INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO N°2

1.-TITULO:

“USO DEL BIOREACTOR AÉROBICO”.

2.-INTRODUCCION:
En un proceso biotecnológico es deseable el aumento en la población de
microorganismos (biomasa) o la formación de un producto secundario hechos
por los microorganismos. Para que haya crecimiento de biomasa o formación de
un producto, es necesario que los microorganismos cuenten con las condiciones
ambientales óptimas para su desarrollo.

Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente

biológicamente activo. En él se lleva a cabo un proceso químico que involucra
organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos
organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Un biorreactor
puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células
o tejidos en operaciones de cultivo celular.

Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a

cabo en un recipiente llamado fermentador o biorreactor, mediante el cual
determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transforma dos
por acción microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo va
aumentando en su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo
que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como
consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas.

A continuación se analizará la producción de biomasa (levaduras) a partir de

un bioreactor tipo batch colocando como sustrato mosto de la uva (fuente de
sacarosa) e inoculando la levadura Saccharomyces cerevisiae.
3.- FUNDAMENTO TEORICO:

3.1. Bioreactor:
Un bioreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biológicamente activo. En algunos casos, un bioreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias
bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede
ser aeróbico o anaeróbico. Estos bioreactores son comúnmente cilíndricos,
variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son
usualmente fabricados en acero inoxidable.

En términos generales, un bioreactor busca mantener ciertas condiciones

ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al
organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de
entrada y salida, la operación de un bioreactor puede ser de tres modos
distintos:

1. Lote (Batch): también llamado discontinuo. Por lotes o tandas, sin

alimentación (F); se coloca dentro del bioreactor la carga total de cada
proceso (tanda o lote) de cultivo o fermentación y se dejar que se lleve a
cabo el proceso productivo o la fermentación por el tiempo que sea
necesario; el cuál se denomina tiempo de retención.

2. Lote alimentado (Fed-Batch): también llamado semicontinuo. por lotes

alimentados, con alimentación de entrada (F1); se alimenta una línea de
entrada o alimentación (F1) para que el sistema de cultivo tenga un
producto (biomasa) con máximo de crecimiento (exponencial) y aumente
la productividad.

3. Continuo o quimiostato: se alimenta una línea de entrada F1 o

alimentación y se drena una línea de salida F2 o lavado; de manera que
los flujos o caudales de ambas líneas sean iguales y la producción sea
contínua.
Bioreactores y tipos de cultivo:

Los sistemas biológicos que determinan el metabolismo celular de cultivo y el

modo procesal-biológico del sistema son:

 Células y microorganismos anaeróbicos

Bacterias en su gran mayoría, son microorganismos de metabolismo

degradativo (catabólico); generalmente unicelulares, estos microorganismos son
autónomos y nutricionalmente independientes (autótrofos); sus células
(cuerpos) no respiran (no utilizan la glucólisis para la respiración celular), en
cambio, utilizan vías alternas, donde una molécula orgánica, producida durante
el proceso metabólico (catabolismo), es utilizada como aceptor de electrones, en
un proceso bioquímico conocido como respiración oxidativa; esta molécula es
reducida a producto orgánico en un proceso comúnmente denominado
fermentación.

 Células y microorganismos facultativos

Son ambivalentes, tienen la capacidad de vivir o sobrevivir entre ambientes:

aeróbico (presencia de oxígeno) y anaeróbico (ausencia de oxígeno); son
microorganismos de metabolismo mixto por lo que, pueden tanto degradar
(catabolismo) como construir (anabolismo) materia orgánica, a partir de
diferentes sustratos (materia prima), tanto orgánicos como inorgánicos. Pese a
su versatilidad, sus mayores representantes son microorganismos que
presentan relaciones parásitas o simbiontes tales como: hongos y levaduras, por
lo que no son muy extensos.

 Células y microorganismos aeróbicos

Pertenecen en su mayoría al Reino Eucariota – pero también los hay procariota

– son microorganismos y células que respiran (utilizan la glucólisis como forma
de respiración celular); por lo que su metabolismo es constructivo (anabólico) y
deben obtener sus nutrientes de diferentes fuentes.
Sus principales grupos están representados por: bacterias y microorganismos
aeróbicos, plantas y animales; cuyas células se puedan cultivar en suspensiones
celulares o bien, en diferentes arreglos artificiales o modificadas

Bioreactor de columna de burbujas o “bubble bed”:

Este tipo de bioreactor carece de un

sistema de transmisión mecánica para
mezclar el caldo de cultivo. El mezclado
se realizar por la inyección de aire a
sobrepresión en el líquido desde el fondo
del recipiente, al dispersarse el aire en
burbujas y al ascender causan la
turbulencia del líquido. Generalmente la
relación altura/diámetro es mayor a 3. Si
las columnas son grandes se pueden
emplear platos perforados colocados en
posiciones intermedias de las mismas
para “redispersar” las burbujas de gas. El
producto se puede sacar del bioreactor en
la corriente gaseosa.

Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y

mantenimiento de este tipo de bioreactores son más económicos que cualquier
otro tipo. Quizá el mayor gasto de operación sea el de compresión de aire, en
razón de los altos flujos requeridos. Generalmente se emplean para
fermentaciones de baja viscosidad.

Las columnas de burbujas se utilizan industrialmente para la producción de

levadura de panadería, cerveza y vinagre y en el tratamiento de aguas
residuales.

3.2. Fermentación:
La fermentación puede definirse como el proceso metabólico que transforma los
hidratos de carbono (carbohidratos) en alcoholes, ácidos orgánicos, aldehídos o
cetonas con la formación de dióxido de carbono. Esta denominación está dada
sobre la base de las alteraciones que en presencia de levaduras ocurren en los
jugos azucarados de frutas que se transforman en otros compuestos más
estables denominados vinos. Podemos también definir la fermentación como la
oxidación incompleta de carbohidratos, aminoácidos y sustancias similares por
la acción de los mo. La participación de los mo puede requerir O2 (fermentación
aeróbica). La fermentación aeróbica puede llevar la descomposición de los
carbohidratos u otra sustancia fermentable hasta la oxidación completa o sea
hasta obtener dióxido de carbono y agua.

En un proceso aerobio, la transferencia óptima de oxígeno es tal vez la tarea

más difícil de lograr. El oxígeno se disuelve poco en agua (y aún menos en
caldos fermentados) y es relativamente escaso en el aire (20,8 %). La
transferencia de oxígeno usualmente se facilita por la agitación, que se requiere
también para mezclar los nutrientes y mantener la fermentación homogénea.
Sin embargo, existen límites para la velocidad de agitación, debidos tanto al alto
consumo de energía (que es proporcional al cubo de la velocidad del motor)
como al daño ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo de corte
excesivo.

La Fermentación alcohólica se define como el proceso bioquímico por el cual

las levaduras transforman los azúcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la
fermentación se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en
condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen
1g de levadura por cada 4g de azúcar consumidos los productos obtenidos son
muy poco etanol, agua y CO2.

En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentación; es decir

degradan los azúcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energía.
En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura
por cada 100g de azúcares
consumidos.

Tanto levaduras como bacterias han

sido utilizadas para la producción
de etanol. Saccharomyces cerevisiae
es la levadura más comúnmente
utilizada. El Etanol es inhibitorio a
altas concentraciones y la tolerancia
al alcohol de las levaduras es crítica para obtener rendimientos altos.

Factores que influyen en la fermentación alcohólica:

Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o

negativamente en el transcurso de la fermentación alcohólica, ya sea actuando
sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia
fermentación. Los más relevantes son los siguientes:

 TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentación transcurre mas

rápidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos
etanol y más cantidad de compuestos secundarios.Las levaduras a 30°C
tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de 35°C la
actividad disminuye rápidamente y mueren a antes de 45°C.

 OXIGENO: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las

levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxigeno
disuelto en el mosto.

 NUTRIENTES: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras.

3.3. Levaduras:
Las levaduras son cuerpos unicelulares
(generalmente de forma esférica) de un tamaño
que ronda los 2 a 4 μm y que están presentes de
forma natural en algunos productos como las
frutas, cereales y verduras. Son lo que se
denominan: organismos anaeróbicos facultativos,
es decir que pueden desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno. Se puede
decir que el 96% de la producción de etanol la llevan a cabo hongos
microscópicos, diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran
principalmente Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis, Torulaspora y
Zymomonas mobilis.

Una levadura conocida como Saccharomyces cerevisiae es la responsable de la

transformación del azúcar en alcohol, el fenómeno más trascendental en la
producción de vinos. Esta levadura se encuentra en forma salvaje en la
naturaleza y, generalmente, sobre el hollejo de la uva en unas especies de oasis
que se llaman estomates y que están llenos de pequeñísimas gotitas de jugo de
uva.

La mayoría de las levaduras se reproducen por gemación multicelular o por

gemación polar, que es el mecanismo en el cual una porción del protoplasma
sobresale de la pared de la célula y forma una protuberancia, la cual aumenta
de tamaño y se desprende como una nueva célula de levadura.

Aireación

Durante mucho tiempo se pensó que las levaduras eran microorganismos

anaerobios estrictos, es decir, debía realizarse la fermentación en ausencia de
oxígeno. Sin embargo, es un hecho erróneo ya que requieren una cierta
aireación. Esta oxigenación se consigue en los procesos previos a la
fermentación y mediante remontados de aireación en la elaboración de tintos.
Una aireación sumamente excesiva es totalmente absurda ya que, entre otras
consecuencias en el vino, no obtendríamos alcohol sino agua y anhídrido
carbónico debido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aeróbicas,
no utilizan los azúcares por vía fermentativa sino oxidativa, para obtener con
ello mucha más energía.

El efecto Pasteur

Se produce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y

respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la
respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O2 libre en
su medio ambiente. Pasteur fue el primero en observar que el azúcar es
convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en
presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el
principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor
rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación.

3.4. Determinación del número de levaduras:

Para determinar el número o la masa de microorganismos se emplea
suspensiones homogéneas de microorganismos en medios líquidos y se
determina la concentración de células por unidad de volumen de cultivo o
densidad microbiana (células/ml, mg/ml.)

Cuando se determina el crecimiento celular se puede utilizar:

a) El peso húmedo o el peso seco.

b) Determinar el número de células viables extendidas en una película

delgada de una cámara de contaje o cámara de neubauer.

CAMARA DE NEUBAUER:
 La cámara Neubauer, también
conocida como hemocitómetro, consta de
un cubreobjetos de cuarzo y un
portaobjetos de un grosor mayor a los de
uso común.

En la parte superior del portaobjetos se encuentran cuatro canales

longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal
transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a
su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña

Al colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos se tiene una profundidad de

0,1mm, de forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados
grandes será 0,1 mm3 (1,0 mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3).

Ventajas del método: Desventajas del método:

Es rápido La cantidad de muestra analizada es poca

Los frotis se pueden guardar Provoca cansancio del operador

Las exigencias de equipo son Sólo sirve para muestras con cargas superiores a
mínimas 10.000 por mL.

Se pueden observar las diferentes

Es difícil distinguir los microorganismos de las
morfologías de los
partículas de muestra
microorganismos.
 Se observan tanto los Una inadecuada distribución de la muestra sobre
microorganismos viables como los la superficie del portaobjetos puede ocasionar
no viables serios errores.

4.-OBJETIVOS:
 Determinar el aumento del número de levaduras en un bioreactor tipo
Batch utilizando como sustrato el mosto de la uva y aplicando oxígeno.
 Determinar la velocidad de consumo del azúcar presente en el mosto de
uva.

5.- MATERIALES Y EQUIPOS:

 Mosto de uva.
 Tubos con cultivo de levaduras.
 Cámara de Neubauer.
 Microscopio
 Micropipeta.
 Solución de azul de metileno.
 Refractómetro
[

6.- PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DEL BIOREACTOR

Conectar todos los elementos del bioreactor

como la bomba para producir burbujas de aire
a través de una manguera que une y llega hasta
la parte inferior del bioreactor.

Añadir el mosto de uva en el bioreactor ya

esterilizado hasta que llegue a un punto inferior de la llave de toma de muestra.

Después inocular las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae en el mosto

de la uva. Mezclar moderamente.
Luego tapar
herméticamente el bioreactor con la tapa de poroflex.

Finalmente encendemos la bomba o aireador para que comience el burbujeo

dentro del bioreactor y homogenice de manera eficiente el mosto y el inoculo
añadido al equipo.

Esperar unos minutos para extraer una muestra del mosto de uva inoculado
para contar el número inicial de levaduras y ver la concentración de azúcar
inicial. Estos dos parámetros se medirán en el transcurso de dos semanas.

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE LEVADURAS POR CONTAJE

MICROSCOPICO

En un vaso pequeño tomar 10-20 ml de jugo del reactor

en funcionamiento.

Aspirar jugo con la micropipeta hasta la marca 0.5 y

limpiar cualquier exceso con algodón o papel de filtro.

Llenar la pipeta con la solución de azul de metileno

hasta 11. La dilución es 1/20. Todos estos pasos de diluir y medir deben ser
realizados con el máximo de exactitud.
 Taponar con los dedos los extremos de la
micropipeta y mezclar el contenido muy
cuidadosamente.

El recuento debe hacerse tan pronto como sea

posible después de realizar la dilución y si esto no es
posible, debe agitarse nuevamente antes del
recuento ya que las levaduras tienden a decantar
dentro de la micropipeta.

Poner en contacto una gota, en el borde del cubre objeto que se ha colocado
sobre la cámara de manera que el liquido difunda por debajo, llenando la
cámara.

Colocar la cámara de bajo el microscopio y localizar el campo con un pequeño

aumento, pasando después a un aumento mayor (400X).

Contar las células en los 4 cuadrados de 1mm2 de las esquinas y luego sumarlos.

Repetir todo este procedimiento después de 2 horas de incubación y determinar

el incremento del número de levaduras. Luego cada día se repetirá el proceso.

Calcular el número promedio de levaduras. Las dimensiones de la cámara y el

grado de dilución, constituyen la base del cálculo.
Como las levaduras se van contando en cuatro mm
cuadrados, la altura de la cámara es de 0.1 mm; el
grado de dilución es de 1/20; para el cálculo de
levaduras/mm3 se efectuará la siguiente operación:

N/4 * 20* 10

Donde: N: Numero de levaduras contadas en los

4 mm2