observe la reacción del lugol con el almidón y la
reacción en las áreas cercanas a las zonas de crecimiento microbiano.
4. Observe las placas de agar leche y los cambios ocurridos alrededor del
crecimiento microbiano.
5. Examine ambas superficies de las placas y anote sus observaciones

Endoenzimas
a) Método del Papel Filtro: En Caldo Triptosa o Caldo Peptonado se cultivan bacterias
productoras de H2S por 24 a 48 hrs., colocándose luego una tira de papel filtro
impregnada con SUBACETATO DE PLOMO en solución acuosa saturada. Si la bacteria
forma H2S el extremo distal del papel se tornará de color negro, si es negativo el papel
permanecerá blanco.

1.- Sembrar cada cepa en caldo triptosa o caldo peptonado.

2.- Colocar en cada tubo la tira de papel filtro con la sal de plomo en igual forma que para
la prueba del Indol.
3.- Incubar a 37°C durante 24 a 48 hrs.
4.- Retirar ambos cultivos de la incubadora.

b) Método de SIM (Medio Semisólido): Es un medio semisólido que lleva incorporado

sales metálicas; después de 24 a 48 hrs. de incubación el medio se teñirá de color negro
por la elevada producción de H2S. Este producto se evidencia por el ennegrecimiento del
medio en presencia de ciertas sales de metales pesados: plomo, hierro, bismuto y otros,
formándose sulfuros.
1.- Sembrar por puntura la cepa de E. coli, Salmonella typhi o Proteus vulgaris.
2.- Incubar a 37°C durante 24 a 48 hrs.
3.- Retirar ambos cultivos de la incubadora.

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 Resultados y discusión
1. Estudio de Exoenzimas: Hidrólisis del Almidón.

Se realizaron las siembras de cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli en una placa de Petri con
agar almidón. Tras una incubación de 3 o 4 días a 37°C se revisó la placa y tras evidenciar crecimiento
en ella se adicionó lugol hasta sumergir toda la superficie, obteniendo el siguiente esquema:

Imagen 1. Hidrolisis del almidón E.coli

(control negativo ) el lugol vira a azul
intenso en sus totalidad .B.subtilis
(control positivo)zonas claras sin virar
a azul alrededor del crecimiento
microbiano hasta donde el almidón es
atacado

Lugol

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 Se pudo determinar que B. subtilis puede metabolizar el almidón realizando una hidrólisis total
(evidenciado por las zonas claras sin virar), por lo que se puede decir que esta cepa cuenta con las
exoenzimas α-amilasa (para la degradación parcial del almidón a dextrina) y β-amilasa (para la
degradación total de dextrina a maltosa). Por otro lado, E. coli no poseería estas enzimas ni otras
semejantes puesto que no presentó hidrólisis alguna del almidón y por ello viró a azul intenso (al
reaccionar con la fracción amilosa del almidón como tal).

2. Estudio de Exoenzimas: Hidrólisis de la Caseína.

Se realizaron las siembras de cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli en una placa de Petri con
agar leche. Tras una incubación de 3 o 4 días a 37°C se revisó la placa y tras evidenciar crecimiento
se observó el cambio del medio alrededor del crecimiento microbiano evidenciándose que no todo
el agar leche seguía siendo opaco, según el esquema:

Imagen 2. Hidrolisis de la Caseína .E.coli

(control negativo ) mantiene opacidad del
medio y no presenta halo alrededor del
crecimiento . B.subtilis ( control positivo )
muestra zonas translucidas en halos
alrededor del crecimiento

Se pudo determinar que B. subtilis puede metabolizar la caseína, por lo que se puede decir que esta
cepa cuenta con la exoenzima caseinasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta enzima ni otras
semejantes puesto que no presentó hidrólisis de la caseína.

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3. Estudio de Endoenzimas: Producción del Ácido Sulfhídrico (H2S) y
Liberación de Indol.
Se realizaron las siembras por punción Salmonella typhi y Escherichia coli en tubos de ensayo con
medio semisólido siguiendo el método de SIM (Sulfuro Indol Movilidad). El método de SIM permite
evaluar la producción de ácido sulfhídrico, pues contiene sales de plomo (subacetato de plomo), la
liberación de indol al agregar el reactivo de Ehrlich . Se obtuvo:

Imagem 3. Método de SIM .E.coli (control negativo) para la producción de ácido sulfhídrico , pues
no hubo coloración negra ni crecimiento fuera de la punción del sembrado ; control positivo para
la liberación del indol por el halo de color rojo . Salmonella typhi (control positivo) para la
producción de ácido sulfhídrico , por la coloración negra y crecimiento fuera de la punción del
sembrado ; control negativo para la liberación de indol por halo incoloro

Método de SIM : producción de H2S y/o indol

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 Método del papel filtro : se aprecia un extremo del papel de color oscuro ,
producto de la reacción de H2S

Se pudo determinar que Salmonella typhi puede reducir la cistina a dos cisteína produciendo ácido
sulfhídrico (H2S) (por la tinción negra) por lo que se puede decir que esta cepa cuenta con la
endoenzima cistina reductasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta endoenzima ni otras
semejantes puesto que no presentó pigmentación negruzca. Además se vio la gran motilidad de
S.tiphi que evidenció crecimiento en todo el medio semisólido, más allá de la punción del sembrado;
lo que no ocurrió para E. coli. Finalmente, tras agregar el reactivo de Earlich se pudo determinar
que E. coli puede metabolizar el triptófano liberando indol (por el halo rosa en la superficie) por lo
que se puede decir que esta cepa cuenta con la endoenzima triptofanasa; mientras S.typhi no
poseería esta endoenzima ni otras semejantes por la presencia de un halo transparente.

4. Estudio de Endoenzimas: Metabolismo del Citrato de Sodio

Se realizaron las siembras por estriado de Enterobacter aerogenes y Escherichia coli en tubos de
ensayo con agar citrato de Simmmons, el cual consta de agar, sales, la única fuente carbonada
(citrato de sodio) y el indicador azul de bromotimol (que virará a azul intenso de presentarse un
medio alcalino por la presencia de carbonato de sodio producido de la liberación de CO2 propio de
la respiración celular). Se obtuvo:

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Imagen 4. Utilización del citrato de Simmons E.coli es control negativo para
el metabolismo de citrato , pues no hubo viraje a azul intenso por reducción
del ph . E.enterobacter es control positivo para el metabolismo de citrato ,
pues hubo viraje a azul intenso , lo que evidencia reducción de ph por la
liberación de dióxido de carbono , y su posterior conversión a carbonato de
sodio ( básico )

Se pudo determinar que E. aerogenes puede metabolizar el citrato

produciendo dióxido de carbono y posteriormente carbonato de sodio (por el viraje a azul) por lo
que se puede decir que esta cepa cuenta con la citrato liasa. Por otro lado, E. coli no poseería esta
endoenzima ni otras semejantes sin embargo en la práctica se observó una coloración azul igual en
E. aerogenes lo cual evidenciaría un posible contaminante en la muestra