SEPARACION DE FOSFOLIPIDOS POR CROMATOGRAFIA

EN CAPA FINA Y DETERMINACION DE COLESTEROL EN

YEMA DE HUEVO

INTRODUCCION

Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos,

insolubles en agua y solubles en solventes no polares,
se clasifican en:

 Simples: derivados del isopreno y no son

saponificables, entre ellos se encuentra el
colesterol, hormonas sexuales, vitaminas.
 Complejos contienen: ácidos grasos saponifica-
IMAGEN 1. Revelado con reactivos específicos para grupos fosfato
bles y se dividen en triacilglicéridos, esfingolí- de fosfolípidos: Molibdato, Bismuto, Ninhidrina, Yodo. (De izquierda
pidos, fosfoacilglicéridos y ceras. a derecha)

Los lípidos simples se dividen en: Terpenos, estos se

encuentran en animales y plantas y tienen estructura de  Determinación de colesterol
diisopreno, triisopreno, etc. Prostaglandinas, considera-
das reguladoras de la actividad hormonal, son ácidos Ejemplo de cálculos:
carboxílicos de 20 átomos de carbono, que contienen un
Tubo 1
anillo ciclopentano, grupos oxidrilo, uno o más dobles
enlaces. Los esteroides son derivados de alcoholes 80µg (0.25 mL)
µg = = 20 µg
cíclicos de peso molecular elevado. 1𝑚𝐿

Colesterol en yema de huevo

El colesterol es el esterol más común y es un
compuesto clave en la síntesis de ácidos biliares, 26.79µg (1200µL)
= 6,429.6 µg
hormonas sexuales, hormonas corticosuprarrenales y 5µ𝐿
vitamina D.
Tubo Absorbancia µg Colesterol
OBJETIVOS 1 0.088 20
2 0.181 40
 Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina 3 0.252 60
para la separación de los fosfolípidos en la 4 0.354 80
yema de huevo. 5 0.437 100
 Discutir las ventajas de la técnica de separación Pb 0.119 26.79
respecto a la cromatografía en papel. TABLA 2: Absorbancias y mg de colesterol del experimento.
 Determinar la concentración de colesterol en la
yema de huevo, por el método de Lieberman-
Burchard. 0.5

0.4
RESULTADOS
ABSORBANCIA

0.3
y = 0.0044x + 0.0011
 Cromatografía en capa fina
0.2
Reactivo Resultado Rf obtenido 0.1
Molibdato + 0.64
0
Bismuto + 0.60
0 20 40 60 80 100 120
Ninhidrina + 0.68
MICROGRAMOS DE COLESTEROL
Cristales de yodo + 0.53
TABLA 1: Resultados de revelación con reactivos específicos para
fosfolípidos. GRAFICA 1: Absorbancia vs µg de Colesterol 1
DISCUSIONES
 Cromatografía en capa fina
Se separaron diferentes fosfolípidos de una yema de
huevo, esto con una solución no polar de cloroformo-
metanol, ya que los fosfolípidos son solubles en
soluciones no polares. Posteriormente adicionamos KCl
y agitamos, de inmediato se dejó reposar para la
formación de 2 fases, en la fase orgánica (inferior) se
encuentra la parte polar del lípido, mientras que la fase
acuosa (superior) se encuentra la parte no polar (el
grupo fosfato). Después utilizamos la fase orgánica para
la separación cromatográfica.
Se aplicaron muestras en cuatro cromatogramas
diferentes, posteriormente se introdujeron en la cámara
de cromatografía y se utilizó como fase móvil una
mezcla de cloroformo-metanol-ácido acético-agua. Más
tarde se revelaron los cromatogramas con diferentes
reactivos (tabla 1):
La prueba de Molibdato da positiva (imagen 1) en la
revelación del cromatograma, ya que se observaron
manchas azules, y esto nos indica que hay presencia de
fosfolípidos en la yema de huevo.
La prueba de Bismuto da positiva (imagen 1), ya que se
observaron en el cromatograma manchas amarillo-
naranjas que comprueban la presencia de colina en
fosfolípidos.
La prueba de ninhidrina indica la presencia de
fosfolípidos que contienen grupos amino, mediante la
aparición de manchas violeta, esta prueba dio positiva
en la revelación del cromatograma (imagen 1).
Por último, la prueba de Yodo indica la presencia
fosfolípidos con dobles enlaces, mediante la aparición
de manchas café, esta prueba dio positiva para la
revelación de nuestro cromatograma (imagen 1).
 Determinación de colesterol en yema de
huevo
Se determinó la concentración de colesterol en yema de
huevo mediante el método de Lieberman-Burchard, en
el cual una solución clorofórmica, el colesterol reacciona
con anhídrido acético y ácido sulfúrico para dar un
complejo de color verde que resulta la mezcla de dos
complejos; uno de color azul y otro amarillo y se
cuantifican en el espectrofotómetro a 640 nm.
Primero se preparó una serie de 5 tubos, un testigo y
un problema ( los cuales deben estar perfectamente
limpios y secos, ya que la reaccion se dará bajo
condiciones anhidras), todos con diferentes cantidades
de estándar de colesterol (80 µg/mL) excepto el tubo
problema y el testigo, posteriormente se les adiciono
diferentes volúmenes de cloroformo, el cual efectuara la
función de solvente en la reacción. Después se agrega
únicamente a nuestro tubo problema el extracto de
lípidos obtenido en la práctica anterior (separación de
fosfolípidos por cromatografía en capa fina), de
inmediato agregamos 0.40 mL de anhídrido acético a
todos los tubos y los agitamos. Por último se adiciona a
todos los tubos 50 µL de ácido sulfúrico concentrado, se
agitan y se dejan incubar a temperatura ambiente, es
aquí cuando ocurre la reaccion entre el colesterol, el
anhídrido acético y el ácido sulfúrico, dando como
resultado una mezcla color verde, que proviene de la
formación del ácido 3,3 biscolesta-3,5 dienilsufonico que
presenta un color amarillo, y el ácido 3,3 biscolesta-3,4
dienilsufonico de un color azul.
Posteriormente se leyeron en el espectrómetro los
tubos, y se obtuvo la curva tipo, ya que se utilizaron
diferentes concentraciones de la solución estándar de
colesterol, después interpolamos en la gráfica nuestro
valor de absorbancia de 0.119 obtenido para nuestro
tubo problema, y tenemos que hay 26.79 µg de
colesterol. Por ultimo mediante una regla de tres,
tenemos que en 5 µL hay 26.79 µg de colesterol, por lo
tanto para 1200 µL hay 6 429.6 µg de colesterol.
CONCLUSIONES
 La yema de huevo contiene aproximadamente
6,429.6 µg de colesterol.
 Se realizó la separación de fosfolípidos en yema
de huevo, se identificó la presencia de estos
mediante la prueba con reactivo de Molibdato.
 La yema de huevo contiene fosfolípidos con
dobles enlaces, colina y grupos amino.
BIBLIOGRAFÍA
1. E. Conn Eric, “Bioquímica fundamental”,
Universidad de California, Editorial Limusa, 2001,
México D.F.
2. Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”,
Editorial Médica Panamericana, 2ª Edición, 2007,
Madrid, España.