PEMBAHASAN

2.1 Kromatografi Secara Umum

2.1.1 Pengertian Kromatografi

Kromatografi di tahun 1903 Tswett menemukan teknik kromatografi. Teknik ini bermanfaat
sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen
terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase
bergerak dan fase diam terjadi apabila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah
cairan yang terikat pada permukaan atau di dalam pori. Ini adalah sorpsi (penyerapan). Laju
perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap
secara langsung berhubungan dengan bagian molekul-molekul tersebut diantara fase bergerak
dan fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing
komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik
masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi, masing-masing komponen keluar dari
kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat bahwa proses keseluruhannya adalah
fenomena migrasi secara diferensial yang dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif
berupa aliran fase bergerak.

2.1.2 Klasfikasi Metode Kromatografi

Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokan dengan hanya meninjau suatu

macam sifat. Artinya kita dapat menyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi
pelarut, penukar ion ke dalam satu kelas, tetapi teknik tersebut dapat juga diklasifikasikan
dengan berdasarkan metode-metode differential migration. Pada semua metode differential
migration, pemisahan berbagai komponen campuran yang bermigrasi pada berbagai medium
tergantung pada karakteristik laju individual komponen-komponennya, sehingga dapat
dikatakan bahwa dalam kalsifikasi, sesungguhnya terjadi tidak hanya satu sifat fisis saja yang
ditinjau tetapi ganbungan-gabungan yang digunakan dalam teknik pemisahan. Semua
metode-metode pemisahan dapat diklasifikasikan seperti dalam tabel 2.1, didasarkan pada
sifat fisiknya dan pemisahan fasenya.

Tabel 2.1 Klasifikasi Kromatografi

Memebedakannya dalam fase

Pemisahan fase kedua
tunggal
No Dasar
Dengan Dengan Konsentrasi tidak
Dengan reagen
panas bidang batas seragam
1. Penguapan Destilasi - -
Koefisien
2. - Kromatografi gas - -
partisi
3. Penukaran - Penukar ion - -
Aktivitas Adsorpsi pada
4. - - Foam fraction
permukaan kromatografi gas-padat
Ukuran Moleculer sieve
5. - - -
molekuler
 Filtrasi gel

Analisis eksklusi ion

6. Migrasi listrik - - - Elektro foresis

Dibandingkan dengan metode pemisahan secara keseluruhan, klasifikasi metode

kromatografi, relative lebih sederhana. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan
fas diam dapat berupa zat cair atau padat. Jadi kita memiliki kombinasi cair-cair, gas-cair,
gas-padat. Jika pemisahan terutama meliputi suatu partisi sederhana antara fase diam cair dan
fase gerak cair juga, maka proses ini dikenal sebagai kromatografi partisi. Jika gaya fisika ke
permukaan terutama meliputi kemampuan retensi dari fase diamnya, maka proses disebut
sebagai kromatografi adsorpsi. Jika fase bergeraknya adalah gas, metode ini disebut sebagai
kromatografi gas cair atau kromatografi gas-padat.

Untuk senyawa yang mudah menguap, kromatografi gas merupakan cara yang menawarkan
resolusi tinggi, waktu analisis pendek dan kepekaan di daerah ppm. Metode kromatografi cair
memanfaatkan fase gerak cair untuk menggeser sampel sepanjang kolom partisi yang diisi
oleh pengadsorpsi padat atau zat padat yang diselimuti cairan seperti dalam HPLC. Di dalam
kromatografi, pertukaran ion ikatan kimia heteropolar terbentuk secara reversible antara
komponen-komponen ion di dalam fase bergerak dan fase diam. Penyerapan gel atau filtrasi
gel adalah suatu contoh kromatografi eksklusi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis
tipis adalah contoh-contoh kromatografi partisi. Suatu deskripsi singkat dari berbagai metode
pemisahan akan dibahas berikut ini untuk mengetahui prinsip-prinsip dasar dan aspek-aspek
analitik masing-masing metode.

a. Destilasi : ini adalah penguapan zat cair dan kondensasi dari uap kembali ke fase cair.
Penguapan zat cair sebanding dengan tekanan uapnya dan berbanding terbalik terhadap titik
didih cairnya. Sublimasi juga suatu metode pemisahan baik. Keberhasilan metode ini
tergantung pada kemudahan massa transfernya dilaksanakan jika zat berada dalam fase gas.

b. Ekstaraksi pelarut.

c. Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan

kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusizat terlarut
dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram. Prinsip kromatografi adsorpsi
berhubungan juga dengan bidang-bidang lain seperti kromatografi zat padat. Pemisahan
campuran ionik atau bermutan dengan differential migration dibawah pengaruh gaya
pendorong potensial listrik telah dikembangkan. Pertama meliputi migrasi bebas dalam
medium homogen dan migrasi kedua yang terjadi pada medium berpori yang stabil. Pertama
disebut sebagai elektrofase dan yang kedua dikenal sebagai ionoforesis atau elektromatografi.
Teknik yang kedua banyak diapakai dalam pemisahan.

d. Teknik ring oven : teknik ini berkaitan dengan pengujian suatu tetesan tunggal larutan
pada suatu kertas menyaring untuk mengetahui komponen-komponen larutan. Larutan
ditetesi satu kali pada pusat kertas saring (yang berbentuk lingkaran), kemudian satu atau
beberapa komponen sampel akan terekat pada kertas dengan pengendapan. Komponen-
komponen terlarut dipindahkan dengan pelarut yang tepat sehingga bergeser dari pusat
sampai bagian tepi kertas saring. Begitu larutan mencapai bagian tepi, penguapan pelarut
terjadi dan zat terlarut akan tertinggal pada suatu area dalam bentuk cincin-cincin yang
manunjukkan bahwa pemisahan dari bercak tetesan mula-mula.

e. Zone melting : di sini dua wilayah tertentu yang meliputi penampang lintang suatu zat
padat dilelehkan dengan perlahan-lahan digerakkan sepanjang batang zat padat. Zat terlarut
akan dibebaskan pada saat pembekuan pada bidang batas padat-cair dan terbawa sepanjang
wilayah serta akan menggumpal pada salah satu ujung zat padat. Imi merupakan proses
selektif untuk mengluarkan pengotor.

f. Penukar ion. Dalam ekslusi sifat-sifat fisika materi sintetik baru memberikan suatu era
baru terhadap pemekaian materi-materi tersebut dalam pemisahan secara difusi. Misalkan
dalam pengaliran larutan dengan pelarut air melalui resin, zat yang bersifat non ionik akan
mendistribusikan dirinya sedemikian rupa sehingga dapat melalui fase resin, sedangkan yang
senyawa ionik ditolak dari fase resin.

g. Dialisis : osmosis adalah proses pemisahan berdasarkan difusi yang paling dikenal dan ini
disebabakan aliran spontan sutu pelarut melalui membrane dari larutan yang encer ke larutan
yang lebih pekat. Membrannya bersifat semi permeabel terhadap partikel zat terlarut. Dialisis
dan osmosis sering kali terjadi secara spontan di dalam system. Dengan dialisis garam-garam
dapat dipisahkan dari suspense koloid.

h. Presipitasi, kopresipitasi dan sebagainya. Ini adalah suatu proses dimana suatu zat terlarut
diubah ke bentuk tidak larut yang selanjutnya dapat dipisahkan dari larutannya.

i. Flotasi : senyawa-senyawa dengan kerapatan lebih besar dari pada cairan yang
menyelimutinya dapat dikonsentrasikan pada permukaan zat cair. Ini dikenal sebagai
pemisahan dengan teknik flotasi. Pengaliran udara melalui larutan diperlukan pada metode
ini. Suatu partikel dapat distabilkan pada permukaan seperti bidang batas permukaan gas-cair
jika suatu kontak antara padatan dan cairan nilainya tertentu. Perbedaan sudut kontak ini
menghasilkan flotasi selektif. Bagaimanapun hanya metode kromatografi yang mempunyai
peranan sangat berarti dalam analitik.

2.1.3 Terminologi Kromatografi

Kromatografi dapat dilukiskan dengan berbagai istilah. Istilah yang paling sering dijumpai
adalah nilai Rf juga dikenal sebagai faktor retardasi, atau dinyatakan juga sebagai volume
retensi (VR) atau waktu retensi (tR). semua ini adalah suatu besaran yang menyatakan berapa
lama fraksi waktu molekul zat terlarut tinggal dalam fase bergerak. Masing-masing senyawa
mempunyai nilai R atau VR yang berbeda dengan berubahnya kombinasi pelarut penyerap.
Suatu koefisien partisi (Kd) menyatakan konsentrasi zat terlarut dalam tiap fase. Jika Cs, CM
adalah konsentrasi zat terlarut dalam fase diam dan fase bergerak, maka Kd = Cc / Cm. faktor
retardasi (Rf ) menyatakan perbandingan kecepatan pergeseran zat terlarut terhadap senyawa
standar ideal yang tidak terlarutkan ataupun yang tidak teradsorpsi oleh fase diam. Berarti
untuk zat senyawa standar Kd = 0, sedangkan R adalah

Jika tm, ts adalah waktu tinggal molekul di dalam fase bergerak dalam fase diam. Jika
penampang lintang dan Kd tidak konstan sepanjang lintasan zat terlarut, kita memiliki Rf
sebagai berikut :
Karena kecepatan gerak zat pelarut lebih besar dari pada fase bergerak, maka R lebih besar
dari Rf sebesar 15%. Jika R adalah fraksi zat terlarut pada keadaan kesetimbangan pada fase
berserak, maka (1- R) adalah fraksi zat terlarut pada keadaan kesetimbangan di fase diamnya.
Maka :

Dimana : CM = volume fase bergerak

VM = konsentrasi fase bergerak
CS = volume fase diam
VS = konsentrasi fase bergerak

Pada kromatografi adsorpsi Vs dapat menggantikan As dan dipunyai

Jika As adalah luas daerah fase diam. Persamaan untuk faktor retardasi adalah mirip dengan
%E, persen ekstraksi dalam ektraksi pelarut yang menyatakan

, maka

Karena D ≈ KD, sedangkan Vw dan Vo adalah volume fase air dan fase organic. Dalam suatu
kromatografi kolom, maka terdapat volume yang cukup berarti dari fase gerak yang
meninggalkan kolom pada saat jumlah zat terlarut mencapai maksimum ketika meninggalkan
kolom. Keadaan puncak maksimum zat terlarut dicapai pada saat seoaruh zat terlarut sudah
terelusi dengan volume retensi V (juga dikenal dengan Vmaks) dan separuh lainnya masih
tinggal di dalam kolom pada fase gerak VM + Vs dimana

VR CM = VM CM + VS CS

VR = VM + VS x Kd

2.1.4 Prosedur Kromatografi

Untuk melaksanakan pemisahan secara kromatografi kolom, ada tiga cara dapat dilakukan :

a) Analisi frontal

b) Analisis elusi

c) Pergeseran

Dalam arus kromatografi, effluent dikumpulkan dalam fraksi-fraksi yang berbeda dan
masing-masing komponen terdeteksi dalam aliran effluent. Pada analisis frontal, larutan
contoh dilewatkan secara kontinu melalui pengadsorpsi. Pusat-pusat aktif mengadsorpsi akan
di duduki oleh komponen yang lebih kuat teradsorpsi sedangkan komponen yang kurang kuat
teradsorpsi berakumulasi pada fase yang bergerak. Pada mulanya pelarut murni dan zat
telarut A yang teradsorpsi paling lemah akan meluncur ke luar kolom. Jika di plotkan %E
terhadap volume effluent, maka diperoleh suatu kurva yang berbentuk tangga, dimana bagian
datarnya menyatakan keluarnya suatu komponen zat terlarut. Pada zat-zat terlarut yang
sedikit teradsorpsi, analisis frontal akan memeberikan hasil yang baik bila kolomnya sempit
dan volume yang digunakan kecil. Analisis elusi adalah teknik yang paling popular. Eluent
(dapat saja pelarut murni) dilewat melalui kolom yang dapat menyebabkan differential
migration zat-zat terlarut dalam fase bergerak. Jika laju alirannya tertentu, maka pemisahan
tergantung pada KD. Jika masing-masing komponen mempunyai perbedaan KD besar, masing-
masing komponen akan terpisah sempurna. Pada teknik penggeseran, pemisahan tercapai
dengan mengalirkan suatu reagen yang teradsorpsi lebih kuat ke dalam kolom. Agen
penggeseran ini teradsorpsi dan konsentrasi pada suatu wilayah puncak kolom. Semua
komponen sampel terdorong keluar dan oleh pergerakan maju agen penggeser sepanjang
kolom. Terbentuklah wilayah-wilayah dengan kekuatan penyerapan yang makin menurun.
Komponen yang paling lemah terikat akan keluar pertama dari kolom sedangkan agen
penggeser akan keluar terakhir. Keuntungan teknik ini adalah kolom dapat diisi dengan
sampel cukup banyak. Untuk tujuan prepatatif, kadang kala pemisahan yang sempurna tidak
tercapai, meskipun tailing sudah diusahakan seminimum mungkin. Metode penggeseran
sangat bermanfaat dalam kromatografi partisi.

Elusi secara bertahap (gradient elution) merupakan salah satu variasi kondisi elusi selama
terjadinya pemisahan. Pada kroatografi gas, cairan dengan kemampuan menggeser lebih kuat
digunakan. Dengan cara demikian pelebaran pita dan waktu elusi yang terlalu lama dapat
dihindarkan.

2.1.5 Dinamika Kromatografi

Efektivitas pemisahan tergantung pada penguraian komponen-komponen pada saat

komponen tersebut berpindah dan kepadatan wilayah yang ditempati komponen-komponen
tersebut. Oleh karena itu ukuran efisiensi kolom dapat dinyatakan oleh jumlah piringan :

W = lebar puncak elusi

We = lebar kurva elusi kesetimbangan (yaitu tengah – tengah jarak Cmax dan W)

Kolom dapat dibagi atas sejumlah piringan dimana dianggap kesetimbangan sempurna terjadi
antara fase bergerak dan fase diam pada masing-masing piringan. Jumlah piringan dan tinggi
piringan adalah suatu indeks efisiensi kolom yang berguna untuk menggambarkan seberapa
jauh suatu puncak dan wilayah pita telah melebar sebagai akibat fenomena transpor fisika.
Biasanya tinggi piringan dinyatakan sebagai ∆ atau H = L/N.

Tingkat pemisahan dua komponen adalah suatu masalah yang umum dijumpai dalam semua
metode kromatografi. Pada prakteknya yang dapat dilakukan adalah meminimalkan
tumpangsuh (overlap) atau kontaminasi timbal balik antara wilayah-wilayah yang berdekatan
ke suatu tingkatre solusi eksperimental yang dikehendaki, yaitu :

Z = pemisahan pusat wilayah atau puncak Gaussian dan = deviasi standar zona.

Jika Rs < 1,0, tumpangsuh (overlap) terjadi. Kontaminasi terjadi terutama pada titik tengah
antara wilayah tumpangsuh pada jarak dibawah jarak 2 , yaitu 2%, Rs = 1,5 tidak ada
kontaminasi timbal balik. Dapat dikatakan :

Dimana W2 dan W1 = lebar pucak rata-rata. Pada umumnya makin besar jumlah piringan
makin baik resolusinya. N dapat diperbaiki dengan memeperpanjang. Tetapi memperpanjang
kolom saja tidak bermanfaat. Yang lebih baik adalah memperbesar jumlah piringan dan
penampang kolom yang sempit.
Untuk memperoleh analisis yang sempurna diperlukan pemilihan kondisi sehingga nilai
waktu retensinya tidak terlalu besar. Unutk analisis effluent secara kontinu, perlengkapan
otomatis dan kolektor fraksi sangat tepat digunakan. Hendaknya yang diukur merupakan sifat
yang berfungsi secara linear terhadap sifat fase bergeraknya. Jumlah total dari zat terlarut
yang terelusi diukur dari luas puncak kurva elusi.

2.2 Definisi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber
pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa
lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca,
plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap
(adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan
bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen
kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal
inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al, 1995).

Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap
adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan
tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan
eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan
kecepatan yang berbeda-beda.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan yang memisahkan terdiri
atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau
lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak
atau pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan
pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler
(pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi.
Deteksi dilakukan dengan menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).

Teknik ini dikembangkan tahun 1938 Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada
lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan menyerap
sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini di kenal juga sebagai kromatografi
kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan
pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel, tetapi kadang
kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan. Untuk fase diam hidrofilik
dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, disperse koloid plastic, silica terhidrasi.
Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorbsi digunakan suatu aplikator. Sekarang
inin telah banyak tersedia kromatografi lapisan tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca
yang telah terlapisi, kromatotube, dan sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus
terkendali agar didapat hasil analisis yang reprodusibel.

Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi
yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu
mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample diteteskan pada salah satu bagian tepi
pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat
dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertical searahgerakan pelarut. Teknik
ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan yang dilakukan pada temperature
kamar, sampai permukaan pelarut mencapai tinggi 15-18 cm. waktu yag diperlukan antara
20-40 menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat di pakai juga
untuk kromatografi lapis tipis. Resolusi KLT juah lebih tinggi daripada kromatografi kertas
karena laju difusi yang luar biasa kecilnya pada lapisan pengadsorpsi. RRPC dapat juga
dilakukan pada kromatografi lapisan ini, dengan menggunakan lapisan yang sudah
dicelupkan lebih dahulu pada perafin, minyak silikon, dan lain-lain. Pelarut yang digunakan
adalah CH3COOH atau asetonitril. Kadangkala untuk RPPC, waktu yang diperlukan cukup
lama.

Zat-zat warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent penyemprot untuk
melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk zat organic. Demikian juga
penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan. Untuk menempatkan posisi suatu zat,
reagent dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang lainnya dapat diperoleh
kembali tanpa pengotoran dari reagent dengan pengerokan setelah pemisahan selesai.

Untuk analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya dapat dilakukan
dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens atau dengan reaksi
kolorimeter dengan reagent kromogenik.

Aplikasi KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu
labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Ia dapat pula untuk memeriksa
adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia foresik menggunakan KLT untuk bermacam
pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticizer, antioksidan, tinta dan formulasi zat pewarna
dapat ditentukan dengan KLT. Pemakaiannya juga meluas dalam pemisahan anorganik.

2.3 Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa kelebihan KLT yaitu:

1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi,

atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan
cara elusi 2 dimensi.

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.

5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.

7. Jumlah perlengkapan sedikit.

8. Preparasi sample yang mudah

9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT yaitu:

1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.

2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.

3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

2.4 Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan

perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang
(Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara
pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni
digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan
antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan
gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa
geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam,
kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

2.5 Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya
digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari
pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Seringkali bentuk plat
kaca / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap
sebagai “standard”. Hal yang penting yaitu bahwa permukaan dari plat harus rata. Plat -plat
kaca / aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergent kemudian
dikeringkan. Terakhir, dapat dicuci dengan aseton, tetapi hal ini tidak mesti dilakukan. Satu
hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh permukaan dari plat yang bersih dengan jari
tangan karena bekas jari tangan yang menempel akan merubah tebal dari permukaan
penyerap pada plat.

Untuk membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi
bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk sampai
rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan merupakan faktor yang
paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal standard adalah 250 mikron. Lapisan-
lapisan yang lebih tebal ( 0.5 - 2.0 mm ) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang
sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20
x 20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila
kering.
Tabel 2.2 Perbandingan untuk membuat bubur penyerap

Penyerap Medium bubur penyerap Perbandingan, gram dalam ml

Silika gel Metilena klorida : methanol (2:2, v/v) 35 gr dalam 100 ml
Serbuk selulosa Metilena klorida : methanol (50:50, v/v) 50 gr dalam 100 ml
Alumina Metilena klorida : methanol (70:30, v/v) 60 gr dalam 100 ml

Sifat yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat tersebut.
Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron. Partikel yang butirannya
sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk
menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus.
Sedangkan dalam kolom partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut
menjadi lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih
cepat. Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan-pemisahan dalam
kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut :

Tabel 2.3 Macam-macam penyerap untuk kromatografi lapisan tipis

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Asam- asam amino, alkaloid, gula,

asam-asam lemak, lipida, minyak

Silika
esensial, anion, dan kation organic,

sterol, terpenoid.
Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,

Alumina vitamin-vitamin, karoten, asam-asam

amino
Gula, oligosakarida, asam- asam

Kieselguhr lemak, trigliserida, asam -asam

amino, steroid.
Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati Asam-asam amino
Sephadex Asam-asam amino, protein

2.6 Definisi Kromatogram

Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis
di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan
tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh
dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari
campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan. Pelarut
dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan
maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut
dan fase diam.

2.7 Fase Diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter
partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin kecil ukuran rata-rata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja
KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Silika gel salah satu contoh fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom
silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada
permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel
silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta
penggunaannya mirip silika gel.

Tabel 1. Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)

Fasa Diam Mekanisme Sorpsi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida, karbohidrat
Selulosa penukar Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-
ion ion logam
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam
Interaksi adsorpsi
Β-siklodekstrin Campuran enansiomer
stereospesifik

Adsorben yang sering digunakan antara lain :

a) Silika gel

Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering ditambah
CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga. Penambahan ini juga
mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat ditambahkan indicator fluoresensi yang
akan berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga noda yang mengabsorpsi pada
frekuensi ini menjadi sangat kontras terhadap latar belakang yang berfluoresensi hijau
kuning. Silica gel sangat higroskopis, pada humaditas relative 45 – 75% akan menarik air
sampai 7 – 20%. Derajat diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana
pemisahan akan dilakukan atau tempat penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian juga penting
karena dapat mempengaruhi watak kromatografi beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam
adsorben ini dapat juga menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.

b) Alumina

Bersifat basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia hingga untuk
senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah Ca2SO4 dan indicator
fluoresensi.

c) Kieselguhr (tanah diatome)

Merupakan adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga kecil. Dapat
ditambahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan memberikan adsorben campur yang
kurang aktif. Juga dapat ditambah Ca2SO4.

d) Selulosa

Dengan menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis yang sifatnya analog
dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang baik tanpa pengikat. Adsorben ini
dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca asetat. Kerugian penggunaan selulosa ini ialah
tidak dapat digunakannya pereaksi yang korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruktif
lainnya.

e) Poliamida

Merupakan magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben lainnya. Biasanya
ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum. Mempunyai kapasitas yang besar dan
banyak digunakan untuk pemisahan fenol.

Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan penting pada
proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu
pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan
relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel
silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” (Watson,
2010).

2.8 Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil
digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di atasnya.
Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk
menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika
semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai
kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam
gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis.
Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap
pelarut.

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari
campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna
yang berbeda.

Diagram menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut
diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan
pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari
pelarut dan fase diam.

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan
dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga Rf
meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.
Seperti halnya pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga

standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku untuk campuran
tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk
berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).

2.9 Deteksi Bercak

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1. Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu
berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika disinarkan
sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari
bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena
jika kita mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.

2. Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan
cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.
Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin
bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau
dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis
tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

2.10 Instrument Kromatografi Lapis Tipis

1. Detektor

Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers. Komponen

didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube (tabung vakum
photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali),
struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral sensitivity 185-
850 nm).

Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan seberkas cahaya dan
sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut dengan efek fotoelektrik
dengan kondisi hampa udara.

Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul dan
dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan dan keluar
mengenai anoda. Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi W (eV), yang dikenal
sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki fungsi kerja yang berbeda
pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai permukaan fotosensitif, dibawah panjang
gelombang pancung (cutoff wavelength) λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun,
akan menyebabkan terjadinya pemancaran fotoelektron.

Cahaya yang masuk difokuskan dengan melewati focusing electrode dan elektron mengenai
dynode pertama kemudian dipantulkan dan dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode
yang terakhir (proses pengalian) sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul
tegangan.
2. Monokromator

Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi
dengan satu panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar tampak dan
infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau
grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan
monokromator grating Czerney-Turney

Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya menjadi sinar
monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah prisma, maka cahaya
tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat berbagai warna merah, jingga,
hijau, biru, dan lain-lain).

3. Absorbansi

Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang diperlukan
untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi (atau
dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat). Dengan spektroskopi dari cahaya
transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.

Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan tingkat
energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang
diserapnya.

Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:

E = h x ν = h x C /λ = h x C / v

dimana, E = energi yang diserap

h = tetapan Planck = 6,626 x 10-34

v = frekuensi

C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det

λ = panjang gelombang

ν = bilangan gelombang

Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau logaritma
Io/It.

A = log (1/T) = log (Io/It) = - log (T) (1.4)

dimana, A = Absorbansi / serapan

Io = Intensitas sinar yang datang

 It = Intensitas sinar yang diteruskan

T = Transmitance / transmitansi

4. Transmitansi

Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu larutan
dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas radiasi
yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. Transmitansi dengan simbol T dari larutan
merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu : T =
It/Io. Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).

2.11 Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga
mempengaruhi harga Rf adalah :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan
molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap
akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase
bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang
sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat
(kalau ada) dicampur hingga homogen.

3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal
lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula
dalam daerah yang kecil dari plat.

4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan
tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang
dipakai harus betul-betul diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

6. Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena
cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

7. Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda
dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan
mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.

8. Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk
mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan
atau perubahan-perubahan fase.

9. Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas,
hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala
bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran,
akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase
bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

2.12 Aplikasi KLT Pada Bidang Pangan

Pada penelitian analisis kualitastif pewarna rhodamin B dalam sampel saus tomat. Sampel
dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis. Zat warna dari sampel saus tomat ditarik
kedalam benang wol bebas lemak dalam suasana asam sampai benang wol tersebut terwarnai
oleh pewarna saus tomat.

Setelah benang wol terwarnai oleh pewarna saus tomat, pewarna tersebut dilepaskan ke
dalam larutan basa. Larutan basa tersebut selanjutnya akan digunakan sebagai cuplikan
sampel pada analisis Kromatografi Lapis Tipis. Noda totolan sampel dibandingkan dengan
noda totolan baku standar rhodamin B yang telah dieluasi bersama-sama dan dilihat di bawah
lampu UV pada λ 366 dan λ 254 nm, apabila terdapat zat pewarna rhodamin B dalam sampel
maka noda pada lempeng KLT akan berflouresensi di lampu UV pada λ 366 nm dan tidak
berflorousensi dilampu UV pada λ 254 nm, pada penelitian ini noda totolan sampel pada
lempeng KLT tidak menunjukan flouresensi di lampu UV pada λ 366 nm, sehingga dapat
disimpulan bahwa pada sampel saus tomat ini tidak terkandung zat pewarna rhodamin B

1. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi

dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau
cair) dan fase gerak (cair atau gas).

2. KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap
(adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan
bergerak mengikuti kepolaran eluen,

3. Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya memerlukan waktu untuk
menentuan sistem eluen yang cocok.

4. Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau

partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.
5. Pembuatan lapis tipis KLT dimulai dari penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang
kondisi bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan
tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana
kromatografi. Seringkali bentuk plat kaca / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm atau
20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai “standard”.

6. Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.

7. Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Fasa gerak/eluent yang
berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam
(adsorbent).

8. Kerja dengan KLT dimulai dari penyiapan plat, eluen dan sampel, penotolan, elusi, dan
deteksi bercak/noda.

9. Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat kimia tertentu.

10. Terdapat beberapa instrument pada kromatografi lapis tipis diantaranya adalah detector,
monokromator, absorbansi, dan transmitansi.

11. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang
juga mempengaruhi harga Rf adalah :

a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

b. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

c. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

d. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

e. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

f. Teknik percobaan.

g. Jumlah cuplikan yang digunakan.

h. Suhu

i. Kesetimbangan.