Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva (2004), 54, 721-725DOI 10.1099 / ijs.0.

02800-0

boliviensis Halomonas sp. nov., una halófila

Correspondencia
Jorge Quillaguama'n
Jorge.Quillaguaman@biotek.lu.se
alkalitolerant, moderada aislado del suelo
alrededor de un lago hipersalina boliviana
Jorge Quillaguama'n,1,2 rajni Hatti Kaul,1 Bo Mattiasson,1
María Teresa Álvarez1,3 y Osvaldo Delgado13
1
Departamento de Biotecnología, Centro de Química e Ingeniería Química,
Universidad de Lund, PO Box 124, SE-221 00 Lund, Suecia
2
Centro de Biotecnolog'ıa, Facultad de Ciencias y Tecnolog'ıa, Universidad Mayor de
San Simo'n, Cochabamba, Bolivia
3
Instituto de Investigaciones Fármaco Bioqu'ımicas, Universidad Mayor de San Andre's,
La Paz, Bolivia

boliviensis Halomonas sp. nov. se propone para dos bacterias moderadamente halófilos,
psicrófilos, alkalitolerant, LC1T (= DSM 15516T = ATCC BAA-759T) y LC2 (= DSM 15517 =
ATCC BAA-760), ambos de los cuales fueron aisladas de una muestra de suelo alrededor
del lago Laguna Colorada , que se encuentra a 4300 metros sobre el nivel del mar en la
región sur-oeste de Bolivia. Las bacterias son varillas aeróbicos, móviles, Gram-negativas
que producen colonias con un pigmento de crema. Además, son heterótrofos que son
capaces de utilizar diversos hidratos de carbono como fuentes de carbono. Los organismos
reducir nitrato y muestran una actividad desaminasa triptófano. El contenido de ADN
genómico G + C eran 51? 4% mol para LC1T aislado y 52? 6% mol para LC2 aislado.
Basado en el análisis de secuencia de 16S rDNA, aislamientos LC1T y LC2 se identificaron
como miembros del género Halomonas y agrupan estrechamente con Halomonas variabilis
DSM 3051T y Halomonas meridiana DSM 5425T. Sin embargo, la relación de ADN-ADN
entre los nuevos aislados y
La especie más cercana relacionada Halomonas fue baja.

boliviensis de otras especies y micrografías de H. boliviensis cepas

Durante la última década, amplios estudios de ambientes
Halomonas están disponibles como material complementario en
hipersalinos en diferentes ubicaciones geográficas han IJSEM Online.
conducido al aislamiento y caracterización de un gran
número de especies moderadamente halófilos (Ventosa et
al, 1998;. Oren, 2002).
Muchas bacterias Gram-negativas, halotolerant o halófilos
especies están actualmente incluidas en la familia
Halomonadaceae, que pertenece a la c-subclase de las
proteobacterias. Entre los géneros que comprenden esta
familia, Halomonas cubre el mayor número de especies (>
20) con características heterogéneas y recientemente se ha
distinguido en dos grupos filogenéticos, basado en las
secuencias de 16S y 23S ADNr

Publicado en línea delante de la impresión el 21 de noviembre de

2003, DOI 10.1099 / ijs.0.02800-0.
Dirección 3Present: PROIMI-CONICET, Av. Belgrano y Pasaje, Caseros,
4000 Tucuma'n, Argentina.
Los números de acceso GenBank / EMBL / DDBJ para las
secuencias de ADNr 16S de los aislados LC1T y LC2 son
AY245449 y AY245450, respectivamente.
Una tabla que muestra características diferenciales de H.
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de las diferentes especies (Arahal et al., 2002). También contienen concentraciones de sal en el rango de 10-103 g
se ha observado que el género Halomonas tiene una l21 (Hurlbert y Chang, 1988).
inusualmente amplia gama de contenido de ADN G + C,
Este estudio describe la caracterización e identificación de
de alrededor de 52-68% en moles (Arahal et al., 2002).
dos cepas, LC1T y LC2, que pertenecen al género
Hemos aislado una serie de organismos moderadamente
Halomonas y se aislaron a partir de una muestra de suelo
halófilos de la región sur-oeste de Bolivia, que se
alrededor de Laguna Colorada (lago de color rojo), un gran
encuentra entre los rangos oriental y occidental de los
poco profunda, laguna, hipersalinos que se encuentra 4.300
Andes de América del Sur. Gran parte de esta región se
m sobre el nivel del mar (22u 139 70 S 67u 489 280 E)
encuentra> 4000 m sobre el nivel del mar, lo que permite
(Jones, 1993). El nombre del lago se atribuye a que el color
la supervivencia de la flora y fauna únicas y limitadas.
rojo proporcionado por comuni- dades de algas y halófilas
Un número de lagos que se han formado debido a la
microorganismos que están presentes en las aguas. La zona
evaporación superior a la precipitación y la presencia de
es de origen volcánico y la laguna se alimenta en parte por
las cuencas sin escurrir, intravolcanic (Risacher, 1992)
los resortes geotérmicos. Otras fuentes de
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agua incluyen la entrada de dos ríos, Rı'o Sulor y Río asimilación de azúcar se determinó utilizando el sistema de
Aguaditas. La laguna está rodeada de fina, arena, suelos CHB API 50 (bioMe'rieux). Otros caracte- rísticas bioquímicas
volcánicos con altas concentraciones de sodio, el potasio, fueron seleccionadas por el sistema API 20E, de acuerdo con
magnesio, boro, arsénico, plomo, bórax, yeso, sulfatos y Logan & Berkeley (1984).
fosfatos (Jones, 1993). La temperatura ambiental varía
entre 215 y 20 uC durante el año.
El medio usado para el aislamiento y mantenimiento de las
bacterias fue que descried por Ventosa et al. (mil
novecientos ochenta y dos). El medio contenido (%, w /
v):? NaCl, 17 8; MgSO4.7H2O, 0 1; CaCI2.2H2O, 0 036;
KCl, 0 2?; NaHCO3, 0 006; NaBr, 0 023;
proteosa / peptona (Difco), 0 5?; extracto de levadura
(Difco), 1 0?; glucosa, 0 1?; y (para medio sólido) agar
granulado, 2? 0. El pH se ajustó a 7? 5 mediante el uso de
NaOH 3 M, para que sea similar a la de la muestra de
suelo. El procedimiento de aislamiento consistió en
mezclar aproximadamente 500 muestra de suelo mg de la
orilla de Laguna Colorada, Bolivia, con 0? 5 ml de medio
por agitación suave, la inoculación de 0? 2 ml de mezcla en
un 250 ml matraz Erlenmeyer que contenía 100 ml de
medio e incubando durante 12 días a 15 uC con agitación a
200 rpm El medio bacteriana enriquecida se diluyó
mediante el uso de un medio líquido estéril y luego en
medio de agar sólido durante 10 días más de incubación a
18 uC inoculado superficie. Las colonias fueron aisladas,
teniendo sus diferencias morfológicas en consideración.
El medio (HM) para el crecimiento bacteriano y
caracterización se basó en el medio de aislamiento y tenía
la composición siguien- tes (%, w / v):? NaCl, 4 45;
MgSO4.7H2O, 0 025; CaCI2.2H2O, 0 009; KCl, 05 0;
NaBr, 0 006; proteosa /
peptona (Difco), 0 5?; extracto de levadura (Difco), 1 0?;
glucosa, 0 1?; y (para medio sólido) agar granulado, 2
0%?; el pH se ajustó a 7? 5 mediante el uso de 1 M KOH.

Las células de las cepas LC1T y LC2 se cultivaron en

medio HM en 25 uC y pH 7? 5 a menos que se indique lo
contrario. el tamaño celular y la morfología se examinaron
a partir de 20 h los cultivos bacterianos mediante el uso de
un Optiphot-2 microscopio de contraste de fase de Nikon a
una ampliación de 61000. tinción de Gram se realizó
utilizando un conjunto de manchas Difco Gram.

morfología de las colonias se analizó después de

crecimiento durante 30 h a 30 uC en medio sólido, de
acuerdo con Smibert y Krieg (1994). flagelos bacterianos
se observaron utilizando un microscopio electrónico de
transmisión JEM-123 (HC) después de la tinción con
acetato de uranilo al 2%, de acuerdo con Vreeland et al.
(1980). Las células también se observaron con un
microscopio electrónico de barrido LV JSM-5600 (JEOL).
Para esto, las células se recogieron a partir de cultivos
líquidos durante su fase de crecimiento exponencial, se
lavaron dos veces con agua y se deshidrataron a través de
una serie graduada de soluciones de etanol y alcohol
isopropílico / acuosas. Las células fueron montados sobre
cubreobjetos de 12 mm, se seca durante la noche en un
desecador de vacío y luego recubierto con oro / paladio
(80: 20). IP: 190.11.65.148
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Crecimiento a y la tolerancia a la concentración de sal,
temperatura y pH de los aislados LC1T y LC2 se
estudiaron en 12 ml de medio de HM en botellas de 50
ml con tapón de rosca. Para estos estudios, las células
se cultivaron respectivamente a los 0, 5, 10, 15, 25 y
30%
(W / v) de NaCl durante 10 días; a temperaturas de 0,
4, 15, 25, 35, 45 y 50 uC durante 14 días; y a valores
de pH inicial de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 (ajustado con 2
M de KOH o HCl 2 M) durante 10 días. OD600 se
midió en un espectrofotómetro Ultrospec 3000
(Pharmacia Biotech) mediante el uso de medio estéril
como referencia. Las pendientes de DO600 frente
centrado sal con-, temperatura y pH se representaron
para determi- nación de las condiciones óptimas para
el crecimiento.
La sensibilidad a los antibióticos se determinó por el
método de ensayo de disco estándar, de acuerdo con
Smibert y Krieg (1994). Resistencia y grado de
sensibilidad se determinaron midiendo el tamaño de
las zonas de inhibición de diferentes cantidades de
cada antibiótico después de 24 h de incubación a 30
uC.
El ADN genómico se extrajo y se purificó de acuerdo
con Marmur (1961) y su pureza se evaluó a partir
A260 / A280 y ratios de A260 / A230 (Johnson, 1994).
cebadores universales que correspondían a las
posiciones 8-27F (59-AGAGTTTGAT-
CCTGGCTCAG-39) y 1422R (59-
GGTTACCTTGTTAC-
GACTT-39) fueron utilizados para amplificar la región
de ADNr 16S de los aislados LC1T y LC2 (Weisburg
et al., 1991). PCR pro- ductos se purificaron usando un
kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) y después
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se resuspendieron en 40 ml de agua estéril. La
secuenciación del ADN de ambas hebras se realizó por el
método de terminación de cadena didesoxi con un
analizador de ADN ABI Prism 3100, usando un kit de
reacción ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready (PE Biosystems) de acuerdo con el protocolo
suministrado por el fabricante. GenBank y la base de datos
RDP se utilizaron para buscar 16S rDNA similitudes de
secuencia (Maidak et al., 2000). análisis filogenético de las
secuencias de ADNr 16S se llevó a cabo con la ayuda del
paquete de software MEGA2 (Kumar et al., 2001)
utilizando el método de unión de vecinos (Saitou y Nei,
1987). Para los árboles filogenéticos, sólo las secuencias
de las cepas de tipo de especies cuyos nombres se han
publicado válidamente se tuvieron en cuenta. Casi-
completos secuencias de 16S rDNA (aproximadamente
1460 pb) de los aislados LC1T y LC2 se utilizaron en el
análisis.
se determinó el contenido de ADN genómico G + C y la
hibridación ADN-ADN se realizó mediante el Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Alemania). Para estos ensayos, los
aislados LC1T y LC2 se cultivaron en HM medianas y de
referencia cepas Halomonas variabilis DSM 3051T y
Halomonas meridiana DSM 5425T se cultivaron de
acuerdo con las condiciones dadas por DSMZ.
Entre las cepas aisladas de la muestra de suelo Laguna
Colorada, dos aislados, a saber LC1T y LC2, se colocaron
dentro del género Halomonas por su secuencia de 16S
rDNA (Fig. 1). 16S rDNA similitud de secuencia entre
LC1T y LC2 fue de 99? 7%. Se colocaron en una rama en
paralelo con H. variabilis DSM 3051T (con similitud 98?
7%) y
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 boliviensis Halomonas sp. nov.

Fig. 1. Árbol filogenético construido a partir

de la comparación de las secuencias de
ADNr 16S de los aislados LC1T y LC2 con
los de miem- bros del género Halomonas.
números de acceso GenBank de las cepas
de tipo utilizados en el análisis filogenético
se dan entre paréntesis. Escherichia coli fue
tomada como el grupo afuera. Bar, 2

sustituciones en 100 nt.

durante su fase exponencial. Las células exhibieron

con H. meridiana DSM 5425T, con la que se muestran
diferentes longitudes durante
97% de similitud.

Varias características morfológicas y taxonómicas de los

aislados LC1T y LC2 se investigaron y se comparan con
los de H. y H. variabilis meridiana (véase el cuadro
complementario, disponible en línea IJSEM). En esta
comparación, 'Halomonas glaciei' MTCC 4321, una nueva
especie que se informó recientemente (Reddy et al., 2003),
también se añadió. Además, también se incluyeron cepas
tipo del género Halomonas que pertenecen a otros grupos.
En estudios anteriores, Tindall (1994) y Baumgarte et al.
(2001) mostraron que los datos bioquímicos y químicos
algu- veces contradecían la conclusión derivada de las
secuencias de 16S rDNA de los organismos. En el presente
trabajo, el cuadro complementario (disponible en IJSEM
Online) muestra varias diferencias taxonómicas y
fisiológicas de los aislados LC1T y LC2 de las especies
relacionadas más cercanos, H. variabilis. De hecho, hay
más diferencias que similitudes, aunque los nuevos
aislamientos comparten algunas características con
H. meridiana, Tales como su amplia gama de tolerancia a
la sal y la temperatura de crecimiento.
Los aislados LC1T y LC2 eran móviles por medio de
flagelos trichous lopho- (complementario Fig. A,
disponible en IJSEM en línea) y eran Gram-negativas,
organismos en forma de varilla que se encontraron tanto
individualmente como en pares [complementario figuras B
y C (izquierda ), disponible en línea IJSEM] y,
ocasionalmente, como cadenas celulares de tres bacterias
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 condiciones de crecimiento óptimas con respecto al pH,
la fase exponencial [Figs B y C (derecha), disponible en
temperatura y salinidad. Los organismos crecieron de
IJSEM Online]; Sin embargo, se hicieron más cortos y
manera óptima a una concentración de NaCl de 5% (w / v)
más uniformemente largo al llegar al final de su fase
y se tolera hasta un 25% (w / v) de NaCl, por lo tanto,
exponencial. Además, ambos aislados mostraron fisión
pueden ser considerados como moderadamente bacterias
binaria en las células cortas [Complementario. Fig C
halófilas (Ventosa et al., 1998). Estas características
(izquierda), disponible en IJSEM en línea), mientras que
estaban en contraste con los de H. variabilis y H. meridiana
la fisión apical y transversal se observó en células
(ver Tabla complementario en IJSEM Online). Sin
alargadas, como resultado de la división celular
embargo, el requisito de la sal y la tolerancia puede variar
(complementario Fig. B, disponible en línea IJSEM). Se
de acuerdo con la temperatura de crecimiento y la
observaron dos diferencias principales en la morfología
naturaleza de los nutrientes disponibles (Ventosa et al.,
celular de las dos cepas: células de LC2 cepa eran más
1998). La temperatura óptima para el crecimiento fue de
largos que los de LC1T (ver Tabla complementario en
aproximadamente 25-30 uC; Los aislamientos fueron
IJSEM en línea) y su forma se volvió ligeramente
capaces de crecer a 0 uC (la tem- peratura más baja
curvadas en varillas cortas, mientras que aislar LC1T
ensayada) y hasta 45 uC y podrían ser clasificados como
mantuvo una forma de varilla recta durante su fase de
psicrófilos [de acuerdo con la definición de Morita (1975)],
crecimiento exponencial.
mientras que H. variabilis es una bacteria mesófila
Ambos aislados mostraron tolerancia similar y
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J. Quillaguama'n y otros

que sólo puede crecer a 15-37 uC (Fendrich, 1988).
Finalmente, las células fueron capaces de crecer en un
amplio rango de pH de 6-11 con un pH óptimo para el
crecimiento entre 7? 5 y 8, y por lo tanto pueden ser
consideradas como alkalitolerant (igual que otras especies
Halomonas), aunque con límites de pH que varían de
crecimiento (véase el cuadro complementario en IJSEM en
línea).
+ C de la especie Halomonas con la más alta 16S rDNA
similitud de secuencia y las nuevas características que se
muestran, se concluye que los aislados LC1T y LC2
constituyen una nueva especie del género Halomonas, para lo
cual el nombre de Halomonas boliviensis sp. nov. esta
propuesto.

Las cepas LC1T y LC2 utilizan una variedad de hidratos de

carbono como fuentes de carbono, este último organismo
que exhiben versatilidad más amplio en la elección de
sustrato. El comportamiento heterótrofos y la capacidad de
los aislados de utilizar diferentes tipos de hidratos de
carbono fue similar a la de H. meridiana, pero diferían de
variabilis H., que es conocido por ser quimio-organotrófico
y por su incapacidad para oxidar carbohidratos (Fendrich,
1988). Incluso 'H. cepas glaciei' han mostrado una
capacidad bastante restringida para la utilización de
diferentes fuentes de carbono (Reddy et al., 2003).

Los aislados LC1T y LC2 fueron comparables con respecto

a sus características bioquímicas. Algunas de estas carac-
terísticas se compartieron con referencia especies de
Halomonas, pero también se observaron diferencias (véase
el cuadro complementario en IJSEM en línea). El atributo
que diferenciaba aísla LC1T y LC2 de H. meridiana, H.
variabilis y 'H. glaciei' fue su capacidad para reducir el
nitrato (véase la Tabla suplementaria en IJSEM en línea).
Además, la presencia de ureasa, que se observó en H.
meridiana y
H. variabilis, No se encontró en las células de LC1T cepa
o LC2 cepa. Muchos miembros del género Halomonas
pueden utilizar nitrato como aceptor de electrones
alternativo (Ventosa et al., 1998). Algunas cepas de tipo
que son capaces de reducir el nitrato se incluyen en el
cuadro complementario (disponible en línea IJSEM); No lo
hicieron, sin embargo, tienen otra semejanza signi- sig-
fenotípica a los aislados LC1T y LC2.

El contenido de ADN G + C de los aislados LC1T y LC2

(51? 4 y 52? 6 mol%, respectivamente) diferían
significativamente de los de H. variabilis, H. meridiana y
'H. glaciei', que tienen contenidos de ADN G + C de 61,%
59 y 57 mol, respectivamente. la relación de ADN-ADN
entre los aislados LC1T y LC2 fue de 80? 4%. hibridación
ADN-ADN de los aislamientos con H. variabilis y H.
meridiana dio 25? 4 y 22? 8% de similitud,
respectivamente, para LC1T aislado y 29? 7 y 21? 4% de
similitud, respectivamente, para LC2 aislado. similitudes
de ADN-ADN entre los nuevos aislados y las bacterias de
referencia fueron significativamente menores que el valor
recomendado de
¢70 %, wHICH es aceptado como el definición de un novela
especies (Wayne et al., 1987).

Basado en la relación de ADN-ADN compartido entre los

aislados LC1T y LC2, se puede concluir que se trata de
diferentes cepas que pertenecen a la misma especie. Por
otra parte, debido a las similitudes de hibridación ADN-
ADN bajos, marcada diferencia en el contenido de ADN G
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Descripción de Halomonas boliviensis sp. nov.
boliviensis Halomonas (Bo.li.vi.en9sis. NL adj.
Boliviensis de Bolivia, en relación con el país donde se
aislaron las bacterias).
Aerobio, bacilos Gram-negativos con un tamaño de 0?
461? 1- 0? 663? 4 mm para LC1T aislado y 0? 461? 1-
0? 565? 5 mm para LC2 aislado. Móviles por medio de
flagelos lophotrichous. Las células se producen solos o
en parejas y muestran una amplia tribución tamaño
dis- durante la fase exponencial, pero el tamaño
uniforme al final de su crecimiento. Las colonias son
circulares con bordes ondulados, convexas y tienen
una pigmentación crema que se ve reforzada en las
culturas antiguas. Moderadamente halófilos,
alkalitolerant y psychrophilic. El crecimiento ocurre en
0-25% (w / v) de NaCl en medio complejo, con un
óptimo de aproximadamente 5% (w / v) de NaCl. El
crecimiento tiene lugar a pH 6-11, con un óptimo entre
7? 5 y 8. El crecimiento ocurre en 0-45 uC, con un
óptimo entre 25 y 30 uC. células heterotróficas que son
capaces de utilizar diversos hidratos de carbono como
fuentes de carbono. reduccionista nitrato y triptófano
desaminasa-positivo. No producción de indol o sulfuro
se produce. Arginina dihydrolase-, b-galactosidase-,
decarboxylase- lisina, ornitina y decarboxylase-
Voges- Proskauer negativo. La gelatina no se licua.
contenido de ADN G + C es 51? 4% mol para LC1T
cepa y 52? 6% mol para LC2 cepa. Ambos aislados
son sensibles a la eritromicina, tetraciclina, kanamicina
y carbenicilina; aislar LC1T también es sensible a
cloranfenicol y ácido nalidíxico.
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La cepa tipo es LC1T (= DSM 15516T = ATCC BAA-
759T). cepa de referencia es LC2 (= DSM 15517 = ATCC
BAA-760).
Expresiones de gratitud
Nos gustaría agradecer a la Agencia Sueca de Desarrollo
Internacional (ASDI) para apoyar este trabajo. RH-K., BM y el MTA
también agradecen a Julio César por ser una valiosa guía para
nosotros durante nuestra expedición científica con su increíble
conocimiento del paisaje de Bolivia.
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