2.3.

Kromatografi Kolom
2.3.1. Pengertian Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang
pertamakali di lakukan oleh D.T.Davy yaitu untuk membedakan komposisi minyak bumi.
Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau
adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan kedalam kromatografi cair – padat (KCP) kolom
terbuka. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-
komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam.
Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat
(adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase
bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang
kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen –
komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda
terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu
melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka
yang pertama – tama dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada
adsorben. Komponen –komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya
terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen – komponen tersebut.

Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di

antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase
bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk
teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya
secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada
fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase
bergerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai
afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan
afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut.

Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi

kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada
kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padat berpori seperti kieselguhr,
selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat
padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya.
Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert
terhadap senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap
dan menahan fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk
mengalirnya fase bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam lebih
polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi fase bergeraknya dapat berupa zat
cair dan gas yang mengalir membawa komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika
fase bergeraknya dari zat cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini
banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun anorganik.

Resin penukar ion adalah suatu bahan padat yang memiliki bagian (ion positif atau

negatif) tertentu yang bisa dilepas dan ditukar dengan bahan kimia lain dari luar. Berdasarkan

jenis ion/muatan yang dipertukarkan, resin dapat dibagi menjadi 2 yaitu resin penukar kation

adalah ion positif yang dipertukarkan dan resin penukar anion adalah ion negatif yang
dipertukarkan. Ion Exchange adalah proses penyerapan ion – ion oleh resin dengan cara Ion-

ion dalam fasa cair (biasanya dengan pelarut air) diserap lewat ikatan kimiawi karena

bereaksi dengan padatan resin. Resin sendiri melepaskan ion lain sebagai ganti

ion yang diserap. Selama operasi berlangsung setiap ion

akan dipertukarkan dengan ion penggantinya hingga seluruh resin jenuh dengan ion

yang diserap.

Besarnya nilai kapasitas penukar dari resin penukar ion tergantung pada jumlah gugus

ion yang dapat ditukarkan yang terkandung dalam setiap gram bahan resin tersebut. Semakin
besar jumlah gugus-gugus tersebut, maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya.

Besarnya nilai kapasitas resin diketahui agar dapat memperkirakan berapa banyaknya resin

yang diperlukan dalam analisa kimia dengan menggunakan metode kromatografi kolom.

Apabila resin telah mengikat jumlah ion yang sama dengan kapasitas maksimumnya maka

resin tersebut dikatakan telah “exchausted”. Dalam keadaan demikian resin dapat

dikembalikan ke keadaan semula dengan jalan menuangkan larutan asam yang agak pekat ke

dalamnya sehingga terjadi reaksi kebalikan dari reaksi penukaran ion. Resin penukar anion

dapat berupa ko-polimer stiren dan divinil benzen tetapi tidak mengandung gugusan-gugusan

amin yang bersifat basa dengan resin penukar anion terjadi pengubahan yang jumlahnya

ekuivalen.
 Parameter yang di gunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom, setelah

mengoptimumkan efesiensi pemisahan secara kromatografi, mutu kromatografi dapat di

kendalikan dengan menerapkan uji kesesuian sistem tertentu. Salah satu diantaranya adalah

perhitungan pelat pelat teoritis untuk suatu kolom dan terdapat dua parameter utama lainnya

untuk menilai kinerja.

2.3.2 Persyaratan kolom

Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat
suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih
adsorben yang ukuran butir – butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik.
Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan
makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil
butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom.
Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum
yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat
mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang
di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic.

2.3.3 Bentuk kolom

Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan.
Sebagai akibatnya, zona – zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur
bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom
kecil bahaya ini seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih
memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah ± 20 kali
diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk
yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi satu.
Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang stasioner. Di
bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur.
Kapiler beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah
dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari
cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak
terjadi pembauran antara cairan – cairan yang keluar dari kolom.

2.3.4 Kecepatan arus

 Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi tercapainya
keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi
lebih teratur. Tetapi kecepatan arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial
dalam fasa mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan bahwa
pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan kolom yang panjang dan
sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai
apabila campuran yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan
dengan memasukan cairan elutor berenyai – renyai melalui kolom dan harus dijaga supaya
arusnya tidak berhenti. Komponen – komponen yang telah diadsorpsikan oleh adsorben akan
bergerak dalam bentuk gelang – gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda – beda
melalui kolom dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa tabung
yang dibubuhi tanda – tanda. Tabung – tabung ini ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor.
Setelah itu fraksi – fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki.

2.3.5 Perolehan data

Suatu integrator, jika berdasarkan mikroprosesor atau perakat lunak pc, hanya
mengukur jumlah total arus yang mengalir melewati lebar puncak suatu kromatografi. Untuk
melakukan hal ini , integrator mengukur laju peningkatan tegangan lebih kurang 30 kali
melintasi lebar puncak tersebut. Parameter yang menunjukan waktu pengukuran harus di
mulai adalah ambang batas puncak tersebut, yang menentukan tingkat ketika tegangan sinyal
tersebut harus di naikkan sebelum akumulasi sinyal terjadi. Untuk mencegah penyimpanan
aliran garis dasar, kemiringan kenaikan harus memiliki ketajaman tertentu sebelum di anggap
suatu puncak.

2.3.6 Perhitungan Efesiensi Kolom

Semakin lebar suatu puncak kromatografi yang sebanding dengan waktu retensinya,
semakin kurang efesien kolom pengelusinya.
Persamaan 1
dengan n adalah jumlah pelat teoretis.
Efesiensi kolom biasanya dinyatakan dalam pelat teoretis per meter:
n x 100/L
Pengukuran efesiensi kolom yang lebih ketat, terutama jika waktu retensi analit
tersebut singkat, di nyatakan dengan persamaan 2.
Persamaan 2
Dengan N eff adalah jumlah pelat yang efektif dan mencerminkan berapa kali analit
berpartisi antara fase gerak dan fase diam selama pergerakannya melalui kolom dan t’r =tr –
t0
N eff = 5, 54 (t’r : W1/2)²
Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H, “tinggi pelat teoretis”
H=L/N eff
Dengan h adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk berlangsungnya satu tahap partisi.
(Watson 2005)
3.3.7 Pemisahan pada kolom
Pada pemisahan campuran-campuran pada kolom, solut di cirikan dengan waktu
retensi (tR) dan faktor retensi (k’) yang berbanding lurus dengan D. Waktu retensi merupakan
lamanya waktu yang di butuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi dan faktor
retensi di hubungkan oleh persamaan berikut:
tR=tM(1+k’)
tM terkadang di tulis t0 dan di kenal sebagai waktu mati merupakan waktu yang di butuhkan
oleh solut yang tidak tertahan untuk melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan
bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak, karenanya perbandingan
distribusi (D) dan faktor retensinya adalah 0 akan tertahan secara profosional dan akan
mempunyai waktu retensi yang lebih besar dari pada tM, misal:
jika k’ = 1 maka tR= 2tM
jika k’ = 2 maka tR = 3tM
kondisi kromatografi umumnya di atur sedemikian rupa sehingga nilai k’ lebih kecil dari
pada 20 untuk menghindari waktu retensi yang terlalu panjang. Nilai k’ dapat di hitung
dengan menyusun ulang persamaan di atas:
tR=tM (1=k’) maka k’ = (tR-tM) / tM
dalam kromatografi ukuran eksklusi, solut di karakterisasi dengan volume retensi (Vr) yang
merupakan volume fase gerak yang di butuhkan untuk mengelusi solut dari kolom. Waktu
retensi berbanding langsung dengan volume retensi pada kecepatan alir yang konstan
sehingga persamaan di atas dapat di tulis kembali:
Vr=Vm (1+k’)
Sementara nilai k dapat di ganti dengan:
k’=D(Vs / Vm)
dengan menggabungkan kedua persamaan ini maka akan di peroleh:
Vr=Vm(1+D Vs / Vm)
Atau
Vr=Vm+DVs
Vs dan Vm masing-masing merupakann volume fase diam dan volume vase gerak dalam
kolom.
Persamaan tersebut merupakan persamaan pundamental pada kromatografi kolom karena
berhubungan dengan volume retensi solut terhadap perbandingan distribusinya

2.6. Penggunaan Kromatografi Kolom

Menganalisa zat pewarna alami dalam tumbuh-tumbuhan. Contohnya mengekstrak daun
atau wortel. Sampel terlebih dahulu dihaluskan secara manual dengan menggunakan mortar,
kemudian ditambahkan dengan pelarut organic yaitu n-hexane, hasil ekstraksi ini kemudian
disaring dan filtratnya dipanaskan diatas penangas air dan dibiarkan sampai mengental.
Kolom yang dipergunakan misalnya corong pisah yang berbentuk tabung (silinder), dalam
mempersiapkan kolom hal pertama yang perlu dilakukan adalah dengan memasang penahan
pada kolom, penahan yang dipergunakan adalah glass wool, hal ini dilakukan karena glass
wool memiliki kemampuan menyaring dan menahan penyerap lebih baik daripada
menggunakan kapas. Proses memasukan glass wool kedalam corong pisah dilakukan dengan
menggunakan pinset, karena selain dapat menyebabkan gatal pada tangan, glass wool juga
berbahaya jika terhirup. Jumlah glass wool yang ditambahkan secukupnya dan glass wool
yang sudah masuk corong pisah tidak boleh dipadatkan. Penyerap (Alumina/magnesia, silica
gel, karbon, magnesium silikat, magnesium kabonat, kalisum karbonat, dan aluminium
silikat). Penyerap ditimbang secukupnya dan dilarutkan dengan menggunakan pelarut organic
n-hexane sampai penyerap menjadi bubur, kemudian bubur penyerap dimasukan kedalam
corong pisah. Proses memasukan penyerap ini dilakukan dengan menggunakan spatula,
proses ini harus dilakukan dengan cepat karena pelarut yang dipergunakan adalah n-hexane
yang volatile maka bahan penyerap pun menjadi cepat mengering, dan jika bahan penyerap
mengering maka proses memasukannya menjadi lebih sulit.
Proses memasukan penyerap dalam corong dilakukan sebaik mungkin dan homogen
serta hindari terdapatnya gelembung udara, karena gelembung udara dapat menyebabkan
putusnya penyerap dalam kolom. Setelah penyerap dimasukan kedalam kolom, tahap
selanjutnya adalah memasukan kertas saring diatas penyerap sesusai dengan bentuk dari
kolom, pemberian kertas saring ini bertujuan untuk mendapatkan permukaan yang rata,
sehingga contoh akan dengan mudah merata. Contoh dimasukan kedalam kolom yang sudah
dilapisi kertas saring dengan menggunakan pipet tetes, penetesan contoh dilakukan secara
 perlahan dan dengan gerakan memutar sehingga contoh dapat menyebar dengan baik. Proses
selanjutnya adalah memasukan pelarut. Penambahan pelarut diatas contoh tersebut dilakukan
sedikit demi sedikit, dan ditambahkan kembali sedikit demi sedikit jika pelarut mulai
berkurang. Pelarut yang ditambahkan akan turun perlahan kebagian penyerap dan
membentuk pita-pita warna sesuai dengan jenis zat warna yang terkandung dalam contoh.
Pelarut tersebut akan turun dan keluar dengan dengan membawa zat pewarna yang terlarut
tersebut.
Kromatografi kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda pemisahan yang
cukup baik untuk sampel lebih dari 1 gram. Pada kromatografi ini sampel sebagai lapisan
terpisah diletakkan diatas fase diam. Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam
sehingga merupakan serbuk kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga
tidak terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel. Fase diam
dan sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari gelas, logam ataupun
plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gravitasi atau
ditekan dan juga disedot dari arah bawa. Komponen sampel akan terpisah selama bergerak
dibawa fase gerak didalam kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh
fase diam akan keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung
sebagai fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).

Kolom kromatografi Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya
beragam. Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya diameternya,
perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan. Perbandingan berat
sampel dan fase gerak (1 : 30) biasanya cukup memadai untuk pemisahan yang mudah,
perbandingan dapat ditingkatkan hingga (1:50) untuk komponen yang susah dipisahkan. Fase
diam Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase dian untuk KLT,
ukuran yang digunakan antara 63-250|iim. Ukuran partikel lebih kecil 63 jam fase gerak akan
mengalir lebih lambat, sehingga perlu ditekan atau dihubungkan dengan pipa hisap. Silika gel
(SiOi) adalah fase diam yang serba guna, banyak digunakan. Pada pembuatannya silika gel
perlu diaktifkan panaskan pada 150-160°C selama 3-4 jam. Fase diam lain adalah alumina.

Pemilihan Fase gerak (pelarut=solven = eluen) Pemilihan fase gerak sangat

menentukan berhasil tidaknya pemisahan. Untuk menentukan fase gerak yang akan
digunakan, dilakukan pendekatan:
1. Penelusuran literature/pustaka.
2. Mencoba dengan KLT. Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan
fase diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangfcan dengan fase gerak
non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar.
Membuat kolom (packing) Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau
cara kering. Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yang memberikan
pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk alumina.
Cara basah Kedalam ujung kolom kromatografi (tempat keluarnya fase diam) diatas keran
diletakkan gelas wool, tidak perlu ditekan kuat. Diatasnya ditaburkan pasir sehingga
membentuk lapisan tebal + 1 cm. Selanjutnya dimasukkan petroleum eter sambil mencoba
kecepatan menetes fase gerak dengan memutar keran. Di dalam beker gelas dibuat bubur fase
diam dengan petroleum eter. Dengan bantuan batang pengaduk bubur dimasukkan kedalam
kolom berisi petroleum eter. Sambil diketuk-ketuk butir-butir fase diam akan turun dan
tersusun rapi didalam kolom. Bila kolom penuh dengan petroleum eter keran dibuka untuk
menurunkan permukaannya dan petroleum eter yang keluar dapat digunakan lagi untuk
membuat bubur fase diam. Packing dihentikan sampai panjang kolom yang dikehendaki.
Selapis pasir diletakkan pada packing kolom untuk melindungi kolom. Kolom dijaga untuk
tidak kering, maka diatas lapisan pasir haras selalu ada selapis fase gerak. Pada proses
packing ini dinding luar kolom gelas disemprot dengan aseton. Penyemprotan dimaksudkan
untuk mendinginkan kolom sehingga menghambat terbentuknya gelembung udara. Adapun
untuk kolom yang diameternya kecil fase diam kering dapat ditaburkan sedikit demi sedikit
kedalam kolom yang berisi petroleum eter. Kolom ini digunakan setelah disimpan semalam.

Cara kering Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase gerak dimasukkan
lapis demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat penekan lain. Selain ditekan dapat juga
dibantu dengan dihisap, sehingga dihasilkan packing fase diam yang mampat. Diatas fase
diam diletakkan kertas saring dan diatasnya lagi sdapis pasir. Pada posisi keran terbuka fase
gerak dituangkan dan dibiarkan mengalir keluar. Packing kolom disimpan dengan
mempertahankan selapis fase gerak berada diatas lapisan pasir.

Penyiapan Sampel Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai,
kemudian dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak dikeluarkan tetes demi tetes,
diatur kecepatan menetesnya (tergantung besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom tetap
terendam, untuk itu ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing
kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume fraksi tergantung berat
sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat proses awal elusi ini. Makin kecil
volume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih baik, namun akan dikumpulkan banyak
fraksi. Untuk 10 gram sampel biasanya dikumpulkan fraksi dengan volume a 150 ml. Cara
meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah dengan mencampur dengan fase diam.
Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, biasanya pelarut yang digunakan
adalah pelarut yang digunakan untuk pembuatan ekstrak. Larutan ekstrak ini kemudian
dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hati-hati campuran ini dikeringkan
didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk ekstrak kering. Serbuk ini ditaburkan
diatas packing kolom dan ditutup dengan selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.

Elusi (pengembangan) Fase gerak (cairan =pelarut pengembang) Fase gerak

dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi sedikit atau dialirkan dari
bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. Cara
yang praktis adalah dengan memasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah
dimasukkan kedalam kolom dan ujung lain tertutup, sedangkan keran terbuka. Fase gerak
akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan keluarnya fase gerak dari kolom. Dibedakan
dua jenis cara elusi: Elusi isokratik yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak dengan
polaritas tetap. Elusi gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak
berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah maka komposisi fase
gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase gerak non polar kemudian berubah kepelarut
yang polar. Perubahan ini dapat diprogramkan sesuai dengan pemisahan yang diinginkan.
Elusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi sampel yang dapat dibawa keluar lagi oleh fase
gerak, bila digunakan elusi gradien sudah sampai pada fase gerak yang paling polar.

Mendeteksi komponen yang dipisahkan Kromatografi kolom yang konvensional tidak

dilengkapi detektor, namun sekarang dapat digunakan dengan mengalirkan eluate (efluen)
pada detektor untuk mendeteksi komponen. Yang umum digunakan dan mudah dikerjakan
adalah dengan memonitor fraksi dengan KLT. Fraksi yang mempunyai profil bercak KLT
yang mirip digabungkan. Selanjutnya gabungan ini dapat dianalisis lebih lanjut. Pada kolom
partisi umumnya suatu pelarut tidak campur air diadsorpsi pada suatu padatan inert, sebagai
cairan fasa diam. Larutan analit ditempatkan pada bagian atas kolom, kemudian dicuci
dengan pelarut kedua hingga analit keluar dari kolom. Pelarut kedua= fase gerak = eluen
=bisa berupa campuran pelarut mungkin juga yang mengandung bufer

Alat kromatografi kolom sederhana, terdiri dari kolom dari kaca yang ada kranya.
Umumnya panjang kolom minimum 10x diameter pipa kaca yang digunakan dan labu
Erlenmeyer sebagai penampung eluen. Fasa diam berupa adsorben yang tidak larut dalam
fasa gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam. Adanya pengotor dalam fasa diam dapat
menyebabkan adsorbsi tidak reversible. Sebagai fasa diam digunakan alumina, silica gel,
arang, bauksit, kalsium karbonant, bauksit, magnesium karbonat, pati, talk, selulose, gula,
tanah diatom. Pengisian fasa diam ke dalam kolom dapat dilakukan dengan cara kering dan
cara basah. Pada cara basah fasa diam dibuat bubur dulu dengan pelarut yang akan digunakan
untuk fasa gerak, baru kemudian dimasukkan kedalam kolom. Fasa gerak dalam kromatografi
kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi
tertentu. Pelarut dapat polar atau non polar dengan berat molekul kecil lebih cepat
meninggalkan fasa diam.
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode
kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar. Pada kromatografi
kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita bagian atas kolom penyerap
yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastic. Pelarut (fase
gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran ini disebabkan oleh gaya berat atau di
dorong dengan tekanan. Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan,
silica gel, kilsegur terkalsinaasi, dan kilsegur kromatografi murni) dalam keadaan kering atau
sebagai bubur, dimampatkan ke dalam tabung kaca atau tabung kuwarsa dengan ukuran
tertentu dan mempunyai lubang mengalir keluar dengan ukuran tertentu.Sediaan yang diuji
dan dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada puncak kolom dan dibiarkan mengalir
ke dalam zat penyerap. Zat berkhasiat diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada puncak kolom.
Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut, dengan atau tanpa tekanan udara, masing-
masing zat bergerak turun dengan kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom
yang disebut kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh beberapa faktor
misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut dan suhu dari sistem kromatografi. Jika
dikehendaki pemisahan beberapa zat khasiat dapat dilakukan dengan mengalirkan selanjutnya
pelarut yang sama atau pelarut lain yang mempunya daya elusi yang kuat .
Teknik pemisahan kromatografi kolom dalam memisahkan campuran, kolom yang
telah dipilih sesuai ukuran diisi dengan bahan penyerap (adsorben) seperti alumina dalam
keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan
batang pemanpat (pengaduk) untuk memanpatkan adsorben dengan gelas wool pada dasar
kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga
terhindar dari gelembung-gelembung udara. Untuk membantu homogenitas pengepakan
biasanya kolom setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu.
Sejumlah cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom
dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran
diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom, dengan penambahan pelarut (eluen) secara terus-menerus, masing-
masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan
terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen.
Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke
bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan.
Jika kolom cukup panjang dan semua parameter pemisahan betul-betul terpilih seperti
diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka akan terbentuk pita-pita
(zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar dari
kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom.
Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya, misalnya
dengan cara titrasi atau spektofotometri.
2.6.1 Analisis farmasi
Pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin
dan molekul penting lainnya.

2.7. Manfaat Kromatografi Kolom

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar.
Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein.
Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified
(dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa
diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan
mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat
pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam
menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat
mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat
diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui
konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan
fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu
penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi
senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney
stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau
lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.

2.8. Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom

2.8.1 Kelebihan kromatografi kolom :
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative. Digunakan untuk menentukan
jumlah komponen campuran. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi.

2.8.2 Kekurangan kromatografi kolom :

Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual. Metode ini
sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming).