M Ccba LB 02

Manual de Técnicas para Análisis Bacteriológico en Veterinaria
Código: M-CCBA-LB-02 Revisión: 02 Página: 1 de 95

Fecha de emisión: Fecha de modificación:
19 de abril de 2010 31 de agosto de 2016
Manual de
Técnicas para Análisis
Bacteriológico en
Veterinaria
ÍNDICE
Objetivo / Pág. 4
Alcance / Pág. 4
Políticas / Pág. 4
Contenido, Introducción / Pág. 5
Conceptos Generales / Pág. 5
Técnicas de Siembra o Inoculación para el cultivo de bacterias / Pág. 8
 Esterilización a la flama / Pág. 9
 Aislamiento puro de un cultivo bacteriano / Pág. 10
 Morfología de las colonias bacterianas / Pág.12
Elaboración de frotis fijo / Pág. 13
Técnicas de tinción para el cultivo de bacterias / Pág. 16
 Tinción de Gram/ Pág.16
 Tinción de esporas/ Pág. 18
 Tinción de cápsula / Pág. 20
Técnicas para el aislamiento de bacterias / Pág.21
 Bacteriológico de vísceras o general/ Pág. 21
 Bacteriológico de agua (Coliformes Totales y Fecales, Conteo de Mesófilos y
Determinación de Salmonella / Pág. 23
Estimación del NMP de organismos coliformes / Pág.25
Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA) / Pág. 38
Determinación de Salmonella spp en muestras de Agua / Pág. 46
 Bacteriológico alimento (Cuantificación Coliformes Totales, Cuantificación
Mesófilos, Cuantificación Staphylococcus y Determinación de Salmonella)/
Pág. 47
Cuantificación de Coliformes Totales por el método de vaciado en placa/
Pág. 47
Cuantificación de Mesófilos por el método de vaciado en placa (BMA) en
alimentos/ Pág. 52
Cuantificación de Staphylococcus aureus / Pág. 53
Determinación de Salmonella / Pág. 57
 Bacteriológico de Leche (Diagnóstico Mastitis, Cuantificación
Staphylococcus, Cuantificación Mesófilos y Cuantificación Coliformes) /
Pág.64
Diagnóstico Mastitis / Pág. 64
Cuantificación Staphylococcus / Pág. 66
Cuantificación Mesófilos / Pág. 66
Cuantificación Coliformes / Pág. 66
 Urocultivo / Pág. 66
 Coprocultivo /Pág. 68
 Bacteriológico Semen / Pág. 69

 Antibiograma / Pág. 70
 Tinción de Ziehl – Neelsen / Pág. 74
 Bacteriológico de Medio ambiente (Aire) / Pág. 76
 Aislamiento de Campylobacter spp. / Pág. 77
Campylobacter en alimentos / Pág.78
Procedimiento a partir de heces / Pág. 79
Procedimiento para carne de heces / Pág. 79
Pruebas Bioquímicas Primarias / Pág. 83
Oxidasa / Pág. 83
Catalasa / Pág. 83
Hidróxido de potasio al 3% / Pág. 84
Movilidad en gota suspendida / Pág. 84
Prueba de Coagulasa / Pág. 85
Pruebas Bioquímicas secundarias / Pág. 86
Agar de Hierro y Tres Azucares (TSI) / Pág.86
Citrato de Simmons/ Pág. 88
Lisina Hierro Agar (LIA) / Pág. 89
Sulfuro de Hiero-Indol-Motilidad (SIM) / Pág. 89
Leche Tornasolada / Pág. 90
Rojo de Metilo / Pág.90
Reducción de Nitratos / Pág.91
Fermentación de Carbohidratos / Pág.92
Hidrólisis de la Esculina / Pág.93
CAMP-Esculina / Pág.93
Caldo de Urea / Pág.94
Hidrólisis del Almidón (Agar Almidón) / Pág.94
Hidrólisis del Hipurato / Pág.94
Producción de H2S en el medio de LIOR (Para Campylobacter) /
Pág.95
Documentos de Referencia / Pág. 96
Glosario / Pág.96
Control de Revisiones / Pág. 96
I. OBJETIVO
Describir las técnicas que se utilizan en el análisis de muestras biológicas de origen

animal para el aislamiento de agentes bacterianos.
II. ALCANCE
Aplica a todo el personal que realice en el laboratorio de bacteriología, el análisis de

muestras de origen animal para el aislamiento de agentes bacterianos.
III. POLÍTICAS
Todas las muestras enviadas al laboratorio para analisis bacteriologico deberan

apegarse a lo establecido en este manual.
Todo el personal debe procesar las muestras de acuerdo a las técnicas descritas en
este manual.
IV. CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
La medicina de los animales, su producción, rentabilidad y la inocuidad de los

alimentos que se obtienen de ellos, son consideradas áreas de competencia de la profesión
veterinaria. Las enfermedades infecciosas son una de las causas responsables de grandes
pérdidas económicas en animales. En este sentido, el estudio de la Bacteriología es
relevante para el diagnóstico en veterinaria, porque se centra en estudiar los agentes
causales de enfermedades en las poblaciones humanas y animales, aspectos importantes y
de gran ayuda para la implementación de tratamientos efectivos en estas poblaciones. La
identificación de microorganismos se basa en la observación de las características
microscópicas y de desarrollo que presentan en diferentes medios de cultivo. Para esto
último se aplican técnicas de siembra o de inoculación específicas para cada
microorganismo y de acuerdo a la presentación del medio. La formación de colonias
visibles con características particulares permite diferenciar a los microorganismos, así
como detectar contaminantes en los cultivos puros. Las colonias provenientes de un mismo
microorganismo deben ser iguales en forma, tamaño y color; al observarse en el
microscopio deben presentar las mismas características morfológicas y tintoriales.
CONCEPTOS GENERALES
El diagnóstico microbiológico es el conjunto de procedimientos y técnicas

complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una
enfermedad infecciosa. El material utilizado en el laboratorio de Bacteriología para
contribuir al diagnóstico microbiológico es el que se señala en la Fig. 1.
Asas de platino, hisopos y palillos Medios de Cultivo
Microscopio Portaobjetos y Cubreobjetos
Mechero de Bunsen o Campana de Flujo laminar
Fig. 1. Material utilizado en el laboratorio de Bacteriología
El diagnóstico bacteriológico en la actualidad cuenta con 3 aspectos básicos para su

realización: Demostración, Aislamiento e Identificación.
a) Demostración: Tiene por objeto la visualización del agente patógeno o su
efecto en el material biológico; tejidos, secreciones, exudados, trasudados, contenido
estomacal, intestinal, etc.
Ventajas
 Se obtienen resultados inmediatos.
 Requerimientos mínimos de equipo, tiempo, técnicas de laboratorio, espacio de
trabajo, material, etc.
 Puede ser el único método de diagnóstico viable, como en el caso de que los
organismos involucrados no puedan ser cultivados in vitro (Mycobacterium leprae) o
poseer características de cultivo especiales (Nutrientes: vitaminas, factores de crecimiento,
etc.)
 Nos puede orientar tentativamente a un diagnóstico y tratamiento rápido.
 En el caso de enfermedades relacionadas con producción de toxinas potentes, la

demostración de estas es de mayor importancia que el aislamiento del microorganismo por
ejemplo: Clostridium perfringens.
 Nos puede dar una idea de la cantidad de gérmenes relacionados en el proceso de
infección, forma, tamaño y disposición.
 Permite la observación de algunas reacciones tisulares y elementos que
intervienen en el proceso de infección (ejemplo: fagocitosis, tipo de leucocitos asociados en
el proceso, fibrina, destrucción o degeneración celular, etc.)
 Nos muestra sus características de tinción.
Desventajas
Se requiere de grandes cantidades de microorganismos para la obtención de
resultados positivos. Se calcula aproximadamente por cada bacteria que se observa al
microscopio con el objetivo de inmersión, existen aproximadamente 10 6 bacterias por
mililitro de fluido o sustancia. En la mayoría de los casos no proporciona respuesta de la
acción de toxinas, anticuerpos, etc. Relacionados con el proceso “in vivo”. Respuestas más
específicas se pueden obtener con el uso de anticuerpos marcados (Fluoresceína, ferritina,
enzimas, etc.).
b) Aislamiento: La etapa de aislamiento consiste en el transporte y cambio de los
microorganismos del medio natural donde se encuentran a un medio artificial
(medio de cultivo y animal de experimentación), para su propagación en cultivo
puro. El aislamiento se lleva a cabo a través de: la esterilización a la flama, el
aislamiento puro de cultivo bacteriano y de la observación de la morfología de las
colonias bacterianas, procesos descritos más adelante en este manual.
Ventajas
 Es la forma más convincente del diagnóstico etiológico de las enfermedades
infecciosas.
 Prerrequisito indispensable para la identificación de los agentes microbianos salvo

algunas excepciones.
 Requisito para una determinación correcta de la sensibilidad a los diferentes
antibióticos y sulfas.
Desventajas
 Requiere de tiempo, equipo, conocimiento y experiencia.
 Puede ser peligroso para el personal de laboratorio.
 En algunas ocasiones se puede llegar al diagnóstico con técnicas menos laboriosas
como el examen clínico, clínico patológico, examinación directa, etc.
c) Identificación
La identificación del agente patógeno tiene como objeto confirmar su identidad por
medio de diferentes sustratos y esto depende de:
 Conocimiento de la especie animal, signos clínicos de la enfermedad y/o tipo de
lesiones patológicas. Examen y tinción de frotis hechos directamente de la muestra.
 El crecimiento y características coloniales de la bacteria patógena sobre los
medios de cultivo, así como las bioquímicas del cultivo puro del patógeno para confirmar
su identidad.
 Condiciones atmosféricas necesitadas para desarrollarse.
Es importante mencionar que la identificación de cualquier agente bacteriano
incluye técnicas de siembra o inoculación para el cultivo de bacterias, elaboración de frotis
fijo, técnicas de tinción y técnicas de aislamiento de microorganismos. Métodos descritos a
continuación:
TÉCNICAS DE SIEMBRA O INOCULACIÓN PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS
La caracterización de microorganismos se basa en la observación de las

características microscópicas y de desarrollo que presentan en diferentes medios de cultivo.
En este sentido, en el laboratorio de Bacteriología del CCBA se aplican técnicas de siembra
o de inoculación específicas para cada microorganismo considerando la presentación del
medio de cultivo. Bajo este contexto, la formación de colonias visibles con características
particulares permite diferenciar a los microorganismos, así como detectar contaminantes en
los cultivos puros. Las colonias provenientes de un mismo microorganismo deben ser
iguales en forma, tamaño y color; al microscopio deben presentar las mismas características
morfológicas y tintoriales. Para poder observar las características de las bacterias, es
necesario realizar técnicas de siembra o inoculación para el cultivo de bacterias de acuerdo
al tipo de muestra que se analizará, este proceso se realiza de la siguiente manera:
1. Esterilización a la flama
La muestra biológica que se desea analizar, es preparada para su inoculación con el
objetivo de recuperar las bacterias. Las técnicas de preparación de la muestra varían según
el tipo de muestra, en el caso de los tejidos, la esterilización a la flama es importante, para
una optima obtención de microorganismos. A partir de una muestra de tejido se realizan
los siguientes pasos:
a) Se calienta a la flama (se mantienen remojados en alcohol una espátula, una tijera
y pinzas) la espátula sin que quede al rojo vivo y se pasa sobre la superficie del tejido
afectado.
b) Con la ayuda de una tijera y pinzas esterilizadas a la flama se corta un cuadrante
del tejido de aproximadamente 1 cm 2, esta se coloca en una bolsa estéril, adicionando 5 mL
de Caldo BHI (Caldo Infusión Cerebro Corazón). Posteriormente la preparación es
macerada y del producto generado se realiza la siembra en estrías para el aislamiento puro
del cultivo. La preparación se mete a incubación junto con la caja de petri sembrada, esto
con el objetivo de realizar la resiembra correspondiente, si se necesita.
c) Si el tejido es muy pequeño, puede no ser cortado, este se pasa de forma directa a
la flama y posteriormente se realiza el mismo proceso descrito en el punto 2.
En muestras tomadas con hisopo, colocadas en recipientes o bolsas (fluidos,
agua, heces, leche, alimento o cualquier otro tipo de muestra) la esterilización a la flama
para análisis bacteriológico, se realiza en un área estéril generada por una campana de flujo
laminar o en un área próxima al mechero de bunsen tal como se muestra en la Fig. 2.
Fig. 2. Esterilización a la flama
NOTA: Para mantener las condiciones de esterilidad, se puede trabajar en la

proximidad del mechero de Bunsen o en su caso con una campana de flujo laminar,
ayudándose con un esterilizador eléctrico.
2. Aislamiento puro de un cultivo bacteriano
El aislamiento bacteriano tiene como principal objetivo la obtención del
microorganismo problema, en un cultivo puro, para su posterior identificación. Cuando las
bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento muy marcado en el número de células en un período muy corto. En algunas
especies se alcanza la población máxima en 24 horas y en otras se necesita un período más
prolongado para alcanzar el máximo desarrollo.
La técnica más común para obtener un cultivo puro es el método llamado sembrado
en estrías. Con este método se obtienen colonias aisladas a partir de una sola célula dando
lugar a una colonia bacteriana.La siembra se realiza en cajas de petri con Agar y
básicamente consiste en el desprendimiento de las bacterias del asa de platino, las cuales
caen espaciadas individualmente sobre el medio de cultivo. El sembrado en estrías puede
realizarse de varias formas dependiendo del número de microorganismos que se espera,
desarrollen. La manera en cómo se realiza es la siguiente:
a. Dividir la caja de petri imaginariamente en cuatro cuadrantes.
b. Inocular en el primer cuadrante con la muestra realizando estrías muy juntas (Fig.
3).
c. Esterilizar el asa y continuar con estrías muy juntas en el segundo cuadrante
partiendo de las primeras estrías (no se vuelve a tomar de la muestra).
d. Continuar de la misma forma esterilizando el asa entre cada cuadrante hasta que la
placa entera se ha sembrado (Fig. 4).
e. Asegurarse de que haya contacto entre las estrías de cada cuadrante.
f. Incubar a 37°C. por 24 horas
Después de incubarlas, estas células individuales, se dividen repetidamente hasta
formar una masa visible sobre el Agar, las cuales se originaron a partir de una sola célula
dando lugar a una colonia bacteriana.
Fig. 3. Técnica de siembra en estría por agotamiento

Fig. 4. Placa sembrada por completo por la Técnica de siembra en estría
3. Morfología de las colonias bacterianas

La utilidad diagnóstica en el estudio de la morfología de las colonias es de gran
importancia porque con ello puede iniciarse una identificación preliminar de los
microorganismos aislados. Las características morfológicas son muy variadas mismas que
son constantes para cada especie de bacteria en idénticas condiciones de cultivo. Estas
características pueden modificarse cuando factores como: humedad relativa, medio de
cultivo y temperatura son diferentes. La descripción de las colonias deben realizarse cuando
estas se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta:
tamaño (pequeñas, grandes), color, borde, opacidad, etc.
a. Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy
diversos los cuales son detectados fácilmente debido al color característico
que imparten a las colonias o por la difusión de dichos pigmentos en el
medio de cultivo (Fig. 5).
b. Borde: Enteras, onduladas, lobuladas erizadas, filamentosas.
c. Opacidad: Translúcidas, opacas, brillantes.
d. Elevación: Umbilicadas, difusas, planas, convexas.
e. Estructura interna: Mucoides, granulares, filamentosas.
f. Superficie: Lisas, rugosas.
Fig. 5. Aspectos más comunes de las diversas colonias aisladas sobre medio sólido
Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias es la producción de

hemolisinas. En el medio de cultivo de Agar sangre, la producción de hemolisinas conduce
a la formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia. En la hemólisis beta
se observa un halo transparente y en la hemólisis alfa un halo verdoso. En el caldo sangre la
producción de hemolisinas es detectada por la coloración rojiza que toma el caldo al
liberarse la hemoglobina de los eritrocitos.
ELABORACIÓN DE FROTIS FIJO
Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un

microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad,
acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro.
Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más
posible a las células vivas.
LA FIJACION es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las
estructuras internas y externas de las células de los microorganismos.
Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular y endurece las estructuras
celulares, de manera que no cambien durante la tinción ni la observación.
Existen dos clases de fijación fundamentales diferentes:
1. Fijar con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una
película de bacterias secadas previamente al aire. Este método conserva
adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la
célula.
2. La fijación química para proteger la subestructura fina y la morfología de
microorganismos delicados de mayor tamaño, en esta clase de fijación se
utilizan fijadores químicos que penetran a las células y reaccionan con
componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos y
convertirlos en insolubles e inmóviles
En el laboratorio de Bacteriología del CCBA se emplea la fijación por calor. Este
método consiste en:
La realización de un frotis fijo, que consiste en depositar sobre una laminilla una capa
delgada de bacterias mismas que quedarán adheridas a la laminilla por medio de calor.
Utilizar el marcador, dibujar dos círculos debajo de la superficie de la laminilla, un
cuadrado o un círculo grande, el frotis deberá quedar adecuadamente identificado Fig. 6.
Fig.6. Elaboración de la marca en las laminillas
 En la marca hecha colocar una pequeña gota de agua destilada, posteriormente A

tomar una pequeña asada del cultivo en medio sólido (Fig.7) y con movimientos giratorios,
hacer una suspensión muy ligera extendiéndola en toda el área del círculo (Fig. 8), dejar
secar el frotis a temperatura ambiente.
Fig. 7. Asada en cultivo sólido

Fig.8. Preparación del frotis
 Fijar los frotis al calor pasándolos rápidamente por la flama del mechero (Fig.9).
Es importante que la laminilla no se caliente demasiado ya que se pueden modificar las
características morfológicas y tintoriales.
Fig. 9. Fijación al calor
TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA EL CULTIVO DE BACTERIAS
1. Tinción de Gram
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple esto es,
utilizando sólo un colorante, o con tinción diferencial utilizando dos colorantes. Los
métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus
propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian
Gram en 1884 es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata

de un método diferencial porque divide a las bacterias en dos clases, Gramnegativas y
Grampositivas de acuerdo a los componentes predominantes de su pared celular, y permite
así mismo la observación microscópica de la morfología, el tamaño y la agrupación.
El proceso de la tinción se debe en algunos casos a reacciones de intercambio
iónico entre compuestos del colorante y otros elementos activos de la superficie o el interior
de la célula. La causa de que unas bacterias se coloreen de púrpura y otras no, parece
deberse a diferencias en estructura química superficial. Las paredes celulares tanto de
bacterias Grampositivas y de Gramnegativas poseen una capa basal de peptidoglicano
responsable de la rigidez característica de la pared, el peptidoglicano no se tiñe por sí
mismo; más bien, parece que actúa como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida
del cristal violeta. Las bacterias Grampositivas están constituidas propiamente por ácidos
teicoicos que son importantes por su especialidad antigénica. En la tinción de Gram se tiñen
de color violeta. En las bacterias Gramnegativas existe una membrana externa cuya
constitución química es de fosfolípidos y proteínas pero que poseen un alto contenido de
lipopolisacáridos, se tiñen de color rosado. La técnica de la tinción de Gram se realiza de la
siguiente manera (Fig.10):
a. Cubrir el frotis con la solución de Cristal Violeta (colorante primario), una o
dos gotas son suficientes para cubrir el área del frotis. Dejar actuar por un
minuto.
b. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente de la llave.
c. Posteriormente, colocar la solución de Lugol (mordente) y dejar actuar
durante un minuto, lavar con agua corriente de la llave.
d. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente de la llave.
e. Aplicar el alcohol acetona (agente decolorante) durante 3 a 5 segundos y
lavar nuevamente con agua corriente.
f. Finalmente colocar el colorante de Safranina (colorante de contraste) y dejar

actuar durante un minuto.
g. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente de la llave.
Secar el frotis a temperatura ambiente y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión (100X). Grampositivas: Se tiñen de color violeta (Fig. 11). Gramnegativas: Se
tiñen de color rosado (Fig. 12).
Cristal Violeta Agua Lugol Agua
Alcohol – Cetona
Interpretación Agua Safranina Agua
Figura 10. Elaboración de la Tinción de Gram
Fig. 11. Bacterias Grampositivas Fig. 12. Bacterias Gramnegativas.

2. Tinción de Esporas
Diversas bacterias Grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva, de
resistencia, denominada endospora (espora). Las endosporas se desarrollan dentro de
células bacterianas vegetativas de varios géneros: Bacillus y Clostridium (bacilos),
Sporosarcina (cocos), entre otros.
Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como liberadas de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización
dentro de la célula pueden estar situadas centralmente, cerca de un extremo (subterminal) o
claramente terminales, presentan además variación en su tamaño. Estas estructuras son
extraordinariamente resistentes a situaciones ambientales estresantes, como calor, radiación
ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación. Estas características son de utilidad
taxonómica para la identificación de algunas especies de los géneros, capaces de esporular.
Las endosporas se pueden examinar con los microscopios óptico y electrónico.
Como las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, a menudo se han
observado como áreas incoloras en bacterias tratadas con azul de metileno y otros
colorantes; se han utilizado tinciones especiales para esporas con el fin de poder verlas
mejor. En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como
cuerpos refringentes sin teñir, para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton, en la
que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del verde de malaquita (colorante
primario) y una vez que este ha penetrado, al lavar la preparación y agregar safranina
(colorante de contraste), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece
teñida de color verde.
La técnica de la tinción de esporas se realiza de la siguiente manera:
a. Preparar un frotis a partir del cultivo que se desea analizar y fijarlo a la
flama.
b. Cubrir el frotis con verde malaquita (colorante primario), déjelo que

reaccione por un minuto y luego caliente la preparación hasta que el
colorante empiece a vaporizarse, continúe haciéndolo por un minuto.
c. Lavar el frotis con agua de la llave durante medio minuto.
d. Cubrir el frotis con solución de safranina (colorante de contraste) y dejar
reaccionar por medio minuto.
e. Lavar con agua de la llave y secar al aire.
f. Examinar la preparación con el objetivo de inmersión (100X).
Interpretación
Espora: Se tiñe de color verde (Fig.13).
Célula vegetativa (resto de la célula): Se tiñe de color rosado.
Espora
Espora
libre
Fig. 13. Bacterias con esporas
3. Tinción de Cápsula
La estructura más externa de algunas células bacterianas es la cápsula, que es una
substancia gelatinosa no bien definida, que forma una capa que envuelve a la célula, la cual
es sintetizada por la membrana citoplasmática y excretada al exterior a través de los poros
de la pared celular. La cápsula tiene compuestos como los polisacáridos, pero se encuentran
también otras muchas clases de substancias características de cada una de ellas de las
especies determinadas. La presencia de la cápsula aumenta la capacidad de virulencia en

algunas bacterias, y la pérdida de la misma puede derivarse en poca virulencia. Las
cápsulas bacterianas no pueden observarse en los frotis teñidos por las técnicas usuales, ya
que estas son incapaces de retener el colorante, y no todas las especies de bacterias
producen cápsulas fácilmente observables (Fig.14).
El mejor método para observarlas es el de utilizar una tinción negativa, en este
método puede utilizarse tinta china. En este caso no son los organismos los que se tiñen,
sino la superficie de vidrio sobre la que estos se encuentran. Así se puede observar
claramente la forma o contorno del organismo contra el fondo obscuro. La cápsula se
observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos gracias al contraste
proporcionado por la coloración negra tanto del espacio intercelular como de las células
microbianas. La técnica de la tinción de cápsula se realiza de la siguiente manera:
a. Utilizando el asa de platino tomar una colonia del cultivo que se quiere
analizar.
b. Suspender homogéneamente en una gota de solución salina sobre el
portaobjeto.
c. A esta suspensión diluida, agregue tinta china, y luego mézclela con la
suspensión de bacterias. Con cuidado coloque el cubreobjetos sobre la
preparación y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
Interpretación
Las partículas de tinta china se verán dotadas de movimiento Browniano muy
rápido, las bacterias de formas pálidas y las cápsulas como un halo alrededor del
organismo.
Cápsula
Fig. 14. Cápsula Bacteriana
TÉCINAS PARA EL AISLAMIENTO DE BACTERIAS
1. Bacteriológico de Vísceras o General

El aislamiento de bacterias a partir de muestras de origen animal se realiza, en la
mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El
crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de
una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones
ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por
individuos iguales (un clon bacteriano). Bajo este contexto en el laboratorio de
Bacteriología del CCBA, la prueba de Bacteriológico de Vísceras o también conocido
como Bacteriológico General se realiza de la siguiente manera:
a. Los medios de cultivo utilizados para este tipo de prueba son el Agar Sangre y el
Agar Mac Conkey.
b. Es importante considerar que si la muestra es tejido esta se prepara tal como se
describe en el apartado de Esterilización a la Flama de la sección de Técnicas de
Siembra e Inoculación para el Cultivo de Bacterias.
c. Si la muestra no fuera tejido (fluidos, agua, heces, leche, alimento o cualquier otro
tipo de muestra), se siembra de forma directa en los medios de cultivo
correspondientes. Posteriormente se sumerge en 5 mL de Caldo BHI, esta
preparación se mete a incubación junto con la caja de petri sembrada, esto con el
objetivo de realizar la resiembra correspondiente, si se necesita.
d. Una vez que se ha colocado la suspensión de bacterias en la placa de Agar Sangre y
de Agar Mac Conkey, se deja secar por 5 minutos antes de comenzar la incubación.
e. La placa es incubada a 37°C por 24horas, es importante tomar en cuenta que al

colocar la placa en la incubadora este deber ser de forma invertida, ya que así se
evita que quede una cantidad moderada de humedad. Si la placa no es invertida
durante la incubación, la bacteria no podrá colonizar el Agar apropiadamente, lo que
evitará que crezca y forme colonias adecuadamente, o estimulará el crecimiento de
otros microorganismos. La condensación o humedad puede causar vetas, lo que hará
que elegir y analizar colonias separadas sea mucho más difícil. Una vez que la
bacteria ha formado colonias, la placa también debe ser almacenada hacia abajo
para mantener los niveles de humedad.
f. A las 24 horas, se deberá realizar la lectura de las placas.
g. Si no se observa crecimiento bacteriano, el analista puede realizar una resiembra de
la preparación y repetir la incubación 24 horas Si después de este tiempo no se
observa crecimiento bacteriano la muestra se reporta con ausencia del mismo.
h. Si se observa crecimiento bacteriano, se realizará el frotis fijo, la tinción
correspondiente, la identificación bacteriana a través de las pruebas bioquímicas, así
como la prueba de antibiograma si esta es requerida.
i. Se reportan los resultados.
2. Bacteriológico de agua (Coliformes Totales y Fecales, Conteo de
Mesófilos y Determinación de Salmonella)

De todos los tipos de contaminación ambiental, puede destacarse la contaminación
del agua. Muchas veces el agua puede ser completamente transparente, incolora e inodora,
pero estar aun contaminada, por lo que, es importante determinar su calidad sanitaria. La
potabilidad del agua sólo se puede determinar mediante análisis químicos y bacteriológicos.
El agua es un importante vehículo en la transmisión de enfermedades infecciosas de tipo
entérico en comunidades humanas y animales. Es excelente para la transportación de
organismos patógenos especialmente los que existen en las aguas negras cuando estas no
han sido bien tratadas. La flora bacteriana que pudiera considerarse autóctona del agua, no
está bien conocida, y esto es debido, en parte a que muchos de los miembros de él, crecen
difícilmente en los medios artificiales del laboratorio. Existe una flora bacteriana del agua
como son: Chlamydiobacteriales (bacterias del azufre, hierro y otras), Espirilos, Bacilos
pigmentados como Serratia marcescens y Chromobacter violaceum, cocos pigmentados
como Sarcina lútea, bacterias fijadoras de nitrógeno como Azotobacter. Los
microorganismos llamados alóctonos existentes en el agua pueden proceder de la propia
agua, del aire y de la tierra (aerógenos esporulados y no esporulados), de las heces los
cuales pueden ser: colibacilos, Streptococcus como saprófitos aerobios, Clostridium.
welchii como saprófito anaerobio y como patógenos los bacilos tíficos, paratíficos, colérico
y disentérico. Los microorganismos propios del agua tienen una temperatura de crecimiento
de 22 grados C, mientras que los procedentes del intestino del hombre y de los animales
crecen mejor a temperatura de 37-44 grados C. Esta flora microbiana puede ser aumentada
o disminuida por los siguientes factores: químicos, físicos y otros agentes vivos como
parásitos (protozoarios) bacteriófagos.
Las enfermedades bacterianas que más se transmiten por el agua son disentería,
cólera, fiebre tifoidea y gastroenteritis como estas afecciones son intestinales, sus agentes
causales se encuentran en el contenido intestinal: por lo tanto, la contaminación de las
aguas con materias fecales significa que aquellas pueden contener estos gérmenes
patógenos y ser en potencia peligrosas para el consumo humano. La fiebre tifoidea y las
distintas disenterías bacterianas abundan en las aguas negras. Los estragos causados por la
proliferación de estos gérmenes hicieron que se tomaran medidas como la cloración de los
abastos de agua. Teóricamente, lo mejor sería examinar las aguas en busca de gérmenes
patógenos, a fin de determinar su potabilidad desde el punto de vista bacteriológico. Sin
embargo esto tropieza con serias dificultades, a causa del corto tiempo que viven los
microorganismos patógenos en las aguas y al número relativamente pequeño de ellos, por
lo cual generalmente no se les detecta en las aguas destinadas a consumo público.
De todos los microorganismos de la flora intestinal, el grupo de Escherichia coli o

coliformes es el que se considera como la mejor indicación de contaminación de las
aguas por materias fecales, razón por la cual los métodos oficiales para determinar
gbacteriológicamente tal contaminación se basan en la detección de este grupo en el
agua de que se trate.
El grupo de bacterias coliformes está formado por Escherichia coli y Enterobacter,
microorganismos cuyas características morfológicas son: Bacilos cortos aerobios o
anaerobios facultativos, Gramnegativos, no esporógenos y que fermentan la lactosa con
formación de gas dentro de las 48 horas a 37° C.
Para determinar coliformes totales y fecales se realiza una prueba presuntiva y una
prueba confirmativa. El análisis de laboratorio para el control de la potabilidad del agua
desde el punto de vista bacteriológico incluye 3 pruebas: La estimación del NMP de
organismos coliformes, el recuento de bacterias mesofílicas aerobias (conteo de
mesófilos) y la valoración del cloro residual (para aguas tratadas) de las cuales, en este
manual únicamente se describen las primeras dos y de forma adicional la técnica de
determinación de salmonella en muestras de agua.
a) Estimación del NMP (Número Más Probable) de organismos coliformes

La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública, ya que
ésta puede servir como vehículo de microorganismos patógenos, es decir, productores de
enfermedades llamadas comúnmente "de origen hídrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea
y Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de
origen entérico.
Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua,
proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas especies de
bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares,
denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus faecalis) y
Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de hombres y

animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales. Así pues, la presencia de
cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de contaminación fecal y el camino
está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las materias fecales.
La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como
Salmonella spp. y Shigella spp. puede ser difícil de realizar, ya que el número de estas
bacterias es relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas bacteriológicas
del agua potable que demuestren la presencia de microorganismos indicadores que siempre
estén presentes en materia fecal y que sirva de guía para conocer el grado de contaminación
fecal. Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal", el cual será utilizado
para la valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo anterior,
se ha adoptado con carácter general, el "Grupo Coliforme" como indicador más digno de
confianza.
La OMS incluye dentro del grupo coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios
facultativos Gramnegativos, no esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la
lactosa, a 35 – 37 °C. Las especies clásicas de este grupo son Escherichia coli y
Enterobacter aerogenes.
El microorganismo indicador más comúnmente utilizado es Escherichia coli. La
OMS considera la expresión "Coliforme fecal" que comprende un número ligeramente
mayor de variedades, todas ellas de claro origen fecal e indicadores de contaminación fecal
reciente. Para los efectos del análisis sanitario del agua, se define el Coliforme fecal como
un bacilo aerobio o anaerobio facultativo, Gramnegativo, no esporulado, que fermenta la
lactosa con producción de ácido y gas a 44 °C (±0.5 °C) en menos de 24 horas.
El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra sin diluir que pueden
ser volúmenes de 50, 10 y 1 ml, ó de 10, 1 y 0.1 ml, o diluida en caso necesario, en una
serie de tubos por triplicado o quintuplicado con un medio que contiene lactosa (caldo
lactosado o caldo lauril triptosa).
La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del
NMP supone la utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua
y las cantidades de tubos sembrados en una ó más series. Realmente consiste en tratar
estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada que resulten positivos después
de su incubación.
En cuanto a la investigación de patógenos en agua, no existe un método único que
permita aislar e identificar todos estos microorganismos. En general, los métodos con los
que se obtienen mejores resultados comprenden una fase de concentración, seguida de
técnicas de enriquecimiento y aislamiento específicas para cada microorganismo.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse lo más pronto posible
después de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el
análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en
ningún caso, este lapso debe exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros
tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis.
Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la
muestra a 4 °C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados
falsos o dudosos.
Fundamento: Determinar la presencia de bacterias coliformes en una muestra de
agua.
Procedimiento:
La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa.
Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica
necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales,
Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presunción, que habrá de
confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite
dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada
prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de
bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica.
Prueba presuntiva: Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones

de asepsia.
a. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo Lactosado, una de doble
concentración y las otras dos de concentración sencilla.
b. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 ml.
c. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen
que se va a inocular, a efecto de homogeneizar.
d. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra
deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación.
e. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos con
caldo de doble concentración, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra en la
segunda serie de tubos con concentración sencilla. (Fig. 16)
f. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con 0.1
mL de muestra. Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga
elevada carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos. En
caso contrario, será necesario inocular otras series y por lo tanto, realizar diluciones
de la muestra original.
g. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48 horas.
h. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si
hay tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un
indicador de pH, turbidez y producción de gas en la campana Durham. Al hacer esta
verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la
fermentación de la lactosa en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo
y no confundir con burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es
recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculación y

desechar aquellos que contengan burbujas de aire ó de alguna manera eliminar éstas
y así poder utilizarlos.
i. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las
pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
j. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los
tubos, continuarán en incubación 24 horas más.
k. Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
l. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se
toman como negativos.
Fig. 16. Prueba Presuntiva en la determinación de NMP de CT y CF en agua potable,

inoculando por quintuplicado volúmenes de 10, 1 y 0.1 ml en tubos de fermentación
con caldo lactosado
Interpretación:
 Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando
la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
 Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para
Coliformes Totales y Fecales.
Prueba confirmatoria para coliformes totales:

a. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas
tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB) (Fig. 17).
b. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
c. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
Interpretación:
Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del
NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe
turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo
del NMP.
Fig. 17. Prueba Confirmatoria para Coliformes Totales
Prueba confirmatoria para coliformes fecales:

a. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli). (Fig. 18)
b. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de turbidez y gas.
(Fig. 19)
Fig. 18. Prueba Confirmativa para Coliformes Fecales

Fig. 19. Evaluación de las Pruebas Presuntiva y Confirmativas en la

determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales
Interpretación:
 Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del
NMP.
 Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se
reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
Cálculo y presentación de resultados:

De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes
Totales y Fecales: Establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en la
tabla estadística correspondiente (Tablas 1 y 2), el NMP de Coliformes Totales y Fecales en
100 mL de agua. En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada,
emplear para los cálculos la siguiente ecuación:
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:

a. Si únicamente se inoculan tres series de cinco tubos cada una con 10, 1 y 0.1
ml de muestra, la lectura de los resultados nos permite tener dos códigos de
valores uno para coliformes totales y otro para coliformes fecales los cuales
leídos en la tabla del NMP nos dará el valor de bacterias correspondientes en
100 mL de muestra, de manera directa.
b. Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor

cero.
c. A continuación se establece el triplete de valores correspondiente a las tres
series anteriores a la del valor cero que podrá ser leída en la tabla del NMP.
d. Para efectos de expresar el valor obtenido basándose en 100 mL de muestra
habrá de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra
inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete escogido.
e. Se tendrá un triplete de valores para cada tipo de determinación.
En general se tiene:
NMP/C = NMP leído en la tabla_________________
Volumen real de muestra inoculada en cada
tubo de la serie central (ml)
Los resultados obtenidos se expresarán de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL
NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL
Ejemplos:
1) La lectura de los resultados obtenidos en el análisis del agua de un grifo es la
Siguiente:
Con estos datos consultando la tabla del NMP correspondiente tenemos:

 Para coliformes totales los resultados obtenidos finalmente en la prueba
confirmativa son: 4,2,1 que en la tabla nos indica un valor de 26 es decir el
resultado será:
NMP DE COLIFORMES TOTALES: 26/100 mL
 Para coliformes fecales el triplete de valores obtenido es: 2,1,0 y consultando la
tabla del NMP se tiene el valor de 7. El resultado se expresará:
NMP DE COLIFORMES FECALES: 7/100 mL
2) La lectura de los resultados obtenidos en el análisis de un agua de la que fue
necesario hacer diluciones, es la siguiente:
 Para coliformes totales se establece el código del triplete: 3,1,1 y consultando la

tabla del NMP se observa un valor de 14, por lo tanto se tiene:
14 / 0.01 = 14 x 100 = 1400
El resultado se expresará:
 Para coliformes fecales con el mismo razonamiento se establece el código: 2,1,0 que
en las tablas del NMP correspondientes se observa un valor de 7, por lo tanto se
tiene:
7 / 0.01 = 7 x 100 = 700
El resultado se expresará: NMP DE COLIFORMES FECALES: 700/100 mL
Confiabilidad
El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por su
facilidad y economía. El resultado de esta prueba se expresa por “el número más probable”
(NMP), pero debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probable
densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada. La
confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza al
95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 mL, no obstante, es una indicación
importante para evaluar
Tabla 1. Índice del NMP la ycalidad
límite sanitaria
confiabledel
deagua
95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con
porciones de 1 cm3 y 5 con porciones de 0.1 cm3
Tabla 2. Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 cm3, 3 con porciones de 1 cm3
y 3 con porciones de 0.1 cm3
b) Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA) en agua.

Se les designa como bacterias mesofílicas aerobias, a aquellos microorganismos de
carácter aerobio que son capaces de proliferar entre 20 y 37°C.
Es un grupo muy heterogéneo y sólo comparten entre sus miembros la capacidad de
desarrollar colonias visibles en las condiciones en las que se desarrolla la prueba.
Al grupo de bacterias mesofílicas aerobias pertenece una gran variedad de
microorganismos.
La falta de homogeneidad resultante de las escasas limitaciones que la definición
del grupo impone para incluirlos son el carácter de aerobio y la capacidad de proliferar
entre 20 y 37°C.
Dependiendo del producto pueden reconocerse entre la flora mesofílica aerobia,
bacilos, cocos, formas intermedias, Gram. Positivas, Gram. Negativas o agrupadas en todas
las formas comunes.
Desde el punto de vista fisiológico podemos encontrar una amplia gama de especies
y de otros grupos cromógenos, proteolíticos, fermentativos, lipolíticos, psicotrópicos,
termodúricos, patógenos, saprofitos, etc.
Este grupo de microorganismos se utiliza como un indicador de la posible presencia
de gérmenes patógenos, así como de las condiciones higiénicas en que ha sido manejada el
agua y para conocer la calidad del agua.
Los recuentos de Mesófilos Aeróbicos en placa son útiles para determinar la
potabilidad de un agua, así como también la eficiencia de las operaciones para eliminar
microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración.
Las cuentas se deben hacer antes y después del tratamiento específico. Los
resultados indicarán la medida en que ha sido reducida la población microbiana.
Lo usual es que el agua de buena calidad, para consumo humano, tenga cuentas
bajas: < 100 UFC por mililitro.
La determinación del conteo de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de agua
se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen determinado de agua,
por incubación a una temperatura concreta y en un tiempo determinado, y por recuento
posterior de las colonias desarrolladas y con la aceptación implícita de que cada colonia es
originada por una bacteria de la muestra inicial, por lo tanto, el número de colonias
equivaldrá al número de bacterias en el volumen sembrado.
Fundamento: La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o
UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra.
Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección
después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un
microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo
o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC.
Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para
realizar este procedimiento se describe en la NOM-110-SSA1-1994, “Preparación y

Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”, y en la NOM-092-
SSA1-1994 “Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa”.
Procedimiento: En condiciones asépticas:

a. Agitar vigorosamente la muestra de agua, para homogeneizar.
b. Pipetear 1 mL de muestra y verterlo en el primer tubo con 9 mL del diluyente
(Solución Reguladora de Fosfatos o Agua Peptonada), quedando entonces una
dilución de 101 (Fig. 15).
c. Agitar para homogeneizar y tomar 1 mL de esta dilución (101) y verterlo en el
segundo tubo, quedando una dilución de 102.
d. Agitar para homogeneizar y tomar 1 mL de esta dilución (102) y verterlo en el
tercer tubo, quedando una dilución de 103.
e. Utilizando pipeta estéril, tomar 1 mL de la dilución 101 y verterlo en la caja Petri
estéril marcada con 101, distribuyéndolo bien en el fondo de la caja Petri vacía
(Fig. 15). Efectuar esta misma operación por triplicado.
f. De la misma manera, tomar 1 mL de la dilución 102 y verterlo en la caja Petri
marcada con 102. Efectuar esta misma operación por triplicado.
g. Hacer lo mismo con el tubo de la dilución 10 3 y la caja marcada con 103.
Efectuar la misma operación por triplicado. Es recomendable usar una pipeta
estéril para cada dilución
h. Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja Petri el medio de cultivo
contenido en un tubo, a una temperatura máxima de 47 °C (todavía líquido).
NOTA 1: Si la temperatura del agar es superior a 47°C al vaciarlo a las cajas,

puede producirse la destrucción total ó parcial de las bacterias sembradas.
a. Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja mediante

movimientos de translación y rotación en una superficie plana aproximadamente
durante 1 minuto evitando que se mojen la tapa y los costados de la caja, de esta
manera el agua y el agar son mezclados íntimamente.
b. Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que solidifique el agar.
c. Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posición invertida con
objeto de que el agua de condensación del agar no caiga sobre la superficie del
cultivo. Las condiciones de incubación son: 37 °C (±1 °C) durante 24 horas (± 3
h). Ahora bien, si se desea conocer la flora bacteriana total de la muestra las
condiciones serán: 22 °C (±2 °C), durante 72 horas (±4h).
d. Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han desarrollado
en cada una de las placas, usando un contador de colonias para efecto de facilitar
la lectura.
NOTA 2: Si la investigación de mesófilos se practica a otro tipo de muestra de

agua que no sea potable, se procede a realizar los grados de dilución necesarios,
dependiendo del origen de la misma, pero solo se trabajará con las últimas tres
diluciones, procediendo de la misma forma descrita anteriormente pero
incubando durante 48 horas a 37 °C (±1 °C).
Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:

 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a
250 colonias, usando el contador de colonias. Las placas de al menos una de tres
diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en
el intervalo apropiado, véase la Tabla 3, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio
por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.
NOTA 3: Si son varias las que entran en este intervalo, contar todas y seleccionar
las del grado de dilución por triplicado que represente menor margen de error en
el recuento y como resultado, tomar el promedio de las tres cajas y referirlo al

volumen real de muestra sembrado para efectos del cálculo correspondiente.
NOTA 4: Si no hay ninguna caja con un recuento dentro del intervalo

mencionado, se hará de aquella que tenga el valor más próximo a cualquiera de
los dos extremos. En estos casos los resultados se tomarán como aproximados,
excepto en los casos de siembra de muestra directa donde se efectuará también el
recuento en cajas con menos de 25 colonias.
NOTA 5: Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la

incubadora, se pueden conservar las cajas dentro del refrigerador entre 5 y 10 °C,
durante un período máximo de 24 horas.
 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta

promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones
para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase la Tabla 1, ejemplo 2.
 Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde
las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes guías:
1. Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor
dilución muestran menos de 25 colonias, se debe contar el número de
colonias presentes en dicha dilución, promediar el número de colonias y
multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de
cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda
"valor estimado", véase la Tabla 3, ejemplo 3.
2. Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa
exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que
sean representativas de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una

cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido
por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros,
considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene
65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase la Tabla 3, ejemplo
4.
3. Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las
siguientes formas:
a) Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen
ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias.
b) Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de
la caja.
c) Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre
la superficie del agar.
d) Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones
acompañadas de inhibición del crecimiento, que en conjunto
exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí
mismo excede el 25% de la superficie de la caja.
e) Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias
extendidas que no están incluidas en d), contar cualquiera de los
tipos a), b) y c), como provenientes de una sola fuente. En el caso
de las colonias del tipo a), si la caja contiene una sola cadena,
contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas
que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena
como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena
individualmente. Las colonias del tipo b) y c) generalmente se
observan como crecimiento diferenciable de otras colonias y se

cuentan como tales. Los crecimientos tipo d), reportarlos como
crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre
dentro del rango y otra dilución presente colonias de crecimiento
extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las
colonias, véase la Tabla 3, ejemplo 5.
4. Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran
colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más
baja usada, véase la Tabla 3, ejemplo 6.
5. Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado
y otra con más de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su
duplicado más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del
intervalo para determinar la cuenta en placa, véase la Tabla 3, ejemplo 7.
6. Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de
25 a 250 colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de
colonias especificadas en el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas
para calcular la cuenta en placa, véase la Tabla 3, ejemplo 8.
7. Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo
de 25 a 250 y sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas
incluyendo aquélla con menos de 25 o más de 250 colonias, para calcular la cuenta en
placa, véase la Tabla 3, ejemplo 9.
NOTA 6: Para realizar el recuento de colonias se utiliza un contador de colonias.

El área de una caja Petri de 15 x 100 mm es aproximadamente 56 cm 2, Cuando en un
cuadro de 1cm2 haya menos de 10 colonias, contar 12 cuadros (cada cuadro es de 1 cm 2)
y calcular el promedio de colonias. Cuando haya más de 10 colonias sólo cuente 4
cuadros y calcule el promedio por cm2. Multiplicar el número promedio/cm2 por 56 para
determinar las colonias por caja; multiplique este número por el recíproco de la dilución
para determinar las UFC/g estimadas.
8. Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por

la inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la
muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos
significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al número
inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo:
128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con
cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):
El informe de la prueba se expresarán de la siguiente manera:

 Reportar como: Unidades formadoras de colonias___ UFC/g o mL, de bacterias
aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar
incubadas ______ horas a ______°C.
NOTA 7: Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el
resultado no será de 0 (cero) UFC/mL, sino que será referido al menor grado de dilución
sembrado, es decir de 10-1, por lo tanto el resultado sería: < 10 UFC/mL
Fig. 15. Preparación de Diluciones Decimales y Procedimiento para el Recuento de Bacterias

Mesófilas Aerobias en Agua
Tabla 3. Guía para expresión de resultados
c) Determinación de Salmonella en Muestras de Agua

Los miembros del género Salmonella inicialmente fueron identificados en muestras
clínicas y los métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su
detección en alimentos y aguas. Las modificaciones a los métodos consideraron dos
aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas
presentes en las muestras, debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo diversos
tratamientos) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.
Comúnmente, el agua superficial es contaminada por las descargas residuales domésticas e
industriales. Las aguas residuales pueden contener millones de bacterias, entre las que se
incluyen Salmonella.
Fundamento: Se utiliza un medio de enriquecimiento selectivo con el propósito de
incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la
muestra.
Procedimiento:
a. Después de agitar la muestra inocular 10 mL a igual volumen de medio de
enriquecimiento (caldo Tetrathionate).
b. Incubar a 37°C. por 48 horas y subcultivar a un medio selectivo (XLT-4).
c. Las colonias sospechosas a Salmonella son identificadas por pruebas
bioquímicas.
1. Bacteriológico Alimento (Cuantificación Coliformes Totales,

Cuantificación Mesófilos, Cuantificación Staphylococcus y Determinación de
Salmonella).
a) Cuantificación de Coliformes Totales por el método de vaciado en placa

Los coliformes son representados por cuatro géneros de la familia
Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y Klebsiella. El grupo de los
coliformes es definido en base a una serie de reacciones bioquímicas, se definen como
bacilos Gramnegativos, aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas,
fermentadores de lactosa, formadores de ácido y gas a 48 horas de ser incubados a 35 °C,
aunque se usa una temperatura de 32 °C si se trata de productos lácteos. Algunas especies
pueden crecer a altas temperaturas (44.5 °C) mientras que otras lo pueden hacer a 4-5 °C.
Todos son capaces de desarrollarse en alimentos, excepto en aquellos que tienen valores
inferiores a pH 4. Son sensibles a tratamientos de calor y se destruyen mediante la
pasteurización.
La familia Enterobacteriaceae agrupa microorganismos indicadores de seguridad y
sanidad en los alimentos, como los coliformes. Este grupo es el más ampliamente utilizado
como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Determinar su presencia y
cuantificarlos proporciona información vital para saber si en los alimentos se cumplen las
normas de higiene y sanidad establecidas. La definición taxonómica de las enterobacterias
comprende bacilos rectos, Gramnegativos, anaerobios facultativos, fermentadores de
glucosa a ácido, oxidasa negativos, usualmente catalasa positivos y frecuentemente
reductores de nitrato.
Este definición pretende involucrar bacterias de hábitat típicamente intestinal
(Escherichia coli), si bien existen microorganismos que satisfacen la definición y que
frecuentemente se localizan en ambientes extraintestinales (Enterobacter aerogenes). De
hecho, el grupo no se configura a base de géneros microbianos, sino de cepas que en el
desarrollo de la prueba cumplen con la definición.
Más aún, algunas cepas de Salmonella, por ejemplo, se comportan como coliformes
por el hecho de fermentar la lactosa, en tanto que cepas de E. coli lentas fermentadoras de
la lactosa (patógenas), quedan fuera de la definición.
La E. coli es el típico Coliforme en el sentido de que se trata de una bacteria cuyo

hábitat natural es el contenido intestinal de los animales de sangre caliente. Por tal razón, su
hallazgo en un alimento o en el agua es más significativo desde un punto de vista sanitario,
que el de cualquier otro Coliforme.
En la materia fecal los coliformes alcanzan cifras de 10 6 a 109 UFC/g. Debido a su
capacidad de sobrevivencia y gran potencial para desarrollar en la materia orgánica, pueden
recuperarse de una diversidad de substratos extraintestinales: piel humana y de animales,
vegetales, insectos, aguas superficiales, tierra y cualquier material que entre en contacto
con ellos. La presencia de coliformes en los alimentos resulta de su exposición al medio
ambiente y a las posibilidades de desarrollo que encuentren en tales substratos. Es evidente
que su hallazgo en un alimento no involucra necesariamente a la materia fecal.
En los alimentos los coliformes adquieren un significado distinto al que reciben en
el agua. Los factores más determinantes de esta diferencia radican en su capacidad para
multiplicarse en los alimentos, en la operación de fuentes no fecales de contaminación y a
la presencia de coliformes residuales en el equipo y utensilios en plantas y servicios de
alimentos.
El recuento de los coliformes puede efectuarse por la técnica del número más
probable (NMP) o por la técnica de vaciado en placa.
Los coliformes fecales se refieren a aquellos coliformes que tienen capacidad para
fermentar la lactosa con producción de gas a temperaturas de 44-45°C. Excepto esto, los
coliformes fecales se identifican del resto de los coliformes en lo que se refiere a su
resistencia al medio ambiente, agentes químicos y factores que favorecen o impiden su
desarrollo.
Fundamento: La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en
la NOM-110-SSA1-1994 “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su
Análisis Microbiológico”, y en la NOM-113-SSA1-1994 “Método para la Cuenta de
Microorganismos Coliformes Totales en Placa”.
Procedimiento:
a. En caso de que la muestra sea líquida (agua, leche, refrescos, etc.), agitar la
muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de
30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Se tomarán 10 mL de la
misma, colocarla en un matraz o recipiente estéril, adicionar 90 mL del
diluyente y mezclar de tal forma que la solución sea homogénea.
NOTA 7: Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable,
fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y
homogeneizar agitando vigorosamente.
b. Si la muestra es sólida o semisólida, pesar asépticamente 10 g,
posteriormente colocarla en una bolsa estéril, adicionar 90 mL del diluyente
(Solución Reguladora de Fosfatos o Agua Peptonada) y homogeneizar de 1 a
2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea. Permitir
que las partículas grandes se sedimenten y transferir la cantidad deseada
tomando de las capas superiores de la suspensión
c. Independientemente del tipo de muestra (sólida, semisólida o líquida), de la
suspensión o solución generada, tomar 1 mL de esta dilución (101) y verterlo
en el segundo tubo, quedando una dilución de 102. Repetir este
procedimiento tantas veces como diluciones decimales se quiera sembrar,
utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución. Se recomienda que
para alimentos se realicen hasta 7 diluciones.
d. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles debidamente identificadas, 1
mL de cada dilución del alimento homogeneizado, utilizando para tal
propósito una pipeta estéril.
e. Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA (Agar Bilis Rojo Violeta) fundido o
de Agar Mac Conkey fundido, mantenidos a 45 ± 1.0°C en baño de agua.
En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 12 a 15 mL del

medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución del
alimento homogeneizado y el momento en que se vierte el medio de cultivo,
no debe exceder de 20 minutos.
f. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de
derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del
reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y
seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que
la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fría.
g. Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.
h. Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter
aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del
medio inoculado. Dejar que solidifique.
i. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2
horas.
j. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con
el contador de colonias.
k. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias
típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un
halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro
o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un
diámetro de 0.5 a 2.0 mm, se consideran como organismos coliformes,
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

La elaboración de los cálculos y la interpretación de los resultados se realizan de la

misma manera que en la prueba de Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA),
descrita previamente en este manual.
Placas que contienen menos de 15 colonias características.
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el
número obtenido seguido de la dilución correspondiente.
Placas con colonias no características.

Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos
de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.

Reportar como: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C
durante 24 ± 2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar
utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En
caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de
coliformes por mL".
a) Cuantificación de Mesófilos por el método de vaciado en placa (BMA) en

alimentos
Fundamento: Uno de los exámenes microbiológicos de rutina y de mayor
importancia es la cuenta bacteriana total, específicamente el recuento de bacterias mesófilas
aerobias (BMA), las cuales se desarrollan a temperatura ambiente (30-37°C). Este recuento
aporta información sobre la flora total existente en una muestra, permitiendo conocer la
calidad sanitaria, evidenciando deficientes métodos de manipulación y advirtiéndonos de
una posible presencia de microorganismos patógenos, dado que éstos suelen ser mesófilos.
La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes

en un gramo o mililitro de muestra. La técnica para realizar este procedimiento se describe
en la NOM-110-SSA1-1994, “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su
Análisis Microbiológico”, y en la NOM-092-SSA1-1994 “Método para la Cuenta de
Bacterias Aerobias en Placa”.
Procedimiento: Es exactamente lo mismo que en la prueba de Coliformes Totales,
lo único que cambia es que el medio de cultivo que se utiliza para el vaciado en placa es el
agar nutritivo o el agar cuenta estándar.
La elaboración de los cálculos y la interpretación de los resultados se realizan de la
misma manera que en la prueba de Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA),
descrita previamente en este manual.

Mesófilos aerobios a 37°C por horas U.F.C. por gramo de alimento.
b) Cuantificación de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es uno de los patógenos transmisibles por alimentos que
tiene su origen principalmente en animales y humanos. Tiene notoria importancia
determinarlo en alimentos, dada su capacidad para producir enterotoxinas, que al ingerirse
causan intoxicación, además la presencia de este microorganismo en alimentos que han
sido procesados revela la existencia de una contaminación posterior al tratamiento.
Los estafilococos pertenecen a la familia Micrococcacae, la cual incluye los géneros
Micrococcus, Staphylococcus y Planococcus. Los Staphylococcus comprenden cocos
Grampositivos, catalasa positivas, agrupados en forma de racimos de uvas. El metabolismo
de carbohidratos puede ser oxidativo o fermentativo. Las colonias de Staphylococcus
aureus producen pigmentaciones de color amarillo oro. Los estafilococos están presentes en
animales y humanos, principalmente en las cavidades nasales y en la piel. La mayoría de
las especies fermentan el manitol y producen coagulasa, termonucleasa y hemolisina. Las

células se destruyen a 66 °C en 12 minutos y a 72 °C en 15 segundos. S. aureus es
anaerobio facultativo, pero crece rápidamente bajo condiciones aeróbicas, las especies son
mesófilas con crecimiento entre el rango de 7 a 48 °C, con bastante rapidez entre 20 y 37
°C. Tienen habilidad para crecer a bajos valores de pH (4.8), altas concentraciones de sal
(halófilos, 12%) y azúcar (sacarófilos, 15 %) y en presencia de NO2. Entre los alimentos
asociados a intoxicaciones por S. aureus están aquellos que han sido procesados con calor y
se han recontaminado (carnes cocinadas, cremas pasteleras y productos enlatados);
alimentos fermentados (salamis y quesos); productos secos y de humedad intermedia, tales
como leche en polvo, pastas y productos de panadería (Backburn y McClure, 2002). S.
aureus es una bacteria exotoxigénica, es decir, que la toxina que provoca la enfermedad se
genera y libera en el alimento como consecuencia del desarrollo del microorganismo. La
intoxicación que resulta de la ingestión de la enterotoxina estafilocóccica involucra al
estómago e intestino delgado. El período e incubación oscila entre 30 min y 6 horas.
Típicamente se presentan náuseas, vómito, dolor abdominal y diarrea, puede ocurrir sólo
uno de ellos.
Fundamento: La cuantificación de Staphylococcus aureus por la técnica de
extensión en superficie, se puede realizar empleando uno de los dos medios selectivos
propuestos (medio Vogel Johnson o medio Baird Parker). La preparación de la muestra se
debe realizar de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994, “Preparación y
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico” y en la NOM-115-
SSA1-1994, “Método para la Determinación de Staphylococcus aureus en alimentos”.
Procedimiento: Se realiza exactamente lo mismo que en la prueba de Coliformes

Totales hasta el paso número 3, posteriormente se realiza lo siguiente:
a. Depositar 0.1 mL de inóculo de cada dilución sobre la superficie de las
placas de agar Baird-Parker, distribuyendo el inóculo con varillas estériles de
vidrio en forma de bastón de hockey, hasta que haya sido absorbido

completamente, es importante mencionar que debe usarse una varilla estéril
para cada dilución.
*NOTA: fijarse en la etiqueta del medio el modo de preparación para ver si
contiene emulsión de yema de huevo y telurito de sodio o potasio, de no ser
así se preparan soluciones de telurito de sodio al 1% y NaCl al 0.85% (ésta
para hacer la emulsión de yema de huevo). Todo se esteriliza a 121 °C por
15 minutos.
b. Para preparar la emulsión de yema de huevo: el huevo se lava con agua y
jabón, se desinfecta frotándolo con una solución de yodo, se extrae la yema
con sumo cuidado y se coloca en una probeta estéril (agregando 5 mL de
NaCl al 0.85% por yema). Por cada 100 mL de base de agar Baird Parker ya
esterilizado, se agregan 5 mL de emulsión y 1 mL de la solución de telurito
de sodio. Homogeneizar suavemente y vaciarlo en las cajas Petri.
c. Invertir las placas e incubarlas a 35 °C durante 24 a 48 horas.
d. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de
Staphylococcus aureus (colonias negras, circulares, brillantes, convexas,
lisas, de diámetro de 1 a 2 mm; pueden mostrar una zona opaca y un halo
claro alrededor de la colonia, algunas veces con un precipitado blanco (sales
cálcicas de los ácidos grasos).
e. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias al reporte se debe agregar la
nota de "valor estimado”.
f. Preparar frotis para realizar tinción Gram y observar la morfología de las
colonias características de S. aureus.
g. Seleccionar las colonias de acuerdo a la Tabla 4 para realizar las pruebas de
coagulasa y termonucleasa:
Tabla 4. Selección de colonias para pruebas de Coagulasa y Termonucleasa

1. Seleccionar el número de colonias (3, 5 o 7) y sembrar cada una en tubos con 0.5
mL de caldo de infusión cerebro-corazón.
2. Incubar a 35 ºC durante 24 horas.
3. Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.
4. Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0,3 mL de cada
cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El
resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.

Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en
cuenta el número de colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el
volumen inoculado (0.1 mL).
Ejemplo 1:
Si la placa de la dilución 1:1000 tiene 80 colonias y 4 de 5 colonias seleccionadas
dieron positivas en las pruebas, el cálculo es:
80 x 4/5 x 10,000 = 640,000
Ejemplo 2:
Si la placa de la dilución 1:100 tiene 14 colonias y 2 de 3 colonias seleccionadas
dieron positivas, el cálculo es:
14 x 2/3 x 100 = 933 = 930

Según ejemplo 1:
 Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g = 6.4 x10 5 UFC por
g o mL
Según ejemplo 2:
 Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado = 930 x
10 5 UFC por g o mL valor estimado.
 Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias
probadas, informar como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100
En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el
método y el grado de confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ±
52%.
c) Determinación de Salmonella
De suma importancia resulta el aislamiento e identificación de Salmonella spp. en
alimentos, dado que es una de las bacterias patógenas mayormente implicadas en la
transmisión de enfermedades por consumo de alimentos y causante de miles de brotes a
nivel mundial de dos enfermedades bien conocidas: salmonelosis y fiebre tifoidea. El éxito
en la determinación de este patógeno comienza con el debido tratamiento de la muestra, el
cual es puntual para ciertos tipos de alimentos. Salmonella es miembro de la familia
Enterobacteriaceae y siempre se considera como patógeno cuando se aísla de productos
alimenticios o de humanos.
Las especies de Salmonella son Gramnegativas en forma de bastoncillo, anaerobias
facultativas, algunas son móviles por medio de flagelos, otras no poseen flagelos. Crecen
óptimamente a 37°C, cataboliza la glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y

gas, oxidasa y catalasa negativas, se desarrollan en citrato como única fuente de carbono,
generalmente producen sulfuro de hidrógeno, lisina descarboxilasa y ornitina, pero no
hidrolizan la urea. Algunas especies de Salmonella pueden crecer a temperaturas elevadas
(54°C), mientras que otras lo hacen en alimentos almacenados entre 2 y 4°C; además
pueden sobrevivir por períodos prolongados en alimentos congelados y a temperatura
ambiente; crecen a pH en el rango de 4.5 a 9.5, pero con valores óptimos de 6.5 a 7.5.
Algunos alimentos que han participado en brotes de salmonelosis y de fiebre
tifoidea son: leche cruda, quesos, carnes (res, cerdo, pollo, borrego, pavo), chocolates,
helados de crema, camarones, verduras crudas, frutas, huevos y alimentos preparados a
base de huevo.
El aislamiento e identificación de Salmonella consta de una serie de 5 etapas:
preenriquecimiento, enriquecimiento, aislamiento, pruebas bioquímicas e
identificación serológica.
En la etapa de preenriquecimiento se busca reconstituir la vitalidad de las células
dañadas de Salmonella, el caldo que se utiliza en esta etapa es un medio no selectivo que
varía con el tipo de alimento, por ejemplo caldo lactosado para productos a base de huevo,
agua destilada estéril para leche en polvo, caldo soya tripticasa para levadura y leche
descremada para chocolate. En la etapa de enriquecimiento se favorece el desarrollo de
Salmonella y se impide el de la flora asociada; para enriquecimiento se emplean el caldo
tetrationato verde brillante y el caldo selenito cistina.
En la etapa de aislamiento se consigue el desarrollo de Salmonella
independientemente de los microorganismos asociados; en las pruebas bioquímicas se
perfila a qué género género pertenece la Salmonella; finalmente con las pruebas serológicas
se confirma mediante aglutinación con antisueros polivalentes la identificación del género.
Los Caldos de Enriquecimiento tienen como fin estimular la multiplicación de las
Salmonellas y reducir o inhibir el crecimiento de los organismos competidores, tales como
Coliformes, especies del género Proteus y Pseudomona cuyo crecimiento superaría al de las
Salmonellas, en particular si estos organismos competidores están presentes en el alimento en
un número mayor que las Salmonellas.
Los medios sólidos a base de agar selectivos contienen por lo general sustancias
inhibidoras, así como un sistema indicador que colorea específicamente determinados tipos de
colonias y da un color peculiar al agar que las rodea permitiendo de este modo el
reconocimiento de las colonias sospechosas de Salmonella.
Fundamento: La preparación de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo
establecido en este manual, el cual toma como referencia la NOM-114-SSA1-1994,
“Método para la Determinación de Salmonella en alimentos”.
Procedimiento:
 Alimentos congelados: colocar el producto en refrigeración durante una noche.
No descongelar por inmersión en agua.
 Alimentos o productos líquidos: inocular directamente la alícuota medida en el
medio correspondiente, previa homogenización. Si se trata de leche se sumerge una torunda
en 1-2 litros de muestra, agitándola durante 2 horas con algún dispositivo mecánico; una
vez escurrida la torunda puede inocularse directamente a los caldos de enriquecimiento.
 Alimentos sólidos: separar la muestra y pesar la cantidad necesaria.
Homogeneizar en Stomacher® con el medio (de enriquecimiento o preenriquecimiento)
durante 1 minuto.
 Alimentos en polvo: pesar la alícuota asépticamente y adicionarla al medio de
enriquecimiento o preenriquecimiento. Agitar vigorosamente antes de incubar.
Preenriquecimiento:
a. Determinar el pH del medio de preenriquecimiento con el potenciómetro. Ajustar, si
es necesario, a pH 6.8 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles.
Mezclar y cerrar ligeramente el recipiente.
b. Pesar asépticamente 25 g de la muestra en una bolsa estéril. Adicionar 225 mL del

medio de preenriquecimiento estéril (seleccionado según la Tabla 5) y
homogeneizar en el Stomacher® durante 1 minuto.
c. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca
ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la
tapa bien enroscada.
d. Incubar 24 ± 2 h a 37ºC.
Tabla 5. Medios de Preenriquecimiento para Salmonellas

Enriquecimiento:
a. Después de la incubación, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla del
preenriquecimiento, a 10 mL de Caldo Tetrathionate con 0.2 mL de solución de Lugol-
Yodo, (esta solución se añade al momento de utilizar el medio) puede utilizarse
también en lugar de Caldo Tetrathionate, Caldo Selenite-Cisteína, homogeneizar e
incubar de 18 a 24 h a 37ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por
el mismo periodo.
b. Después de la incubación, agitar los tubos y pasar 0.1 mL con un hisopo a un tubo con
10 mL de caldo Rappaport. Incubar a 37° C. por 24 horas.
Aislamiento:
a. Después de la incubación, resembrar por el método de aislamiento en cultivo puro en
Agar verde Brillante con Sulfadiazina (BGS) o en Xilosa-Lactosa- Tergitol (XLT-4).
Incubar 24 horas a 37 °C.
b. Observar los cultivos para identificar las colonias sospechosas de Salmonella spp. En
BGS las colonias son rosadas, grandes, lisas y transparentes y en XLT-4 las colonias
son grandes con centro negro y borde amarillo. Tener cuidado al seleccionar las
colonias procediendo de la siguiente manera: tomar del centro de la colonia con un asa
de punta para confirmar. Si se trata solamente de determinar la presencia o ausencia de
Salmonellas, bastan solo dos colonias para llevar a cabo con ellas las pruebas de
identificación.
Pruebas Bioquímicas:
a. Seleccionar al menos dos colonias típicas de Salmonella que se encuentren bien
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con
agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la
superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 37ºC.
Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar más colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar
presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes
reacciones:
b. Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más
intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la
sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la
punción debido a la producción de ácido sulfihídrico
c. Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la
descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan
claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de
Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo
largo de la punción.
d. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones
en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en
estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de
Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que
muestren reacciones atípicas en ambos medios.
e. Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo
presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas
de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas
nuevamente.
f. Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos

recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad
analítica seleccionando colonias procedentes del medio de enriquecimiento.
Identificación Serológica:
a. Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
b. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI o en
agar nutritivo (base).
c. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar
con el asa o empleando aplicadores de madera.
d. Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente
un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. Considerar
cualquier grado de aglutinación como positiva. La prueba positiva resulta cuando se
presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero, y no aglutinación en la
gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en
ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas
bioquímicas complementarias.
e. Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse
el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D
y E, suelen ser los más frecuentes). Si la aglutinación con el antisuero O es negativa,
utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el
cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
NOTA: Si no se cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de

la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia
de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública.
2. Bacteriológico Leche (Diagnóstico Mastitis, Cuantificación

Staphylococcus, Cuantificación Mesófilos, Cuantificación Coliformes).
a) Diagnóstico mastitis
a. Inocular 1 mL de la muestra en 3 mL del medio líquido Infusión-Cerebro-
Corazón. Incubar a 37°C por 24 horas.
b. Resembrar del medio líquido a los medios sólidos Agar Sangre para Gram
positivos y Gram negativos, Agar Azida de Sodio para Gram Positivos y Agar
Mac Conkey para Gram Negativos. Incubar a 37°C /18 a 24 horas.
c. Descripción macroscópica de las colonias. Con cada una de las colonias
diferentes realizar: tinción de Gram., pruebas de la catalasa, oxidasa y la
identificación bioquímica (Tabla 6).
Tabla 6. Identificación bioquímica de bacterias gram positivas y

gramnegativas
Gram Positivos (Cocos)

Prueba bioquímica Staphylococcus Streptococcus
Catalasa (+) (-)
Staphylococcus
Staphylococcus Staphylococcus epidermidis Micrococcus
Prueba bioquímica
aureus
Coagulasa + - -
Manitol + - -
Glucosa + + -
Hemólisis + - -
Streptococcus
Streptococcus Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis
Prueba bioquímica
agalactiae
Hemolisina soluble d - -
CAMP/Esculina +/- -/- d/-
Sorbitol - - D
Manitol - - +
Gram Negativos (bacilos)
Identificación de KLIGER SIM
LIA CITRATO RM VP UREA
bacterias S F H2S G H2S I M
Escherichia coli A A + - + - - + - + - -
Enterob. aerógenes A A + - + - - - + - + -
Enterob. cloacae A A + - - + - - + - + -
Klebsiella spp. A A + - + + - + - - + +
d= Decolora D= Presencia de Dulcitol

AL=Reacción alcalina, A=Acida, RM=Rojo de Metilo, VP=Voges Proskauer
SIM=Sulfuro-Indol-Motilidad,, H2S=Acido Sulfhídrico, LIA = Lisina
Otros microorganismos que pueden crecer en medios como Agar Sangre y Agar
Sangre con Azida de Sodio son Corynebacterias, estas forman colonias muy pequeñas
similares a Streptococcus pero tardan 48 horas en crecer. Una Tinción de Gram nos mostrara
bacilos cortos con uno de sus extremos redondeados, dispuestos en letras chinas o en
empalizada, Grampositivos (Tabla 7).
En Agar Sangre y Mac Conkey pueden crecer colonias de Pseudomona y Bacillus sp.
Las colonias de Pseudomona son grises, alargadas, opacas y hemolíticas. Las colonias de
Bacillus sp. generalmente son grandes, hemolíticas, opacas, rugosas, en frotis con tinción de
Gram se observan bacilos grandes Gram (+) (Tabla 7).
Tabla 7. Identificación bioquímica de bacilos pequeños y grandes
Bacilos (+) pequeños dispuestos en letras chinas

Prueba bioquímica Corynebacterium pyogenes Corynebacterium bovis
Catalasa - +
Hemólisis + -
Ureasa - +
Glucosa + -
Bacilos (+) grandes
Prueba bioquímica Bacillus cereus Bacillus subtilis
Voges Proskauer + +
Manitol - -
b) Cuantificación Staphylococcus
La elaboración de la prueba y la interpretación de los cálculos se realizan de la
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de Staphylococcus en el
bacteriológico de alimento.
c) Cuantificación de mesófilos
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de mesófilos en el bacteriológico
de alimento.
d) Cuantificación de coliformes
misma manera que en la prueba descrita de cuantificación de coliformes en el
bacteriológico de alimento.
3. Urocultivo
Fundamento: El objetivo del Urocultivo es el recuento del número de unidades
formadoras de colonias (UFC) que crecen por mililitro de orina sembrada (Urocultivo
cuantitativo) y la identificación del microorganismo responsable (Urocultivo cualitativo)
(Tabla 8).
Existen dos métodos para el estudio microbiológico de la orina; uno es por el
método del asa calibrada y el otro por el método de conteo en placa o recuento de colonias
por medio de una dilución previa de la orina antes de ser sembrada, la finalidad de ambas
técnicas es reportar el número de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro. El
método que se usa en el laboratorio de bacteriología es el de asa calibrada.
Es importante que el procedimiento utilizado para el cultivo de orina proporcione el
máximo de información en un mínimo de tiempo. La muestra debe ser sembrada máximo 2
horas después de su recolección, si no es así pueden refrigerarse, ya que el recuento bacteriano
permanece estable a 4°C hasta por 24 horas. Las muestras que no son procesadas
inmediatamente o que no se refrigeran pronto deben ser consideradas como no satisfactorias
para el estudio. Para el procesamiento de la muestra utilizar asa calibrada de platino color
negra 0.01 mL (1 colonia = 100 UFC/mL) o asa calibrada de platino color rojo 0.001 mL (1
colonia = 1,000 UFC/mL).
Procedimiento:
a. Agitar la muestra para obtener homogeneidad, puede utilizarse sedimento de orina
centrifugada durante 10 minutos a 2000 rpm, algunos bacteriólogos prefieren utilizar
0.01 mL de orina no centrifugada como inóculo.
b. Centrifugar 10 mL de orina en un tubo estéril tapado.
c. Desechar la orina menos 0.5 mL de la que sobrenadante y resuspender el sedimento.
d. Realizar un montaje húmedo de este sedimento y debe examinarse en la busca de
cilindros, células blancas o rojas y bacterias. Es necesario utilizar una técnica aséptica
porque el sedimento debe emplearse subsecuentemente como inóculo para varios
medios de cultivo.
e. Inocular una placa de Agar Sangre y en un medio general o de baja selectividad (Agar
Mac Conkey y Agar Baird Parker).
f. Esterilizar el asa de platino y enfriarla. Para enfriar el asa se sumerge verticalmente y
se retira asegurándose llevar una gota de orina para luego desecharla, esto se realiza 3
veces y la cuarta se utiliza para sembrar en los medios de cultivo.
g. La inoculación se realiza tomando con el asa calibrada de platino color negra 0.01 mL
la muestra y sembrar primero en línea recta sobre el medio y después realizar estrías
separadas. Incubar las placas en posición invertida 24 horas a 37 °C, si no hay
crecimiento a las 24 horas dejar incubar 24 horas más.
h. Observar las colonias, describirlas y contarlas. Realizar frotis para tinción de Gram.
Interpretación
Para el reporte cuantitativo considerar que con un asa de 0.01 mL, una colonia
equivale a 100, y con el asa de 0.001mL, una colonia equivale a 1000. La cifra resultante se
expresa en:”Unidades Formadoras de Colonias”, o bien UFC/ mL
Debido a que se usa un asa calibrada de 0.01 mL el número de colonias halladas en las
placas deberá multiplicarse por 100 y el informe del cálculo final será el número aproximado
de microorganismos por mL de muestra de orina.
Un recuento de menos de 10,000 UFC/mL hace sospechar una contaminación de la
muestra, especialmente si hay varios tipos distintos de colonias, pues las infecciones urinarias
son casi siempre debidas a un sólo microorganismo.
Un recuento de más de 100,000 UFC/mL es indicativo de infección (el número no se
correlaciona con la gravedad de la misma). Las cifras intermedias entre 1,000 y 10,000
UFC/mL son dudosas, y requieren la repetición del análisis.
Si no se observa crecimiento de colonias se reporta de la siguiente manera: “sin
desarrollo después de incubar 48 horas”.
Tabla 8. Microorganismos presentes en el tracto urinario.
Flora microbiana patógena Flora microbiana no patógeno

Streptococcus beta hemolítico Lactobacillus
Staphylococcus (aureus) coagulasa positivo Difteroides
Candida albicans Bacillus subtilis
Enterobacterias
Staphylococcus coagulasa negativa.
(S.epidermidis)
(S.saprophyticus)
4. Coprocultivo
Fundamento: La familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos
Gramnegativos aerobios y anaerobios facultativos que fermentan la glucosa, son oxidasa
negativa y crecen en medios usuales. Habitan como comensales en el tubo digestivo del
hombre y de otros animales de sangre caliente. En algunos géneros como Salmonella,

Shigella y Yersinia hay especies o bioserotipos patógenos, y otros como Escherichia
(excepto 4 subespecies), Citrobacter, Klebsiella y Proteus forman parte de la biota normal
del tubo digestivo y pueden actuar como oportunistas.
Procedimiento:
a. Se realiza una siembra directa de la muestra fecal en Agar Mac Conkey y en Agar
XLT-4, estos se incuban durante 24 horas a 37°C. De igual forma se inocula la
muestra con un hisopo en caldo de Tetrationato y se incuba durante 48 horas a 37°C.
NOTA: Al caldo tetrationato se le agrega 200µL de Lugol para activarlo.
b. Realizar Bioquímicas de las colonias que crecieron en el agar e incubar durante 24
horas a 37°C. En el caso de la muestra con caldo tetrationato, el hisopo se traspasa a
un tubo de caldo Rappaport, se incuba por 24 horas a 37°C.
c. Realizar la lectura de las bioquímicas según las tablas de identificación. Resembrar
la muestra del caldo de tetrationato en Agar XLT-4 y en Agar Mac Conkey y dejar
incubar durante 24 horas a 37°C.
d. Realizar la observación de las colonias y la tinción de gram, si es necesario se puede
realizar una resiembra de colonias para obtener un cultivo puro.
e. Realizar Bioquímicas de las colonias que crecieron de la resiembra e incubar
durante 24 horas a 37°C.
f. Identificar las bioquímicas según las tablas de identificación.
5. Bacteriológico Semen
Fundamento: El cultivo de semen consiste en analizar el semen en busca de
infecciones causadas por bacterias, hongos, etc. Los bacterias causantes pueden ser:
Escherichia coli, Klebsiella pneumonie, Proteus mirabilis, Pseudomona aeruginosa y
Staphylococcus aureus. La muestra debe ser enviada al laboratorio en un recipiente estéril.
Procedimiento:
a. Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate,
Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
b. Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas. Si no hay crecimiento
incubar 24 horas más.
c. Realizar la identificación de las colonias observadas.
d. Reportar los resultados.
6. Antibiograma
Fundamento: El estudio de la sensibilidad a antimicrobianos de las diferentes
bacterias aisladas en muestras biológicas tiene 2 objetivos fundamentales: guiar al clínico
en la elección del mejor tratamiento individual, y monitorizar la evolución de la resistencia
bacteriana. Se basa en la formación en el gel de agar de un gradiente de concentración de
antibiótico. A partir de un disco impregnado con una determinada cantidad, se le conoce
como el método de Kirby-Bauer. Al crecer las bacterias inoculadas previamente sobre la
superficie de la placa se forman halos de inhibición alrededor de los discos, que define la
zona en la que la concentración de antibiótico es mayor que la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI). Por lo tanto, su diámetro está directamente relacionado con la CMI del
antibiótico, y permite determinar la sensibilidad o resistencia siempre que se respeten una
serie de parámetros: espesor del medio en la placa, su composición, inóculo bacteriano y
tiempo de incubación, principalmente. No puede utilizarse para bacterias de crecimiento
lento (>24 horas), porque desaparece el gradiente de concentraciones.
Procedimiento:
a. Transferir aproximadamente 5 colonias de microorganismos a prueba con el
asa de platino a 5 mL del medio de cultivo Caldo Infusión Cerebro Corazón
(BHI). Puede utilizarse también Solución Salina Fisiológica estéril.
b. Cuando se utiliza BHI incubar 2 a 5 horas a 37°C hasta lograr el desarrollo de
la misma turbidez al estándar 0.5 de densidad óptica de Sulfato de Bario
(estándar de McFarland) y cuando se utiliza SSF se transfieren colonias hasta

alcanzar la turbidez 0.5.
c. Se compara la turbidez del caldo de prueba con la del tubo estándar y se ajusta
si es necesario diluyendo con SSF o caldo BHI, o concentrando prolongando el
tiempo de incubación. Así se logrará el equivalente de aproximadamente 10 8
microorganismos por ml.
d. Posteriormente, se sumerge un hisopo estéril en el tubo con el caldo de cultivo
a prueba, (dentro de los 15 min. después de ajustado el inóculo, en el caso de
usar caldo BHI) se exprime en las paredes y se extiende en forma uniforme
sobre la superficie de la placa de Agar Mueller-Hinton o de Agar sangre según
el caso, tratando de cubrirla completamente. El Agar Mueller-Hinton es el
mejor medio para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que:
1. Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de
sensibilidad.
2. Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetroprim y
tetraciclina.
3. Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias
patógenas.
e. Se deja secar la placa 2 a 5 minutos no más de 15 min. y usando una pinza se
colocan los discos sobre el medio, haciendo presión firme pero suave en cada
disco, a una distancia no menor de 24 mm desde un disco al otro. Debido a que
algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido
una vez que tomo contacto con la superficie del agar. No deben colocarse más
de 6 discos por placa de 100 mm y no más de 12 en placa de 150 mm.
f. Se incuba las placas invertidas a 37°C por 24 horas. Para microorganismos
fastidiosos como Corynebacterium, Pasteurella, Estreptococos, Haemophilus
etc. se usa el Medio Mueller-Hinton con sangre desfibrinada. Para
Actinobacillus pleuropneumoniae se recupera con crecimiento abundante en

una placa de Agar Chocolate con NAD (Polienriquecimiento de Bioxon) y
Extracto de levadura y se continúa como cualquier otro microorganismo en el
medio de Mueller Hinton con extracto de levadura y NAD
(Polienriquecimiento de Bioxon).
g. Después de 24 horas de incubación examinar cada placa y medir las zonas de
inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el
correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá
desarrollo confluente. La lectura de los halos de inhibición se mide por medio
de una regla, anotándose los resultados en milímetros para cada
antimicrobiano
h. El punto final deberá tener en cuenta el área que no muestre desarrollo obvio a
ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que
pueden ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona.
Colonias mayores creciendo dentro de la zona clara deberán ser subcultivadas,
reidentificadas y reensayadas. Proteus spp.
i. Podría presentar “swarming” dentro de las zonas de inhibición con algunos
antimicrobianos. En estos casos el velo de “swarming” debería ser ignorado.
En medios suplementados con sangre, se deberá medir la zona de inhibición
del crecimiento no la zona de inhibición de la hemólisis. Cuando se prueban
discos de trimetroprim/sulfametoxazol pueden arrastrarse sustancias
antagónicas que producen un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la
zona de inhibición, en estos casos no considerar en la lectura un crecimiento
del 20% o menos del desarrollo total.
Interpretación: Las zonas de inhibición son leídas para cada antibiótico y se

comparan con las tablas de lectura de diámetros que traen los mismos.
El procedimiento de disco es esencialmente cualitativo y está proyectado para la

percepción de susceptibilidad, por lo tanto se recomienda utilizar esta prueba como una guía
terapéutica, pero las respuestas al tratamiento reales, dependen no solo de la sensibilidad del
agente o agentes infecciosos, sino también de la fisiología y tipo de mal del paciente, de la
localización de la infección y especialmente de lograr el contacto entre la droga y los
microorganismos infecciosos.
La bacteria se reportará como susceptible, intermedio o resistente a cada uno de los
agentes antimicrobianos utilizados en le prueba.
No se informan las medidas de los halos. Estos resultados se interpretan de la
siguiente manera (Fig. 16):
Sensible.- La infección respondería con un tratamiento a la dosis normal.
Intermedio.- Zona de transición entre cepas sensibles y resistentes. Lo más
recomendable es no utilizar los antimicrobianos que se encuentren dentro de esta categoría.
Resistente.- La bacteria no es inhibida por la concentración sistémica del
antibiótico alcanzada generalmente en el cuerpo
Figura 16. Antibiograma
7. Tinción de Ziehl – Neelsen

Fundamento: La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la

decoloración con ácidos fuertes después de ser coloreadas con solución de fucsina caliente,
permite reunirlas bajo la denominación general de bacterias “ácidoresistentes” o “ácido-
alcohol resistentes”. La ácido-alcohol resistencia es la capacidad de incorporar ciertos
colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y alcohol y está
determinada por la presencia en la pared celular de los ácidos micólicos que son ácidos
grasos de cadenas ramificadas de alto peso molecular (60 a 70 átomos de carbono). Las
micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes, cortos, ligeramente curvos. El género
Mycobacterium, incluido en esta clasificación, comprende especies patógenas para el
hombre, animales y especies saprófitas.
El grado de “ácido-alcohol resistencia” es variable entre las especies de este género
y está relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo utilizarse esta
diferencia para distinguirlos entre sí. Los bacilos “ácido-alcohol resistentes” (BAAR) se
observan de color rojo al ser coloreados con los colorantes para Ziehl Neelsen, mientras
que otros gérmenes y células toman distintos tonos de azul debido al azul de metileno que
se utiliza como colorante de contraste. La coloración de Ziehl Neelsen constituye una
técnica sencilla rápida y económica, de baja sensibilidad, pero es una valiosa herramienta
para detectar los casos de tuberculosis pulmonar.
Procedimiento:
Los pasos son los siguientes:
a. Preparación del extendido: Es conveniente efectuar un examen directo y del
homogeneizado. Para la homogenización se añade un volumen equivalente de
NaOH 4% al material en estudio. Se coloca en la estufa a 37 ºC durante 15 a 30
minutos y se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 20 minutos. Se vuelca el sobrenadante
y se realiza el extendido del centrifugado con ansa. - Secado del extendido: Colocar
el portaobjetos en posición horizontal dentro de la estufa de cultivos o sobre la
corriente de aire caliente de un mechero.
b. Secado del extendido: Colocar el portaobjetos en posición horizontal dentro de la

estufa de cultivos o sobre la corriente de aire caliente de un mechero
c. Fijado del extendido: Mediante calentamiento suave, flameándolo sobre la llama.
Esto se efectúa pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparación
sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de
aproximadamente 80 ºC.
d. Coloración: Colocar un pequeño trozo de papel de filtro un poco más largo que el
tamaño del preparado sobre el portaobjeto. Es importante que el papel de filtro tiene
que estar por encima del extendido.
e. Cubrir el extendido con Fucsina para Ziehl Neelsen (carbolfucsina).
f. Flamear por debajo del portaobjeto hasta el desprendimiento de vapores blancos
(evitar que se produzca la ebullición por exceso de calor).
g. Dejar enfriar 5 minutos y repetir el flameado hasta nuevo desprendimiento de
vapores blancos.
h. Dejar enfriar 5 minutos. Cuando esté frio, mediante el uso de pinzas, quitar y
descartar el papel de filtro.
i. Lavar con agua corriente y cubrir con Decolorante para Ziehl Neelsen. Dejar 2
minutos.
j. Realizar sucesivos lavados hasta que no se desprenda mas colorante
(aproximadamente 2 minutos; pero en el caso de preparados más gruesos, puede
requerirse mayor tiempo).
k. Lavar con agua corriente y cubrir con Azul de Metileno para Ziehl Neelsen. Dejar
30 segundos.
l. Lavar con agua corriente durante 30 segundos y secar el extendido.
m. Cubrir el extendido con una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio
óptico, con aumento 1000X.
n. Observar al microscopio no menos de 100 campos. Los “bacilos ácido-alcohol

resistentes” (BAAR) aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro, mientras que
otros gérmenes o células toman distintas tonalidades de azul.
8. Bacteriológico de Medio Ambiente (Aire)

Fundamento: El número de microorganismos de un área de trabajo es directamente
proporcional a la cantidad y clase de trabajo que se desempeñe en ésta, así como también,
se encuentra fuertemente afectada por las condiciones de higiene que prevalezcan en el
área. Existen diferentes métodos, pero la técnica de exposición de placas es un método
simple y bastante preciso. El número y tipo de microorganismos que se encuentran en el
aire puede ser determinado por la exposición de cajas de Petri por un tiempo definido en
diferentes puntos estratégicos del área de trabajo que se ha considerado de riesgo. Este
método de exposición puede ser utilizado para monitorear bacterias totales u organismos
específicos tales como coliformes entéricas patógenas, Streptococcus, Staphylococcus,
levadura y hongos.
Procedimiento:
a. Quitar la cubierta de la caja de Petri, se coloca un medio de Agar sangre o de Agar
nutritivo.
b. Exponer la caja de Petri en el sitio de trabajo seleccionado por 15, marcar la caja
con la identificación del sitio muestreado.
c. Tapar la caja, incubar el Agar Cuenta Estándar o cualquier otro que haya sido
utilizado (Agar sangre o Agar nutritivo) a 37 °C por 48 horas.
d. A las 24 horas contar las colonias y reportar el número de organismos por 15
minutos de exposición. Este procedimiento se repite a las 48 horas de incubación.
La cual no debe exceder de 15 colonias. Los monitoreos de una carga microbiana
del aire, deberán efectuarse cada mes como máximo en las áreas de trabajo
seleccionadas.
NOTA: La temperatura del aire de los laboratorios de microbiología debe

mantenerse entre 23 y 29°C y los de humedad entre 30 y 50 %. Los valores que están fuera
de estos límites son nocivos para los medios de cultivo y producen errores en las pruebas
serológicas.
9. Aislamiento de Campylobacter spp.

Las especies del género Campylobacter corresponden a bacilos Gramnegativos curvos,
espirilados o en forma de S itálica, que presenta un flagelo único en uno o ambos extremos.
En cultivo de varios días (más de tres) adquieren formas esféricas u ovoides que han
perdido su capacidad para multiplicarse en medios de cultivo inertes y que son consideradas
como formas viables no cultivables.
Los diferentes nombres que han recibido las diferentes especies de Campylobacter han
dificultado la utilización de una nomenclatura universal.
Existen grupos de especies termófilas o termotolerantes que son aquellas capaces de
crecer a 42-43°C pero no a 25°C. El microorganismo se adquiere por vía oral (ingestión de
comidas y bebidas contaminadas) o por contacto con animales infectados.
Esta bacteria no posee fimbrias pero, se ha demostrado que el flagelo y el LPS actúan
como adhesinas que le permiten la adherencia a la célula epitelial y al mucus intestinal paso
inicial para la instalación de la infección.
Campylobacter en alimentos
Las especies C. Jejuni y C. coli están reconocidas como causantes de gastroenteritis en

el hombre. Su estudio en este aspecto comienza en 1972 y actualmente el interés radica en la
identificación y el control de las principales fuentes de infección: carnes de abasto, aves, leche
y agua. Muchas especies del género forman parte de la flora intestinal normal de animales
bovinos, ovinos, cerdos, perros y gatos, aves de corral y de vida libre.
Las aves constituyen el principal reservorio de C. jejuni. Es posible encontrarlas en
heces y en carcasas de aves recién sacrificadas y es probable la contaminación en los huevos.
A pesar de ser portadoras del microorganismo, no muestran signos clínicos de la enfermedad.
El ganado porcino es el principal portador de C. coli, pudiendo tener además C. jejuni como
comensal habitual.
En el ganado vacuno es habitual encontrar C. jejuni y C. coli en sus heces. Durante el
sacrificio y la evisceración, se contaminan las canales, aunque es mucho menor que en el caso
de las aves y los cerdos. La leche puede contaminarse a partir de las heces y ser causa de
gastroenteritis cuando se la consume sin pasteurizar. Se ha descrito mastitis bovina aunque su
frecuencia es baja.
Muestra: Hisopos rectales o evacuación espontánea, pudiendo mantenerse a

temperatura ambiente durante algunas horas, evitando su desecación y alimento como carne
de ave. La refrigeración de las muestras prolonga en algunos días la sobrevida del
microorganismo. Si es necesario utilizar un medio de transporte, debe utilizarse el medio Cary
Blair modificado por la reducción de la concentración de agar en un 0.12%.
Procedimiento a partir de heces

Aislamiento selectivo en placas de Agar Preston
a. Se hace una suspensión de la materia fecal en PBS y con un hisopo se estría sobre la
placa de Agar Preston.
b. Se incuban las placas a 42°C durante 24-48 horas bajo condiciones microaeróbicas.
Aislamiento por el método de filtración en placas de Agar Columbia con sangre

a. Se coloca sobre la placa de Agar Sangre una membrana de papel filtro Millipore de
0.45 micras de poro y 47mm de diámetro.
b. Colocar sobre la membrana 100 microlitros de una suspensión concentrada en
solución fisiológica de heces o directamente de diarrea acuosa, dejar en reposo 30 minutos
para permitir el paso de los Campylobacter por los poros. La muestra también puede colocarse
con pipetas Pasteur estériles, unas diez gotas distribuidas sobre el papel filtro.
c. Retirar la membrana, pueden dejarse las gotas o bien hacer estrías sobre el agar.
d. Incubar las placas 24-48 horas (hasta 5 días), a 42°C en condiciones
microaeróbicas.
Procedimiento para carne de aves

1. Enriquecimiento en medio selectivo.
Se transfieren 25 gr. de alimento a un Erlenmeyer que contiene 100mL de caldo
Bolton, si es carne de pollo se manejan pierna y muslo en una bolsa estéril (Whirl-Pack o
alguna otra) y se añaden 100mL del caldo Bolton se lavan las piezas con el caldo y se pasa a
un matraz Erlenmeyer de 125 mL con tapón de algodón o de rosca suelta para permitir
alcanzar en el interior las condiciones de microaerofilia. Incubar 3 a 4 horas a 37°C
(preenriquecimiento) y luego a 42 °C por 24-48 horas.
2. Se siembra en medios de Agar Preston y Agar Columbia con filtro

siguiendo las indicaciones para heces fecales.
3. Condiciones microaeróbicas
Existen varios métodos para obtener una atmósfera adecuada para el desarrollo de
estos microorganismos.
Sobres generadores de gases especiales para Campylobacter: Son sobres que se
consiguen en el comercio (BBL, OXOID, Bio-Meriux) que aportan una atmósfera aproximada
de 5 a 10% de oxígeno y 5 a 12% de dióxido de carbono.
Jarra con vela: La combustión de la vela aporta una atmósfera aproximada de 17-19%
de oxígeno y de 2-4% de dióxido de carbono. Con este sistema el aislamiento de
Campylobacter se mejora si se incluyen el medio de cultivo el suplemento FBP que aumenta
alrededor de 10 veces la aerotolerancia del microorganismo. Se postula que el rendimiento de
este método es mayor a 42-43°C que a 37°C.
Tinción de Gram: Debido a que estos microorganismos no se tiñen bien con

Safranina, se recomienda el uso de Carbolfucsina al 0.8% como colorante de contraste.
Permite observar Gram negatividad, morfología, agrupación y pureza. Una característica
notable de Campylobacter es su forma helicoidal o curvada.
4. Identificación bioquímica
Al igual que para otros agentes bacterianos, la identificación bioquímica del genero
Campylobacter es muy importante, a continuación se mencionan las pruebas más comunes a
realizar (Tabla 9):
 Prueba de la catalasa: Es una prueba de identificación presuntiva. Las
Campylobacterias termofílicas son catalasa positiva.
 Reacción de la oxidasa: Se transfieren unas colonias a un papel de filtro con el
reactivo oxidasa, la aparición de un color azul intenso dentro de los 10
segundos indica un resultado positivo. Es una prueba de identificación

presuntiva, las Campylobacterias termofílicas son oxidasa positivas.
 Hidrólisis del Hipurato de Sodio: Se resuspende varias colonias en una solución
al 1% de Hipurato. Se incuba por dos horas a 37°C y se le añade 200
microlitros de Sol. de Ninhidrina al 3.5% se incuba por 10 minutos a 37°C y se
observa la reacción. Positiva: Azul / púrpura oscuro. Reacción negativa:
incoloro o gris. La hidrólisis del hipurato es una técnica de importancia que nos
permite diferenciar Campylobacter jejuni del resto de las especies del género.
Hay que tener en cuenta que un mínimo porcentaje es hipuricasa negativa.
 Producción de H2S (Medio de Lior): Inocular con suficientes colonias un medio
de Lior, incubar a 37°C por 24 horas. Observar una coloración oscura que es la
producción de ácido sulfihídrico.
 Sensibilidad a Cefalotina y Ac. Nalidíxico: Se usa como medio de tipificación
de Campylobacter spp. Se debe tener en cuenta que puede haber un porcentaje
de cepas resistentes al ácido nalidíxico
 Hidrólisis del Indoxil-acetato: Se aplican colonias a un disco de indoxil-acetato
y se añade una gota de agua destilada estéril, la aparición de una coloración
azul verdosa dentro de los 5 a 10 minutos indica un resultado positivo.
Tabla 9. Pruebas de Identificación de especies del género Campylobacter
PRUEBA C.fetus C.jejun C. C. C. C. C. C. C. C.

BIOQUÍMIC spp. i jejuni col Lar upsa con hel muco hyoin
A fetus. spp. spp i i liensis sisus veti salis testi
jejuni doylei cus nalis
Catalasa + + V + + d/- - - - +
Reducción de + + - + + + + + + +
NO3
H2S - +/- - - + - + - 0 +
Requerimiento - - - - - - + - + V
de H2
Hidrólisis de - + V - - - - - - -
-Hipurato
-Indoxilacetato - + + + - + - + - -
Crecimiento a: + - - - - - - - - +
25 grados C
30 grados C + - - - - - - - +
37 grados C + + + + + + + + +
42 grados C - + - + + V V + + V
Sensible a: R S S S R R R S R R
-ac. Nalidíxico
-cefalotina S R S R R V R S S S
S=sensible; R=resistente; V=variable; d=reacción débil (Reducción del selenito: C.

helveticus +; C.upsaliensis -)
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS
Estas pruebas se deben realizar a partir de colonias obtenidas individualmente, de un

cultivo puro y después de realizar la tinción de Gram.
1. Oxidasa
Esta prueba deberá realizarse en todos los bacilos Granegativos.
Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa (Indolfenol-Oxidasa), que
cuando se encuentra en presencia de oxígeno atmosférico, Citocromo c y el reactivo oxidasa,
oxidan al reactivo para formar un compuesto coloreado, indo fenol. Esta es una forma rápida
de esta prueba y no se desperdicia reactivo, ya que este se oxida muy rápidamente y es difícil
de conservar. Contribuye a la identificación de Neisseria y Aeromonas (+), Pseudomonadales
(generalmente +), y Enterobacteriaceae (-).
Reactivo: Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (denominado también N-
dimetil-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina).
Preparación del reactivo: En una caja de Petri chica se colocan algunos cristales del
reactivo y se le añade un poco de agua destilada, aquí mismo se deja caer un pedazo de papel
filtro. Esta preparación es para uso inmediato.
Procedimiento: Con un aplicador de madera se toma una colonia bacteriana y se
prueba en el papel filtro humedecido con el reactivo. Se puede observar al microscopio
estereoscópico.
Interpretación:
Prueba positiva.- La colonia toma un color púrpura.
Prueba negativa.- La colonia no cambia de color o toma un color diferente al
purpura.
2. Catalasa
Esta prueba comprueba la presencia de la enzima catalasa.
Reactivo: Se utiliza como reactivo el peróxido de hidrógeno al 3%.
Reacción: 2 H2O2 ------> 2 H2O + O2
Procedimiento: Sobre un porta-objetos se coloca una gota de H 202 y con una pipeta
Pasteur o aplicador de madera se pica una colonia del cultivo y se suspende en la gota de
H2O2.
Interpretación:
Prueba positiva.- Se observa la formación de burbujas.
Prueba negativa.- No se forman burbujas.
La reacción es inmediata y no debe realizarse de colonias que crecen en Agar Sangre

ya que los eritrocitos dan catalasa positiva, a menos que se realice con mucho cuidado
tomando del centro de la colonia sin picar el medio de cultivo. Esta prueba frecuentemente -es
usada para diferenciar Staphylococcus (+) de Streptococcus (-).
3. Hidróxido de potasio al 3%
Esta prueba es para confirmar la tinción de Gram.
Procedimiento: Mezclar bien una colonia con una gota de KOH al 3% en un porta-
objetos.
Interpretación:
Gram positivas: No se observa viscosidad.
Gram negativas: Si la colonia se transforma viscosa o gelatinosa en 5 a 60
segundos. "Elástico”.
4. Movilidad en gota suspendida

Sirve para demostrar en forma rápida la movilidad en los cultivos puros (ideal a partir
de caldos). Algunas cepas muestran poca movilidad cuando se aíslan por primera vez.
Procedimiento: En un porta-objetos excavado colocar alrededor de la excavación un
poco de vaselina. En un cubre-objetos colocar una gota de suspensión de la colonia bacteriana
o de caldo de cultivo y colocarlo con la gota suspendida hacia la excavación de la gota
suspendida hacia la excavación del porta-objetos. Examinar rápidamente al microscopio al
seco débil y seco fuerte. Realizar este paso con cuidado de no romper el cubre-objetos con el
objetivo del microscopio. Observar con luz reducida.
Interpretación:
Positivo: Movimiento activo, independiente, en contra de la "corriente".
Negativo: No se observa movimiento activo.
5. Prueba de Coagulasa
Esta prueba detecta la presencia de la enzima coagulasa, producida por una cepa de
Staphylococcus sobre el plasma sanguíneo. La coagulasa aumenta la velocidad de coagulación
del plasma; el resultado final es la formación de un coágulo de fibrina. La concentración de la
coagulasa influye sobre la velocidad de la coagulación del plasma, cuanto más alta la
concentración más rápidamente se formará el coágulo.
Reactivo: Plasma de conejo o plasma humano.
Procedimiento:
En placa.- Una colonia característica de Staphylococcus es emulsionada en una gota
de plasma de conejo o humano sobre un porta-objetos.
En tubo.- Consiste en colocar 0.1ml del plasma, 0.3ml de Solución Salina Fisiológica
y aproximadamente tres colonias caracteristicas de Staphylococcus, esta preparación se incuba
a 37°C por 24 horas.
Interpretación:
En placa.- La formación de pequeños coágulos o grumos en un tiempo de 2 minutos
indica la presencia de coagulasa y constituye un resultado positivo. Una excepción de falsa
negativa es cuando hay cepas resistentes, en estos casos hay que realizar la prueba de
coagulasa en tubo.
En tubo.- La prueba es positiva si existe formación de un coágulo en el fondo del tubo
y negativa si no se forma coágulo. En esta prueba puede hacerse una primera lectura a las 4
horas de incubación, ya que algunas cepas de Staphylococcus son altamente positivas.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS
1. Agar de Hierro y Tres Azúcares (TSI)
Permite identificar en forma presuntiva bacterias Gram negativas. Se basa en que estos
microorganismos, pueden ser diferenciados sobre la base de la fermentación ácida de azucares,
(glucosa, lactosa y sacarosa) producción de sulfuro de hidrógeno y la producción de gas.
Fermentación de los carbohidratos:

El medio contiene tres hidratos de carbono: lactosa, con concentración de 1%, glucosa
en concentración de 0.1% y sacarosa en concentración de 1%, esta ultima ayuda a investigar la
presencia de especies de Salmonella y Shigella, ya que ninguna de éstas utiliza la lactosa o
sacarosa. Por lo tanto, cualquier reacción A/A en TSI excluye a estos dos patógenos.
El medio en los tubos al ser preparado, adopta la forma de "pico de flauta". La
fermentación se produce aeróbicamente (en el pico de flauta) y anaeróbicamente (en la capa
inferior del cultivo). La fermentación es un proceso metabólico de oxidación-reducción
anaeróbico en el cual un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones en vez del
oxígeno.
El tipo de productos finales producidos por la fermentación de los carbohidratos
depende principalmente del tipo de organismo que lleva a cabo el proceso de fermentación,
pero en general son: hidrógeno, CO2, algunos ácidos, algunos alcoholes y una cetona.
Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa, otras la oxidan, algunos pueden
metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras son incapaces de utilizarla. No todos los
monosacáridos son degradados por todas las especies bacterianas; y el mismo monosacárido
puede ser metabolizado por diferentes vías, dando como resultados diferentes productos
finales. Esto permite la identificación del grupo, género y especie. La fermentación ácido-
mixta es característica de las enterobacterias, y produce los siguientes productos finales: ácido
fórmico, acético, láctico y succínico, etanol y dos gases (CO2 e H2). La acidez hace que el
indicador rojo de fenol vire a amarillo.
Los organismos que fermentan la glucosa pero no la lactosa, dan lugar rápidamente (8-
12 h) a una reacción ácida (amarilla) de todo el medio. A medida que es utilizada la dextrosa,
la reacción ácida de la zona aeróbica (pendiente) revierte por amoníaco generado durante la
degradación de las peptonas, y se vuelve alcalina (rojo) a las 18-24 horas).
Bajo condiciones anaeróbicas, en el fondo (picadura) del tubo, no puede llevarse a
cabo la desaminación oxidativa, por lo que permanece ácido (amarillo). Si la bacteria fuera
capaz de utilizar la lactosa, que se encuentra en cantidades 10 veces mayor que la glucosa,
entonces el ácido generado superaría la reacción alcalina producida por la pendiente, y todo el
tubo tendría condiciones ácidas (amarillo).
Principio de formación de H2S:
El medio además de los carbohidratos contiene una sal, citrato férrico de amonio y una
sustancia química el tiosulfato de sodio, que algunos microorganismos tienen la capacidad de
reducir a sulfuro de hidrógeno (gas incoloro) que al reaccionar con el citrato férrico se hace
visible su producción dando un precipitado negro insoluble. Al reducirse en condiciones de
acidez el azufre de los aminoácidos azufrados y del tiosulfato de sodio se genera H 2S, que en
presencia del hierro del sulfato ferroso forma un precipitado negro de sulfato ferroso.
Producción de gas:
Como producto terminal del metabolismo de los hidratos de carbono puede producirse
gas, la bacteria en este caso se denomina aerogénica. Se observan en el medio burbujas o
desplazamiento total del medio del fondo del tubo dejando un área clara, o una ligera muesca
en el medio en el costado del tubo. Las bacterias que no producen gas se denominan
anaerogénicas, los gases producidos son anhídrido carbónico e hidrógeno
Método de siembra:
Se toma la colonia a probar con un asa recta y se inocula el medio por picadura hasta el
fondo y estrías en la superficie.
Interpretación: Lectura después de 18-24 horas de incubación. Formas de
fermentación básica:
1. Amarillo todo el medio (A/A): Fermentación de la glucosa y de la lactosa o
sacarosa.
2. Rojo todo el medio (K/K): No fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa.
3. Roja la pendiente, amarillo el fondo (K/A): no fermentación de la lactosa o
sacarosa-fermentación de glucosa.
4. Precipitado negro en el medio: Producción de ácido sulfhídrico.
5. Desplazamiento del medio, burbujas, muesca en la pared del tubo: producción de
gas a partir de glucosa.
Color Amarill Rojo

o
Reacción Ácida Alcalina
Abreviatura A K
2. Citrato de Simmons
Determina si un organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
para el metabolismo provocando alcalinidad. Las bacterias al utilizar el citrato, liberan
residuos de sodio, que al unirse con radicales OH alcalinizan el medio. Bajo estas condiciones
el indicador de pH cambia de color verde a color azul. El medio que se utiliza es un Agar que
contiene 2% de citrato de sodio, al cual se le adiciona un indicador de pH, (azul de
bromotimol) es envasado en tubos y queda con superficie inclinada.
Método de siembra: El medio se siembra por estría. La incubación se realiza a
37°C/24-48 horas y en ocasiones es necesario prolongar este período hasta 7 días.
Interpretación:
Prueba positiva.- Cambio del medio a color azul.
Prueba negativa.- El medio permanece verde.
3. Lisina Hierro Agar (LIA)

Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido
(lisina), para formar una amina (cadaverina) y anhídrido carbónico con la consiguiente
alcalinidad. En este medio se puede observar la producción de H2S (por la presencia en el
medio de tiosulfato de sodio y citrato férrico amónico como en el TSI). El medio en los tubos
adopta la forma de pico de "flauta".
Método de siembra:
Por picadura en el fondo del tubo y estría continua en la superficie. Se incuba a

37°C/24 hrs.
Interpretación:
Prueba positiva.- Color púrpura turbio o púrpura amarillento apagado
(producido por la cadaverina).
Prueba negativa.- Color amarillo claro y brillante (solamente fermentación de
la glucosa).
Producción de hierro.- Precipitado negro en el fondo del tubo.
4. Sulfuro Hierro-Indol- Motilidad (SIM)

En este medio se puede determinar la capacidad de un microorganismo de producir
Ácido Sulfhídrico a partir de aminoácidos sulfurados o de sales como tiosulfato de sodio.
También se puede observar la capacidad que tienen otros microorganismos para producir
Triptofanasa y oxidar el Triptófano a Indol. Además de que se puede determinar si un
organismo es móvil o inmóvil.
Método de siembra:
El medio de SIM es semisólido y se siembra por picadura. Se incuba a 37°C/ 24 hrs.
Interpretación:
Para H2S
Prueba positiva.- Precipitado negro a lo largo de la picadura.
Prueba negativa.- No se observa precipitado.
Indol
Se adicionan al medio unas tres gotas del reactivo de Kovac's.
Prueba positiva.- Anillo rojo en la superficie.
Prueba negativa.- Anillo de color anaranjado.
Motilidad
Prueba positiva.- Los organismos móviles migran de la línea de

siembra y se difunden en el medio provocando turbidez.
Prueba negativa.- (Sin motilidad) crecimiento bacteriano no
acentuado siguiendo la línea de siembra; el medio circundante se mantiene claro.
5. Leche tornasolada
Determina la capacidad de un organismo de precipitar la caseína y fermentar la lactosa
en la leche, así como de la digestión de la caseína y producción de reductasas que eliminan O 2,
el medio es líquido de color azul grisáceo.
Método de siembra:
Por agitación del asa. Se incuba 1 a 14 días/37°C examinar diariamente y anotar
cualquier cambio que se presente.
Interpretación:
Acidificación.- color rosado
Grumos ácidos.- coágulo firme color rosa no retraído y que se disuelve
al agregar un pH alcalíno.
Alcalinización.- color azul intenso o morado.
Reducción.- color blanco.
6. Rojo de Metilo:
El rojo de metilo es una prueba que determina la capacidad de las bacterias de producir
ácido a partir de la glucosa de tal forma que el valor del pH del medio desciende a menos 4.4,
esta distinción puede hacerse visible mediante la adición de un indicador como el rojo de
metilo. Si la acidez es mínima, ésta se neutraliza por la acción de la solución amortiguadora
del medio. Se utiliza un medio líquido a base de peptonas, dextrosa y fosfatos.
Método de siembra: Inoculación de la bacteria con asa recta en el caldo RM. Se
incuba a 37°C / 24hrs.
Interpretación: Separar asépticamente 1 ml del medio inoculado, agregar 2 gotas del

indicador rojo de metilo.
Prueba positiva.- Color rojo.
Prueba negativa.- Coloración amarilla.
7. Reducción de Nitratos
Determina la capacidad que tienen algunos microorganismos para reducir nitratos a
nitritos o un desdoblamiento mayor de este último. Se utiliza un caldo Peptonado con 0.1% de
nitrato de potasio, algunas bacterias poseen la enzima nitratasa que reduce los nitratos (N0 3) a
nitritos (N02) o a otros productos de reducción como hiponitritos, hidroxilaminas, amoníaco,
óxido nitroso o nitrógeno gaseoso.
Método de siembra: Se inocula el caldo mediante la agitación del asa. Se incuba
37°C /18 a 24 hrs., si no hay crecimiento aparente incubar hasta 5 días, obteniendo
asépticamente 1 ml cada 24 hrs. para efectuar la lectura.
Interpretación:
Añadir 5 gotas de Solución A (Ácido Sulfanílico 0.8%).
Añadir 5 gotas de Solución B (Dimetil alfa naftilamina 0.6%).
Mezclar y leer después de 1 a 2 minutos.
Positivo.- color rosado o rojo intenso (presencia de nitritos).
Negativo.- sin cambio de color (ausencia de nitritos).
Si la prueba es negativa es posible que la reacción de reducción haya
continuado hasta otros productos; en este caso es necesario adicionar una pizca de polvo de
zinc para confirmar la ausencia de nitratos.
Ausencia de nitratos sin cambio de color.

Presencia de nitratos coloración rojo intenso.
8. Fermentación de Carbohidratos
Determina la utilización de los carbohidratos por las bacterias produciendo ácido o
ácido y gas (cuando se utiliza campana de Durham). Además pueden incluirse entre estos
algunos glucósidos y alcoholes polihídricos en las concentraciones adecuadas para realizar
pruebas de fermentación. La concentración de carbohidratos para pruebas de fermentación y
oxidación es por lo general el 1%, ya que a esta concentración es menos posible de que ocurra
una reversión de la reacción.
Algunas soluciones de carbohidratos pueden esterilizarse en la autoclave pero otras es
posible que sufran descomposición.
A estos medios se les adiciona un indicador generalmente rojo de metilo para dar
evidente un cambio de pH que ocurre durante el crecimiento de las bacterias. Algunas veces es
necesario adicionar suero para pruebas especiales con microorganismos exigentes.
Método de siembra:
Agitación del asa bacteriológica. Se incuba a 37°C / 18-24 hrs.
Interpretación:
Prueba positiva.- color amarillo.
Prueba negativa.- color rosado o no cambia de color.
Cuando se utiliza con campana de Durham una prueba positiva es cuando se forma una
burbuja dentro del tubo y en una prueba negativa no hay formación de burbujas.
9. Hidrólisis de la Esculina
Determina la capacidad de una bacteria de hidrolizar el carbohidrato esculina a
esculetina y glucosa. Se utiliza un medio a base de caldo peptonado, esculina y citrato férrico.
Si la bacteria utiliza la esculina se liberará 6,7 dihidroxicumarina que reacciona con el hierro
del medio dando una coloración café obscura o negra.
Método de siembra: Por agitación del asa bacteriológica se incuba en un período de 1
a 7 días a 37°C.
Interpretación:
Prueba positiva.- coloración café obscura o negra.
Prueba negativa.- sin cambio de color.
10. CAMP-Esculina
La prueba de CAMP, utiliza los fenómenos líticos de los estreptococos del grupo Beta
de Lancefield en presencia de toxina estafilocócica beta, es suficientemente exacta para la
identificación presuntiva sistemática de Streptococcus agalactiae. Puede realizarse al mismo
tiempo la prueba de hidrólisis de la esculina en medio sólido.
Método de siembra: Se utiliza Agar Sangre con Esculina.
a) Se inocula una cepa de Staphylococcus beta hemolítico en el centro de una placa.
b) Las cepas de Streptococcus a probar se inoculan cerca de la estría del
Staphylococcus a los lados, identificando cada una si se utilizan varios inóculos de
Streptococcus. Utilizar un control positivo.
Interpretación:
Prueba de CAMP positiva.- si se forma una especie de flecha transparente en la
región donde se encuentran el inóculo de Streptococcus a probar con el Staphylococcus.
Prueba de CAMP negativa.- no se completa la hemólisis del Streptococcus en
prueba.
Prueba de Esculina Positiva.- un halo negro alrededor de las colonias.
Prueba de Esculina Negativa.- no se forma ningún halo.
11. Caldo de Urea

Determina la habilidad de las bacterias de producir la enzima ureasa que desdobla la
urea a amoníaco. Se utiliza un medio bufferado neutral de sales minerales conteniendo 2% de
urea y rojo de fenol como indicador. Puede utilizarse un medio sólido en tubo (con pico de
flauta).
Método de siembra: Mediante la agitación del asa bacteriológica. Se incuba 18 a 24
hrs a 37°C.
Interpretación:
Prueba positiva.- color morado.
Prueba negativa.- color rosado.
12. Hidrólisis del Almidón (Agar Almidón)

Determina la capacidad de las bacterias de hidrolizar el almidón, produciendo una
exoenzima y convirtiéndolo en maltosa y glucosa. El medio se prepara en cajas de petri.
Método de siembra: Realizar una sola estría del inóculo a probar sobre el agar cerca
de uno de los bordes de la caja. En el otro borde hacer una estría con un control positivo.
Incubar a 37°C/48 hrs.
Interpretación:
Añadir una solución de Lugol a la superficie de la caja.
Prueba positiva.- ningún cambio.
Prueba negativa.- color obscuro.
13. Hidrólisis del Hipurato

Se basa en la acción de la enzima hipuricasa sobre el hipurato de sodio lo que
produce glicina y ácido benzoico. La reacción del reactivo (Ninhidrina) produce una
coloración azul- violeta en contacto con la glicina.
Método de siembra: Suspender una azada de la cepa en 400 microlitros de
una solución de hipurato de sodio al 1%. Luego de incubar a 37°C durante 2 horas, se le
agrega 200 microlitros de la solución de Ninhidrina al 3.5 % en acetona-butanol 1:1 por la
pared del tubo y se deja reposar a 37°C observándolo a los 10 min.
Interpretación:
La aparición de una coloración azul violeta indica una reacción positiva que revela la
presencia de la glicina, producto final de la hidrólisis del hipurato.
14. Producción de H2S en el medio de LIOR (Para Campylobacter)

La reacción se basa en la liberación de ácido sulfhídrico por la acción de la

enzima Cisteína Desulfhidrasa sobre los aminoácidos que contienen azufre. Se pone en
evidencia por indicadores como sulfato ferroso, tiosulfato de sodio etc.
Método de siembra; Se determina depositando una azada grande de colonias en el
centro de la columna del tubo del medio para H2S (medio de LIOR). Los tubos se incuban en
baño María a 37°C por 2 horas.
Interpretación:
La aparición de una coloración negra alrededor del inóculo indica una reacción
positiva. En caso de dudas, la incubación puede prolongarse a temperatura ambiente o a 37°C.
Una alternativa consiste en usar el medio de cultivo TSI o KLIGER incubando en
microaerofilia, aunque los resultados pueden no ser constantes.
Código Nombre del documento Lugar de almacenamiento

Manual de Bacteriología Veterinaria. UADY. Mérida
N/A Yucatán, México. Autores: Salazar F. M del R., Laboratorio de Bacteriología
V. DOCUMENTOS
EcheverríaDE
C. REFERENCIA
Pilar E.(2000).
CAMP: Nombre que se le da a la prueba que se utiliza para la identificación

presuntiva de Streptococcus del grupo B (Streptococcus agalactiae), su significado es
VI. GLOSARIO
Christie, Atkins y Munch-Peterson, quienes la describieron en 1944.
VII. CONTROL DE REVISIONES
Nivel de Sección y/o Fecha de

Descripción de la modificación y mejora
revisión página modificación
01 1 Actualización de las firmas. Octubre 2012
Todo el Se modificó la redacción y el número de
documento páginas de cada apartado.
Se cambio la redacción de los párrafos en
02 31/Agosto/2016
los apartados de todas las secciones.
Nota: Esta sección será utilizada a partir de la primera modificación a este

documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco.
Elaboró Revisó Aprobó
QFB Ana Ma. Rejón Magaña Dr. José Alberto Rosado Aguilar Dr. José Alberto Rosado Aguilar
Técnico Académico Responsable del Laboratorio Responsable del Laboratorio
Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el

documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación
dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de
Yucatán

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Código: M-CCBA-LB-02 Revisión: 02 Página: 1 de 95

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Fig. 17. Prueba Confirmatoria para Coliformes Totales

Prueba confirmatoria para coliformes fecales:

Fig. 18. Prueba Confirmativa para Coliformes Fecales

Fig. 19. Evaluación de las Pruebas Presuntiva y Confirmativas en la

Cálculo y presentación de resultados:

Los resultados se elaboran de la siguiente manera:

b. Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor

Los resultados obtenidos se expresarán de la siguiente manera:

Con estos datos consultando la tabla del NMP correspondiente tenemos:

 Para coliformes totales se establece el código del triplete: 3,1,1 y consultando la

b) Recuento de Bacterias Mesofílicas Aerobias (BMA) en agua.