DETERMINACIÓN DE LISTERIA

MONOCYTOGENES

PEIO DEL HOYO

ANDREA MUÑOZ
XABI EGILUZ
MAITANE ARRONDO
1KIA3

1
Determinación de Listeria Monocytogenes
ÍNDICE

INTRODUCCIÓN DE LA ESPECIE MICROBIANA3

OBJETIVOS6

MATERIALES6

REACTIVOS6

PROCEDIMIENTO7

RESULTADOS19

INCIDENCIAS24

CONCLUSIONES25

OTRAS PRUEBAS PARA IDENTIFICAR26

MÉTODO PCR27

2
Determinación de Listeria Monocytogenes
INTRODUCCIÓN DE LA ESPECIE MICROBIANA

DESCRIPCIÓN DE LA BACTERIA
Listeria pertenece a un grupo de bacterias presentes en el intestino de los animales, personas
sanas y en el medio ambiente presentando gran resistencia en alimentos ácidos, con alto
contenido en sales, y a bajas temperaturas, de forma que puede sobrevivir meses en
alimentos refrigerados. En grupos poblaciones de riesgo, al consumir alimentos contaminados
con Listeria puede causar listeriosis.
Reservorio
Las bacterias del género Listeria son bacilos anaerobios facultativos que no forman esporas ni
contienen cápsula y son ubicuas, es decir, están amplia-mente distribuidas en el medio
ambiente presentando gran resistencia (tierra, aguas, materia fecal, vegetación, ensilados y
entorno de la producción de alimentos).
Se encuentran en el intestino de animales y personas que actúan, en general, como
portadores subclínicos de la misma. También se encuentran en el suelo, paredes, techos y
equipos de plantas de procesado de alimentos, por lo que es muy difícil de erradicar en
establecimientos de fabricación de productos alimentarios.
Condiciones de supervivencia
En concreto, la Listeria monocytogenes es resistente a ambientes poco favorables para el
crecimiento de otras bacterias, como pueden ser los ambientes ácidos o de alto contenido en
sales, así como su capacidad de sobrevivir y multiplicarse a temperaturas de refrigeración
<5ºC.
También puede crecer muy lentamente en alimentos con pH neutro y con un alto contenido de
nutrientes a temperaturas alrededor de 0ºC y puede sobre-vivir a temperaturas de
congelación de −18ºC durante meses en diferentes alimentos.
Por otra parte, la L. monocytogenes es resistente a tratamientos térmicos al límite de la
pasteurización, por ejemplo, 74ºC / 1 segundo en leche cruda o de 82ºC en el caso de carne
de pollo envasada al vacío. La resistencia al calor aumenta en condiciones favorables de pH,
actividad de agua y si ha habido crecimiento a temperatura ambiente antes del tratamiento
térmico.

Etiología
El género Listeria actualmente comprende seis especies: L. monocytogenes, L.ivanovii, L.
seeligeri, L. innocua, L. welshimeri y L. grayi. Dos de estas especies, L. monocytogenes y L.
ivanovii son potencialmente patógenas para el hombre y animales, aunque su virulencia es
variable. La L. monocytogenes es la más relacionada con Listeriosis en humanos por su gran
resistencia en condiciones poco favorables.

3
Determinación de Listeria Monocytogenes
VÍAS DE TRANSMISIÓN

La bacteria L. monocytogenes se puede transmitir al ser humano por varias vías:

 A través del consumo de alimentos contaminados con dicha bacteria. Actualmente se
reconoce que la mayoría de los casos de listeriosis humana son de transmisión
alimentaria (99%) por falta de higiene, contaminación cruzada, inadecuado procesado
de los alimentos tanto en la transformación de los alimentos en la industria como en la
preparación y cocinado de los alimentos en el hogar.

 Vertical: de madre embarazada a feto.

 Zoonótico: por contacto con animales enfermos, lo cual es poco frecuente, como son
los casos de veterinarios y ganaderos después del parto de un animal infectado sin
protección.

 Nosocomial (adquisición hospitalaria): en obstetricia y ginecología es muy poco

frecuente.

ALIMENTOS A CONSIDERAR

Esta bacteria puede presentarse tanto en alimentos vegetales como animales, aunque la
listeriosis se suele asociar mayormente a quesos poco curados y otros derivados lácteos
elaborados con leche cruda o sin pasteurizar, frutas y verduras crudas, patés y pescados
crudos o ahumados en frío, carne de rumiantes y aves, y embutidos cocidos y curados.
También puede encontrarse en comidas preparadas listas para su consumo de origen
vegetal, lácteo, marino o cárnico.

LA TOXIINFECCIÓN ALIMENTARIA: LISTERIOSIS

La listeriosis es una zoonosis y enfermedad de origen alimentario, es decir que se transmite a

los humanos a través del consumo de los productos alimenticios contaminados con Listeria
monocytogenes.
Por lo general, esta bacteria puede causar gastroenteritis con fiebre, dolor de cabeza,
malestar estomacal y vómitos pero sin mayor repercusión en adultos sanos. Cualquier
persona puede contraer la enfermedad pero afecta de forma más severa a personas con el
sistema inmunológico debilitado.
La listeriosis es una enfermedad infrecuente pero seria, de elevada tasa de mortalidad (20-
30%) en sectores poblacionales de elevada susceptibilidad, comparada a la de otras
toxiinfecciones alimentarias.

4
Determinación de Listeria Monocytogenes
PREVENCIÓN

Las recomendaciones para la prevención de alimentos contaminados por Listeria

monocytogenes están vinculadas a la naturaleza de la bacteria, su medio y su resistencia a
varias condiciones medioambientales. Por lo tanto deberá prestarse especial atención a la
cocción de los alimentos crudos de origen animal, el lavado cuidadoso de las hortaliza s y
hierbas aromáticas crudas, la remoción de la capa dura de los quesos y a los productos listos
para el consumo los cuales no han sido sometidos a un tratamiento listericida como ser un
tratamiento térmico. Asimismo, deberán cocinarse bien las carnes molidas y adoptar medidas
que permitan la reducción del riesgo de la contaminación cruzada, tales como el
almacenamiento de los alimentos crudos (carne, hortalizas, etc.) separados de los alimentos
cocidos o listos para el consumo, y el lavado de las manos y utensilios de la cocina después
de manipular los alimentos crudos. Finalmente, otras recomendaciones más generales son:
lavar y desinfectar la heladera con regularidad usando agua con cloro, controlar el
funcionamiento de la misma a 4°C, observar la fecha de vencimiento de los alimentos y evitar
las “ventas especiales” ofrecidas cerca del final del tiempo de conservación.

LÍMITES LEGALES

En las explotaciones ganaderas y mataderos deben cumplir los criterios de higiene de los
procesos, establecidos en el Reglamento (CE) 2073/2005, DE LA COMISIÓN de 15 de
noviembre de 2005 relativo a los criterios microbioló-gicos aplicables a los productos
alimenticios y sus posteriores modificaciones.

Alimento Límite microbiológico máximo Fase en el que se aplica el

permitido criterio

Alimentos listos para el consumo Ausencia en 25 g Productos comercializados

destinados a los lactantes, y durante su vida útil
alimen-tos listos para el consumo
destinados a usos médicos
especiales
100 ufc/g Productos comercializados
durante su vida útil
Alimentos listos para el consumo
que pueden favorecer el
desarrollo de L. monocytogenes, Antes de que el alimento haya
que no sean los destinados a los Ausencia en 25 g dejado el control inmediato del
lactantes ni para usos médicos explotador de la empresa
especiales alimentaria que lo ha producido

100 ufc/g
Alimentos listos para el consumo Productos comercializados
que no pueden favorecer el durante su vida útil
desarrollo de L. monocytogenes,
que no sean los destinados a los
lactantes ni para usos médicos
especiales

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Determinación de Listeria Monocytogenes
OBJETIVOS

1. Identificar la presencia de Listeria monocytogenes en un alimento.

2. Recuento de mesófilos aerobios totales.
3. Aislar la Listeria monocytogenes en un alimento.
4. Realizar diferentes pruebas bioquímicas para la confirmación de las colonias.

MATERIALES

1. Autoclave
2. Tubos de ensayo con tapón
3. Gradilla
4. Micro pipeta
5. Puntas para micro pipeta
6. Asas de siembra drigalsky
7. Asa de siembra de platino
8. Mechero Bunsen
9. Estufa incubadora

REACTIVOS

 Caldo selectivo Fraser

 Placas ALOA
 Placas PCA
 Placa con inoculo de una cepa de Listeria monocytogenes

6
Determinación de Listeria Monocytogenes
MUESTRA:
 Zanahoria con piel

Se utilizan 3 bolsas de stomacher:

 Control negativo: fraser
 Control positivo: fraser+ Listeria monocytogenes
 Muestra problema: muestra + fraser

PROCEDIMIENTO

El siguiente procedimiento nos permite determinar la presencia de Listeria monocytogenes en

25 gramos de alimento. Todo el procedimiento se realizará alrededor del mechero Bunsen.
1. Se identifican las 3 bolsas estériles para el stomacher.
2. Para la muestra problema, se pesa 25 g de muestra en el equipo Delta Dilutor y se
diluye hasta 1:10 añadiendo 250 ml de caldo selectivo para Listeria (Fraser).

3. Para el control positivo y control negativo no se añade muestra y se le añade 100 ml

de Fraser. Luego para el control positivo, con un asa de siembra se inocula la Listeria
monocytogenes, introduciendo la asa de siembra de platino en el caldo.

7
Determinación de Listeria Monocytogenes
 4. Se mezcla y homogeneiza la muestra en el Stomacher.
5. Se incuban las 3 bolsas, a 37ºC durante 24h.

6. Con una micro pipeta, se siembra 0,1 ml en las 3 placas ALOA con la ayuda de un asa
de siembra estéril.

7. Se incuban las placas a 37ºC durante 48h.

8. Se examina la presencia de las colonias típicas de Listeria monocytogenes (colonia
azul-verdosa con halo) en el control positivo.
9. En el caso del control negativo, no hay crecimiento de microorganismos.
10. En el control de la muestra, sí que hay crecimiento de microorganismos.

AISLAMIENTO DE LAS COLONIAS

1. Se coge un asa de platino y se esteriliza en el mechero Bunsen.

2. Se hacen las siembras por estría correspondientes en las placas PCA.

a. Una placa para el control positivo.
8
Determinación de Listeria Monocytogenes
 b. Una placa para la muestra problema que contiene colonias de color blanco.

c. Una placa para la muestra problema que contiene colonias de color verde.

3. Se incuban las placas PCA a 37ºC durante 24h.

4. Se observa la presencia de microorganismos en las 3 placas.

MUESTRA PROBLEMA MUESTRA PROBLEMA

COLONIA VERDE COLONIA BLANCA CONTROL +

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Determinación de Listeria Monocytogenes
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

 TINCIÓN GRAM
MATERIAL:
1. Cubetas o bandejas
2. Porta objeto
3. Cubre objeto
4. Asa de siembra de platino
5. Pinza
6. Pipetas Pasteur
7. Vasos de precipitados
8. Mechero Bunsen
9. Microscopio óptico
10. Aceite de inmersión

REACTIVOS:
 Genciana Violeta
 Fuchsina
 Lugol
 Alcohol (96%)
 Agua destilada
 Placas PCA con cultivos puros

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACETRIANO

1. Se coloca una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.

2. Se toma en condiciones asépticas, una pequeña cantidad de microorganismo de las
placas de PCA con cultivos puros y se trasfiere a la gota de agua. Se remueve la
mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede
bastante extendida para facilitar su secado.
3. Se acerca el portaobjetos a la llama del mechero Bunsen, para que se fijen las células.
Se espera hasta que el líquido se evapore. Hay que tener mucha precaución en no
calentar demasiado el portaobjetos, porque las células se pueden deformar o romper.
4. Se deja enfriar el portaobjetos.

10
Determinación de Listeria Monocytogenes
REALIZACIÓN DE LA TINCIÓN GRAM

1. Se añade el colorante violeta de Genciana y se espera durante 1 minuto. Se procede a

limpiar con agua destilada, para quitar todo el tinte sobrante.
2. Se añade Lugol a la muestra y se espera 1 minuto. De esta forma se aumenta la
afinidad entre el colorante y las células. Se procede a limpiar con agua destilada.
3. Se decolora con alcohol, durante 30 segundos. Se procede a limpiar con agua
destilada.
4. Se añade el colorante Fucshina y se espera 1 minuto.
5. Se procede a limpiar con agua destilada, hasta quitar todo el sobrante.
6. Se deja secar la muestra. Para acelerar el secado se acerca el portaobjetos al
mechero Bunsen.
7. Se observan las células en el microscopio óptico. Se pone una gota de aceite de
inmersión. Se va enfocando mediante los rodillos hasta que se visualicen
adecuadamente los microorganismos.

 CATALASA
MATERIAL:
1. Portaobjetos
2. Pipeta Pasteur
3. Asa de siembra
4. Mechero Bunsen
REACTIVOS:
 Peróxido de hidrógeno al 3%
 Placas PCA con cultivos puros

PROCEDIMIENTO:

1. Se toma una colonia de las placas PCA de cultivos puros y se coloca sobre un
portaobjetos.
2. Sobre ella se deja caer unas gotas de peróxido de hidrógeno con la ayuda de una
pipeta Pasteur.
11
Determinación de Listeria Monocytogenes
 3. Se detecta la formación de burbujas, si el resultado es positivo.

 OXIDASA
MATERIAL:
1. Tiras Oxidasa
2. Asa de siembra
3. Mechero Bunsen

REACTIVOS:
 Placas PCA con cultivos puros

PROCEDIMIENTO:
1. Se coge una colonia de las placas PCA con cultivos puros y con la ayuda de un asa de
platino, se extiende la colonia por la zona reactiva de la tira.
2. Se observa si la zona impregnada vira a un color azul violeta.

 API
MATERIAL:

1. Mechero Bunsen
2. Asa de platino
3. Agua destilada
4. Pipeta
5. Pro pipeta
6. Micro pipeta
7. Puntas para micro pipeta
8. Incubadora
9. Fondo y tapa de cámaras de incubación
10. Galerías
11. Hojas de resultados

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Determinación de Listeria Monocytogenes
REACTIVOS

 Placas PCA con cultivos puros

 API Suspensión Medium (2 ml).
 ZYM B

PROCEDIMIENTO:

Preparación de la galería

1. Se reúnen fondo y tapa de una cámara de incubación y con una pipeta se reparte
aproximadamente 3 ml de agua destilada en los alveolos del fondo para crear una
atmósfera húmeda.
2. Se escribe la referencia de las muestras en el lateral de la cámara.
3. Se saca una galería de su envase individual.
4. Se coloca la galería en la cámara de incubación.

Preparación del inóculo

1. Se abre una ampolla de API Suspensión Medium (2 ml).

2. Con la ayuda de un asa de platino, se coge una cantidad de masa bacteriana.

3. Se deposita dentro de la ampolla hasta realizar una suspensión de turbidez igual a 1
de Mc Farland.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Inoculación de la galería

1. Se reparte la suspensión bacteriana precedente en los tubos, evitando la formación de

burbujas (para ello , se inclina la cámara de incubación hacia delante y se coloca la
micro pipeta en un lado de la cúpula):
a. Se llena el tubo y la cúpula del ensayo DIM (100 μL aprox.).
b. Se llena solamente la parte del tubo de los ensayos ESC a TAG (50 μL aprox.).

2. Se cierra la cámara de inmediato.

3. Se incuba a 37ºC durante 24h.

Lectura de la galería

1. Se agrega una gota de reactivo ZYM B al ensayo DIM.

2. Pasados 3 minutos se leen todas las reacciones haciendo referencia a la Tabla de
Identificación de la ficha técnica.
3. Se anotan las reacciones +/- en la hoja de resultados.

Interpretación

La interpretación se obtiene a partir del perfil numérico.

1. Se determina el perfil numérico: en la hoja de resultados los test se separan en grupos

de 3 y se asigna para cada uno un valor 1, 2 0 4. Se suman en el inferior de cada
grupo los números que corresponden a reacciones positivas y se obtienen 4 cifras que
constituyen el perfil numérico.

2. Por medio del software de identificación apiweb tm, se ha identificado la especie.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
  HEMÓLISIS
MATERIALES:

1. Mechero Bunsen
2. Asa de platino
3. Incubadora

REACTIVOS:

 Placas PCA con cultivos puros

 Placas en agar sangre de cordero al 5%

PROCEDIMIENTO:

1. Con la ayuda de un asa de platino, se siembra por agotamiento la masa bacteriana de

las placas PCA con cultivos puros, por duplicado.

2. Se incuban a 37ºC durante 24 h.

3. Si la prueba es positiva, el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
  PRUEBA DE CAMP
MATERIALES:

1. Mechero Bunsen
2. Asa de platino
3. Incubadora

REACTIVOS:

 Placas PCA con cultivos puros

 Placa con inoculo de cepa Staphylococcus aureus
 Placa con inoculo de cepa Listeria monocytogenes nueva
 Placa con inoculo de cepa Listeria innocua nueva
 Placa en agar sangre de cordero al 5%

PROCEDIMIENTO:

1. En una placa de agar sangre se estriar una línea simple de S. aureus, utilizando un
asa de platino.
2. Se estrían los cultivos test (colonia blanca, colonia verde y control positivo
contaminada) en una línea simple y perpendicular a la línea de cultivo de referencia.
La línea de cultivo test debe estar separada de la de referencia 2 - 4 mm. Durante el
estriado las líneas test y referencia no se deben tocar para evitar contaminación
cruzada.
3. Simultáneamente se estrían cultivos controles de L.monocytogenes nueva y L.
innocua.
4. Se incuba a 37ºC durante 24h.

Colonia Blanca
Staphylococcus aureus
Colonia Verde

L. monocytogenes contaminada

L. monocytogenes nueva

L. innocua nueva

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Determinación de Listeria Monocytogenes
AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES
MATERIAL:
1. Micro-pipeta
2. Puntas para micro-pipeta
3. Tubos de ensayo con tapón
4. Gradilla
5. Placas Petri (PCA)
6. Bolsas estériles
7. Asas de siembra
8. Estufa incubadora
9. Mechero bunsen
10. Stomacher
11. Delta dilutor

REACTIVOS:
 Agua peptonada:
Según las instrucciones del fabricante está al 2%. Por lo tanto hay que utilizar 2g de
agua peptonada por 100 ml de agua Mili-Q. En nuestro caso vamos a preparar 150 ml,
por lo tanto se han utilizado 3g de agua peptonada.
 Placas Petri con PCA:
Según el fabricante se necesitan 20,5g de PCA (liofilizado) por 1 litro de agua Mili-Q.
En nuestro caso necesitamos 450 ml por lo tanto se han utilizado 9,22 g de PCA.

PROCEDIMIENTO:
1. Se coge una bolsa estéril y se etiqueta poniendo la fecha, muestra y nombre. Es muy
importante que la bolsa no se abra.
2. Para preparar la dilución madre, en el equipo Delta Dilutor se ponen 10 g de alimento
en la bolsa estéril del Stomaher.
3. Se añade 90 ml de agua peptonada. Esta dilución será 1:10.
4. Se introduce la bolsa estéril dentro del aparato º1. La muestra y el agua peptonada se
mezclaran consiguiendo así que los microorganismos mesófilos aerobios que están en
la muestra, pasen a estar en el agua peptonada.
5. Se han rotulados los 4 tubos de ensayo. Indicando el nombre del reactivo, su
concentración, grupo y fecha de preparación. Y se han puesto en la gradilla.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
 6. Se preparan diluciones seriadas. Se toma 1 ml de la disolución 10-1 y se pasa a un
tubo de ensayo q tiene 9 ml de agua peptonada. Esta será la dilución 10-2. Se mezcla
la dilución correctamente. Todo el procedimiento se realizará alrededor del mechero
Bunsen. Se repite esta operación sucesivamente, hasta preparar todas las diluciones
seriadas (hasta 10-5 y control negativo).
7. Con la micro pipeta, se deposita 0,1 ml de cada dilución decimal en las placas Petri
previamente identificadas (en total 18) por triplicado y se realiza la siembra en
superficie.
8. Se invierten las placas Petri y se introducen en la estufa. Se incuba a 37ºC durante
48h.
9. Se hace el recuento de las colonias de mesófilos aerobios de las placas que
contengan entre 30 – 300 colonias.

DIAGRAMA DE TIEMPO
Día 1 Cálculos y preparación de medios de cultivo.

Día 2 Preparación de la muestra. Incubación de la misma

Día 3 Siembra en placas ALOA

Día 4 Aislamiento de las colonias. Incubación

Día 5 Sacar de la incubadora y ver el crecimiento.

Día 6 Tinción Gram, catalasa, oxidasa

Día 7 Api, hemólisis

Día 8 Ver los resultados del día anterior

Día 9 Repetir prueba hemólisis. Repetir tinción Gram

Día 10 Ver los resultados del día anterior

Día 11 Repetir prueba hemólisis

Día 12 Ver los resultados del día anterior

Día 13 Realizar prueba Camp

Día 14 Ver los resultados del día anterior

18
Determinación de Listeria Monocytogenes
RESULTADOS
En el Control positivo, se observan colonias de color verde con halo. Esto nos indica que es
Listeria Monocytogenes.

En la Muestra problema, algunas colonias son de color blanco y otras de color verde.

En el control negativo, no hay crecimiento de microorganismos. Lo que nos indica que el

medio Fraser, no está contaminado.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
 TINCIÓN GRAM

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Determinación de Listeria Monocytogenes
 MUESTRA MORFOLOGÍA COLOR FOTO

CONTROL + BACILO GRAM + MORADO

MUESTRA BACILO GRAM - ROSA

PROBLEMA COLONIA
VERDE

MUESTRA STAPHYLOCOCO MORADO

PROBLEMA COLONIA GRAM +
BLANCA

 OXIDASA
Las tres muestras de colonias, han dado oxidasa -. No hay cambio de color a azul
violeta.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
  CATALASA
Las tres muestras de colonias, han dado catalasa +. Se observan burbujas de aire.

 API
Los resultados se comparan con la Tabla de identificación de la ficha técnica
correspondiente.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
 MUESTRA API LISTERIA FOTO
L.MONOCYTOGENES
CONTROL + POSITIVO

MUESTRA NEGATIVO
PROBLEMA
COLONIA
VERDE

MUESTRA NEGATIVO
PROBLEMA
COLONIA
BLANCA

 HEMÓLISIS

MUESTRA HEMÓLISIS
1º PRUEBA 2º PRUEBA
CONTROL +

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Determinación de Listeria Monocytogenes
 MUESTRA
PROBLEMA
COLONIA
VERDE

MUESTRA
PROBLEMA
COLONIA
BLANCA

 PRUEBA CAMP

MUESTRA HEMOLISIS FOTO

MUESTRA PROBLEMA NO
COLONIA BLANCA

MUESTRA PROBLEMA NO
COLONIA VERDE

L. MONOCYTOGENES SÍ
CONTAMINADA

L. MONOCYTOGENES SÍ
NUEVA

L. INNOCUA NO

Se considera reacción positiva una zona acrecentada de β-hemólisis en la intersección de los

cultivos test y el cultivo de S.aureus.

23
Determinación de Listeria Monocytogenes
  AEROBIOS MESOFILOS TOTALES
Solo se ha podido hacer el recuento de dos placas (10-1 y 10-2). Ya que el resto de placas
no contenían colonias entre 30-300 UFC/g.

10-1 = 247 UFC 10-2 = 94 UFC

100𝑔𝐴 10𝑚𝑙𝐵 247𝑈𝐹𝐶

PLACA 10 -1 1g de alimento× 𝑥 × = 247.000 UFC/g
10𝑔𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 1𝑚𝑙𝐴 0,1𝑚𝑙𝐸
100𝑔𝐴 10𝑚𝑙𝐵 10𝑚𝑙𝐶 94𝑈𝐹𝐶
PLACA 10 -2 1g de alimento× 𝑥 × × = 940.000 UFC/g
10𝑔𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 1𝑚𝑙𝐴 1𝑚𝑙𝐵 0,1𝑚𝑙𝐸

INCIDENCIAS

1. Se ha vuelto hacer la tinción Gram de la Muestra problema que contiene colonias

blancas porque no se aprecia bien la morfología.
2. La hemolisis no se observa muy bien y se ha realizado la prueba dos veces.

24
Determinación de Listeria Monocytogenes
CONCLUSIONES
1. En el recuento de aerobios mesófilos totales, no se puede sacar un resultado fiable
porque la siembra en superficie no se realizó de forma correcta y esto ha llevado a que
en muchas placas no se ha podido llevar a cabo el recuento.
2. Según las normas microbiológicas de los alimentos, en frutas y hortalizas frescas la
cantidad de aerobios mesófilos totales está entre 100 UFC/g y 100.000 UFC/g. En la
muestra analizada el resultado ha sido de 247.000 UFC/g y 940.000 UFC/g. Ya que
solo hemos hecho el recuento de dos placas, no podemos realizar cálculos
estadísticos. Por tanto, se concluye que no se puede afirmar que la muestra no sea
apta para consumo alimentario.
3. Una de las pruebas bioquímicas realizadas ha sido La tinción Gram, es una prueba
rápida y potente que nos permite diferenciar dos clases de microorganismos: Gram
positivas (muestra control positiva y muestra problema con colonia blanca) y Gram
negativas (muestra problema con colonia verde). Las Gram positiva se tiñen de
morado ya que el colorante se queda atrapado en la capa gruesa de peptidoglicano
que rodea a la célula. En cambio, La Gram negativa tiene una pared de peptidoglicano
más delgada y es soluble en solventes orgánicos. Por lo tanto, no puede retener el
complejo violeta genciana y se tiñen de color rosa por la acción de la fucshina.
4. Como la Listeria monocytogenes es oxidasa negativa, no hay cambio de color a azul
violeta en ninguna de las muestras analizadas.
5. Como la Listeria monocytogenes es catalasa positiva, la enzima catalasa reacciona
con peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno. Las burbujas de aire que se
observan son procedentes del oxígeno. H2O2 ------ H2O + O2
6. A partir de la prueba de Api Listeria, se determina la ausencia o presencia de Listeria
monocytogenes. En nuestra muestra, hay ausencia de Listeria monocytogenes.
7. Cada colonia reacciona de diferente manera a la hemólisis. En algunas zonas, no se
ha podido apreciar la hemólisis porque ha habido un arrastre de contaminación.
8. La hemólisis no se observó correctamente, por lo que tuvimos que realizar otra prueba
alternativa (prueba CAMP).
9. En la prueba CAMP, solo hemos utilizado S. aureus (como cepa de referencia) porque
no disponíamos de más cepas. Sería interesante utilizar dos cepas de referencia, para
presenciar el tipo de hemólisis que ocasionan y poder comparar con los cultivos test.
10. Como conclusión final, podemos decir que a raíz de las pruebas bioquímicas se
confirma la ausencia de Listeria monocytogenes. Aun así, para poder llegar a certificar
la ausencia total, habría que realizar más pruebas bioquímicas para detectar si hay
otras bacterias patógenas.

25
Determinación de Listeria Monocytogenes
OTRAS PRUEBAS PARA IDENTIFICAR

 PRUEBA DE LA MOVILIDAD
A partir de una colonia típica de una placa incubada una temperatura de 30°C o menor,
preparar una suspensión densa en solución fisiológica al 0.85 %.
Depositar una gota de la suspensión entre porta y cubre objeto bien limpios y examinar en
el microscopio.
Listeria spp. se presenta como bacilos cortos, delgados y con movimientos característicos
en tumbos (tumbling).

 PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

A partir del cultivo obtenido en TS-YEB inocular con un ansa cada uno de los caldos para
utilización de carbohidratos (caldo base púrpura de bromo cresol para fermentación de
carbohidratos con 0.5 % de soluciones de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y
xilosa). El uso de campanita de Durham es opcional.
Incubar a 35°C hasta 7 días. Una reacción positiva (formación de ácido) se visualiza por
una coloración amarilla, que generalmente sucede dentro de las 24 h ó 48 h.
Todas las especies de Listeria son positivas para dextrosa, esculina y maltosa y negativas
para manitol (excepto L. grayi).

 REDUCCIÓN DE NITRATO
Sólo Listeria grayi ssp. murrayi reduce nitratos. Este test permite distinguir L. grayi ssp.
murrayi de L.grayi ssp. grayi.
A partir del caldo TSB-YE (3.3.6.5) inocular el caldo nitrato. Incubar a 35°C durante 5 días.
Agregar 0.2 ml del reactivo A, seguido de 0.2 ml del reactivo B.
El desarrollo de una coloración rojo - violeta indica la presencia de nitritos (reducción del
nitrato). Si no hay desarrollo de color, agregar zinc en polvo y esperar 1 h. El desarrollo de
coloración rojo - violeta indica que no hubo reducción de nitratos.

26
Determinación de Listeria Monocytogenes
MÉTODO PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada

para hacer muchas copias (millones o miles de millones) de una región particular de ADN.
Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador. Por ejemplo,
podría ser un gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador genético usado
por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que
pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR
se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros
experimentos.

La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en

biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN
polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes
como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq
polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy

termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la que la
ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para
la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas
repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

Cebadores para PCR

Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un
cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la
síntesis de ADN. En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada,
se determina por los cebadores que él o la investigadora elija.

Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de
unos 20 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que
están diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es decir,
les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo
en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante
complementariedad de bases.
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Determinación de Listeria Monocytogenes
Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la región que se encuentra entre
ellos se copia.

Diagrama que muestra con más detalle el ADN y la direccionalidad del cebador

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN
molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo,
junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de
calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o

desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla
para el siguiente paso.
2. Templado (55 - 65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a
sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa
extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Este ciclo se repite 40 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 - 4
horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente
(funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas
copias de la región blanco.

Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el
nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de
síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq
polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede
duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento
exponencial.

Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción
se introducen en un que de forma automática realiza los 40 ciclos de amplificación.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Aplicaciones de la PCR
Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de
millones de veces y producirá suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras
técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en gel, enviar a
secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido.
La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones
prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se
utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los
pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede
utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el
patógeno está presente, es posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre
o tejido

Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados de una PCR

Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al
usar electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente
eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN
se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un estándar, o marcador de peso
molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR.
Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel que se puede
identificar a simple vista si el gel se tiñe con un pigmento que se una al ADN. Por ejemplo,
una reacción de PCR que produce un fragmento de 400 pares de bases (pb) se vería así en
un gel:

Carril izquierdo: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500 pb.
Carril derecho: resultado de la reacción de PCR, una banda de 400 pb.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Una banda de ADN contiene muchas, muchas copias de la región blanco de ADN, no solo
una o unas cuantas copias. Dado que el ADN es microscópico, deben existir muchas copias
de este para poder verlo a simple vista. Esto es una parte importante de por qué la PCR es
una herramienta importante: produce suficientes copias de una secuencia de ADN para poder
ver o manipular esa región de ADN.

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras
macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en
aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su
tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a
distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.

Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a esto, la
electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño. La
electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una
muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También podemos determinar el
tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una "escala" estándar de
fragmentos de tamaño conocido.

La separación de moléculas en la electroforesis se basa en la carga (sobre lo que se aplica la

fuerza) y la sección transversal efectiva de la molécula en el estado que se encuentre:
plegada, desnaturalizada, ligada a otras moléculas, etc.
Un conjunto de fragmentos de ADN se separan por tamaño porque todos pertenecen al
mismo tipo de molécula. En general, la única diferencia importante entre los distintos
fragmentos debería ser su longitud.
Sin embargo, hay algunas excepciones a esta regla. Por ejemplo, algunas moléculas de ADN
son circulares (como los plásmidos bacterianos), mientras que otras son lineales. Las
moléculas de ADN circular pueden correr por el gel de forma diferente a las moléculas
lineales. Tal es el caso de los plásmidos que pueden existir en una forma llamada
"superenrollada", con la que en realidad se mueven por el gel más rápido de lo que debieran
según su tamaño, debido a que se han enredado en una forma más delgada que puede
moverse más fácilmente a través del gel.

¿Qué es un gel?

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de material
similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido
llamado agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se
calienta en una solución amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se
forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas
de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños
poros.
En un extremo, el gel tiene muescas en forma de ranuras llamadas pozos, que son donde se
colocarán las muestras de ADN:

Antes de agregar las muestras de ADN, el gel debe colocarse en una cámara. Uno de los
extremos de la cámara se conecta a un electrodo positivo y el otro extremo se conecta a un
electrodo negativo. El cuerpo principal de la cámara, donde se coloca el gel, se llena con
solución amortiguadora con sales que puede conducir la corriente. Aunque tal vez no puedas
verlo en la imagen superior (gracias a mis fabulosas habilidades artísticas), la solución
amortiguadora llena la cámara hasta un nivel en el que apenas cubre el gel.
El extremo del gel que tiene los pozos se coloca hacia el electrodo negativo. El extremo sin
pozos (hacia donde migrarán los fragmentos de ADN) se coloca hacia el electrodo positivo.

¿Cómo se mueven los fragmentos de ADN a través del gel?

Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN que queremos
analizar (por ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido digerido con enzimas de
restricción) se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos. Un pozo se reserva para el
marcador de peso molecular, un estándar de referencia que contiene fragmentos de ADN
de longitudes conocidas. Los marcadores de ADN comerciales cubren diferentes intervalos de
tamaños, por lo que trataremos de usar uno con buena "cobertura" en el intervalo de tamaños
en el que esperamos encontrar nuestros fragmentos.

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Determinación de Listeria Monocytogenes
A continuación, se aplica energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir corriente a través del
gel. Los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una carga negativa a
las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de gel hacia el
polo positivo. Cuando el sistema está encendido y pasa corriente por el gel, se dice que el gel
está corriendo.

Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los
poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato que ha
corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del
gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los fragmentos de ADN muy
pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos corriendo por demasiado tiempo
(¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!).

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Determinación de Listeria Monocytogenes
Visualización de los fragmentos de ADN

Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de
las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al
ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel.

Una "línea" de ADN bien definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un gran
número de fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma
posición. Un fragmento único de ADN (o incluso un pequeño grupo de fragmentos de ADN) no
sería visible por sí mismo en un gel.
Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos
determinar su tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene un
tamaño aproximado de 700 pares de bases (pb).

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Determinación de Listeria Monocytogenes