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La biodegradación de triclosán por un microorganismo de aguas residuales

Hacer Gyun Lee un , Fuman Zhao un , Yohannes H. Rezenom segundo , David H. Russell segundo , Kung Hui-Chu un , *
un Departamento de Ingeniería Civil, Universidad de Texas A & M University, 205g WERC, 3136 TAMU College Station, TX 77843 hasta 3136, EE.UU.

segundo Departamento de Química de la Universidad de Texas A & M University, College Station, TX 77843-3136, EE.UU.

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Triclosan, un agente antimicrobiano sintético, se ha considerado como un contaminante ambiental emergente. Aquí reportamos un

Recibido el 13 de diciembre de 2011 aislado bacteriano de aguas residuales triclosán-degradantes,

recibida en forma 13 de marzo de 2012 Sphingopyxis colar KCY1, capaz de decloración triclosan con una liberación estequiométrica de cloruro. La mancha puede degradar

revisada difenil éter, pero no 2,4,4 0- éter tribromodiphenyl y

Aceptado 13 de mayo de 2012 Disponible No en línea 2,2 0, 4,4 0- éter de tetrabromodifenilo, a pesar de todos estos tres compuestos son estructuralmente similares a triclosan. Mientras que

el 21 de mayo de 2012 la cepa KCY1 fue incapaz de crecer en triclosán y catecol, podría growwith glucosa, succinato de sodio, acetato de sodio, y fenol.

Cuando se cultiva con medio nutriente complejo que contiene una cantidad de trazas de triclosan (tan bajo como 5 metro g / L), la cepa

palabras clave: podría conservar su capacidad de degradación hacia triclosan. La velocidad de degradación triclosan fi c máxima especí ( q metro) y la

El triclosán constante de media velocidad ( K metro) son 0,13 mg-triclosan / mgprotein / día y 2,8 mg-triclosan / L, respectivamente. A medida que

biodegradación avanzaba la degradación triclosan, cinco metabolitos fueron identificados y estos metabolitos siguen transformando en productos

Sphingopyxis colar KCY1 de Aguas finales no clorados, que fue apoyada por una fuerte caída en el potencial androgénica. Se detectó la actividad de la catecol

Residuales 2,3-dioxigenasa en el extracto celular. No degradación triclosan se observó en presencia de uorocatechol 3-fl, un inhibidor de meta- enzima

Meta- escote de escisión, lo que sugiere que la degradación triclosan proceder a través meta- vía de escisión. Sobre la base de todas las

observaciones, se propuso una vía de degradación para triclosán por cepa KCY1.

ª 2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción 2004 ). Cuando se expone a los rayos UV, triclosan potencialmente puede ser transformado en

productos químicos más tóxicos como chlorodioxins ( Latch et al., 2003 ; Regla et al., 2005 ). El

El triclosán (5-cloro-2- (2,4-diclorofenoxi) fenol) es triclosán tiene actividad androgénica shownweak en las especies acuáticas ( Foran et al., 2000 )

un agente antimicrobiano sintético común que ha sido incorporado en más de 700 productos de Y las dos respuestas estrogénicas y androgénicas en células de cáncer de mama humano ( Gee

cuidado personal e industrial diferentes. Estos productos, incluyendo desodorantes, jabones, et al., 2008 ), Lo que sugiere triclosan en sí es un compuesto de alteración endocrina.

pastas de dientes, y diversos productos plásticos, contienen

0.1 mi 0,3% de triclosan ( Sabaliunas et al., 2003 ; Schweizer, 2001 ; Biodegradación de triclosán en el medio ambiente y las aguas residuales se ha convertido

Singer y col., 2002 ). No es sorprendente, triclosan, que van desde recientemente en un tema de investigación interesante ( Hay et al., 2001 ; Kim et al., 2011 ; Meade

0,14-2,3 metro g / L, se detectó en el 58% de 139 flujos de Estados Unidos ( Kolpin et al., 2002 ). et al., 2001 ; Roh et al., 2009 ; Sabaliunas et al., 2003 ; Schweizer, 2001 ; Singer y col., 2002 ). Un

El generalizado del triclosán en el medio ambiente ha planteado una gran preocupación, debido estudio anterior informó de que aproximadamente el 79% de triclosan se eliminó mediante

a que el nivel de seguimiento de triclosán podría promover el desarrollo de microorganismos procesos de tratamiento biológico de aguas residuales ( Singer y col., 2002 ), Lo que sugiere que

antimicrobialresistant ( Braoudaki y Hilton, 2004 ), Y causar efectos adversos en el ecosistema ( Tatarazako

(i) la biodegradación puede ser un mecanismo de eliminación importante en aguas residuales

et al.,

* Autor correspondiente. Tel .: þ 1 979 845 1403; fax: þ 1 979 862 1542. E-mail: kchu@civil.tamu.edu
(K.-H. Chu).
0043-1354 / $ mi see front matter ª 2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 /
j.watres.2012.05.025
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y (ii) bacterias triclosán que degradan están presentes en el lodo activado. Estos dos aspectos número de acceso para la secuencia de ARNr 16S de la cepa KCY1 era DQ983313.2.

fueron apoyados por dos estudios posteriores. Por ejemplo, biodegradationof triclosanwas descripciones detalle de enriquecimiento, el aislamiento y la confirmación de la capacidad de

observadas por twowastewatermicroorganisms, Sphingomonas sp. RD1 ( Hay et al., 2001 ) y Nitrosomonas
degradación de triclosan de este aislado están disponibles en la información complementaria

europaea ( Roh et al., 2009 ), Y por nitrificantes lodo activado ( Roh et al., 2009 ). Sin embargo, (SI). La morfología de las células del aislado se observó por microscopía electrónica de

nuestro conocimiento sobre los microorganismos capaces de degradar las aguas residuales transmisión (TEM) ( Fig. S1 en SI).

triclosanis limitado. Recientemente, aknowndiphenyl etherdegrader,

2.3. Determinación de la capacidad de degradación hacia el triclosán y

Sphingomonas sp. PH-07, mostró una capacidad de degradar parcialmente triclosán y producir compuestos estructuralmente similares a triclosan
tres metabolitos (triclosan hidroxilado, 4-clorofenol, y 2,4-diclorofenol) ( Kim et al., 2011 ). Hasta la

fecha, ningún decloración completa de triclosanwas observado y cinética de degradación El aislado se cultivó inicialmente en 20% R2Amediumwith 5 mg / L triclosan durante tres días. La

triclosán y vías aún siguen sin estar claros. suspensión de células se recogió por centrifugación y el sedimento se lavó con solución salina

tamponada con fosfato 50 mM y después se resuspendió en medio NMS fresco para su uso

experimental. Los ensayos de degradación se realizaron en 250 ml fl pide que contiene la

En este estudio, se presenta el aislamiento y la caracterización de una bacteria de aguas suspensión de células en reposo y 5 mg / L de triclosán. El matraces se incubaron en un

residuales triclosan-degradantes, Sphingopyxis agitador rotatorio a 150 rpm y a 30 C, y las muestras líquidas se recogieron en el tiempo para

colar KCY1. Este aislado mostró decloración completa de triclosan base a la liberación triclosanmeasurements. Un subconjunto de las muestras de líquido recogido se utilizó para

estequiométrica de cloruro. También se determinó la cinética de degradación triclosan, BLYES y ensayos BLYAS. muestras de líquido recogido a partir de experimentos de

propuesto posible vía de degradación para el triclosán, y se evaluó el potencial significación fi de degradación también se utilizaron para medir las concentraciones de cloruro.

este aislado a triclosán biodegradación en las aguas residuales.

Se realizó un conjunto paralelo de experimentos para determinar si el aislado podría

degradar compuestos que son estructuralmente similares a triclosan. Tres compuestos, éter de

2. material y métodos difenilo (DE, (1 g / L), 2,4,4 0- éter tribromodiphenyl (tri-BDE, 1 mg /

2.1. productos químicos L), y 2,2 0, 4,4 0- éter de tetrabromodifenilo (tetra-BDE, 1 mg / L) ( Kim et al., 2007 ; Robrock et al.,

2009 ), Fueron seleccionados ( Fig. S2 en SI). En particular, PDBEs, utilizados como retardantes

Triclosan (TCS) (97% puro) se adquirió de Aldrich Chemical Inc. (Milwaukee, WI). de llama, son tóxicos y conocidos como disruptores endocrinos ( Meerts et al., 2000 ). Los

Dimetilformamida (DMF) se adquirió de Mallinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ). experimentos de degradación se realizaron de manera similar como se describe anteriormente,

excepto que se utilizó la suspensión de células en reposo (OD 600 ¼ 0.6 mi 0.8) y cada uno de

N, O-bis (trimetilsilil) tri fl uoroacetamide (BSTFA) y ácido bicinconínico (BCA) kit de ensayo de estos tres compuestos.

proteínas se adquirieron en Pierce Biotechnology Inc. (Rockford, IL). éter de difenilo (DE),

2,4,4 0- éter Tribromodiphenyl (tri-BDE) y 2,2 0, 4,4 0- tetrabromodifenilo éter (tetra-BDE) fueron 2.4. La resistencia a otros agentes antimicrobianos
adquiridos de Accustandard (New Haven, CT). 3-Fluorocatechol fue comprado fromAlfar Aesar

(Ward Hill, MA). kit de ADN rápido se compró de Q-Biogene (Carlsbad, CA). solución madre de Se realizaron experimentos para determinar si la cepa KCY1 pudo resistir a tres agentes

1 g / L triclosan se preparó en acetona. antimicrobianos comunes: kanamicina, trimetoprim y ampicilina (Ver SI para los detalles

experimentales).

2.2. El aislamiento y la identificación de bacterias fi triclosán degradadoras 2.5. Determinación de los parámetros cinéticos Monod para la
degradación triclosan

Un consorcio triclosan-degradantes, se inocularon inicialmente con lodos activados, se utilizó Monod degradación modelo cinético q ¼ q m $ S = K s þ S, se utilizó para describir la degradación

como fuente para el aislamiento de bacterias triclosán-degradantes. Brevemente, un asa de de triclosán por KCY1 cepa. Los experimentos cinéticos se llevaron a cabo en una serie de 40

siembra de la consorcio estaba veteado en sales de nitrato de minerales (NMS) -triclosan (5 mg viales de vidrio ml de la EPA que contienen células en reposo de KCY1 cepa (OD 600 ¼ 0.4) y

/ L) placas de agar que se incubaron a 30 C ( Chu y Alvarez-Cohen, 1996 ). Debido a lento y triclosan (que van de 0,3 a 5 mg / L) en medio NMS. El vialswere se incubaron en un agitador

pobre crecimiento de colonias en las placas de agar NMS-triclosán, colonias con diferente rotatorio a 150 rpmand a 30 C durante 3 h, y luego se usa para las mediciones de triclosán y de

morfología se seleccionaron y se re-sembró en 1 / placas de agar R2A-triclosan 10 resistencia proteínas. El duración de incubación (3 h) se determinó en el laboratorio donde las tasas de

(que contienen 5 mg / L de triclosán, 10% de R2A caldo y 10,8 g / L de BBL agar seleccionado). degradación inicial se mantuvo lineal. Los datos experimentales obtenidos a partir de ensayos

Sólo una de las tres cepas, llamado cepa KCY1, fue posteriormente confirmado con una cinéticos se representaron como tasas de degradación c triclosan especí fi ( q, masa de sustrato /

capacidad de degradar el triclosán en liquidmedium. El gen 16S rRNA de KCY1 cepa fue masa de proteína de la célula / hora) frente a las concentraciones de triclosán ( S, masa /

secuenciado como se ha descrito previamente ( Yu et al., 2007 ). La secuencia se alineó con volúmenes). La velocidad de degradación máximo específico triclosan ( q metro, masa de triclosán /

otras bacterias triclosán que degradan conocidos usando Clustal X2. Un árbol filogenético fue masa de proteína de la célula / hora) y la constante de halfvelocity ( K metro, masa de triclosán /

construido usando el software TreeView. el GenBank volumen) se determinaron por la curva racor usando Sigmaplot 8.0 (SPSS Inc.) como
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descrito previamente ( Roh y Chu 2010 ). Todos los experimentos cinéticos se llevaron a cabo por con un AS14A-5 IonPac metro m columna analítica (3 150 mm). Triclosán, tri-BDE, tetra-BDE, y

duplicado. DE concentraciones y metabolitos de degradación se determinaron utilizando un GC (Agilent

2.6. Determinación de la capacidad de degradación / utilización hacia 6890) / MS (Agilent 5973) equipado con una columna DB-5. Además, todetect

otros orgánicos possibledegradationmetabolites, LC / MSanalysis se realizó usando un sistema de Surveyor

HPLC (ThermoFinnigan, San Jose, CA) interconectado con espectrómetro cuádruple trampa de

Se llevaron a cabo experimentos para determinar si el aislado podría crecer en tres iones de masas (LCQ-DECA; ThermoFinnigan). Descripción detallada de análisis químico está

macro-orgánicos comunes en las aguas residuales: glucosa (300 mg / L), acetato de sodio (175 disponible en SI.

mg / L), y succinato de sodio (de 300 mg / L) ( Roh y Chu 2010 ). Se seleccionaron estos

compuestos para los experimentos porque la glucosa es un carbohidrato común, y

sodiumsuccinate y acetato de sodio son componentes presentes dentro del ciclo del ácido

tricarboxílico (ciclo TCA). El crecimiento celular expresa como densidad óptica (OD 600), contenido
3. Resultados y discusión
de proteínas, y sólidos en suspensión volátiles, se monitorizó con el tiempo. tiempos de

duplicación se determinaron a partir de las curvas de fase de crecimiento exponencial. Se

3.1. La identificación de un, KCY1 cepa triclosan que
utilizaron células Autoclavekilled como controles negativos.
degradan microorganismo

Entre tres colonias triclosán que degradan presuntivos, un aislado (amarillo-mucoide), cepa

designada KCY1, mostró la capacidad de degradar el triclosán en un medio NMS. Strain KCY1

es un corto, en forma de varilla (0.5 metro metro 1.7 metro m) Gram-negativo bacteriumwith un fl
2.7. Efecto de nutrientes complejos en la degradación de triclosan
agelo ( Fig. S1 en SI). Basándose en su secuencia del gen 16S rRNA, cepa KCY1 es un

miembro del género Sphingopyxis.

Las células cultivadas en un medio nutriente complejo sin exposición previa a triclosan se

ensayaron para determinar su capacidad para retener su biodegradación de triclosán. Los

Como se muestra en Figura 1 , Cepa KCY1 tenía 98% de similitud con Sphingopyxis sp. M20, un
experimentos se llevaron a cabo como sigue. KCY1 cepa se cultiva en un medio 100% R2A
conocido bacteria fenantreno-degradantes ( Bodour et al., 2003 ). StrainKCY1 también tiene 93%
(totalmente en nutrientes) sin o con (5 o 500 metro g / L) triclosan y se transfiere a su respectivo
de similitud con dos degradadores DE ( Sphingomonas sp. PH-07 y Sphingomonas sp. SS3) y un
medio de crecimiento cada dos días. Después de cuatro transferencias consecutivas, las células
conocido degradador de triclosan ( Sphingomonas sp. Rd1) ( Hay et al., 2001 ; Kim et al., 2007 ; Schmidt
se recogieron como se describe anteriormente para las pruebas degradación. Los experimentos
et al., 1992 ). Además, la cepa KCY1 tiene 80% de homología con dos degradadores bifenilo
de degradación se realizaron en viales de vidrio que contienen 5 mg / L triclosan y las células en
bien estudiados, xenovorans Burkholderia LB400 y Rhodococcus sp. RHA1, indicando que no
reposo en medio NMS.
hay relación sustancial entre la cepa KCY1 y estas cepas PCB degradantes (ver

2.8. Bioluminiscente ensayos androgénicos / estrogénica cribado

Fig. S5 en SI). No es sorprendente observar el alto grado de homología

Methanococcus thermolithotrophicus [ M59128]

Para evaluar el potencial androgénica y estrogénica de metabolitos de degradación triclosan y

productos finales, la proyección androgénica y estrogénica bioluminiscente (BLYES y BLYAS)

assayswere realizó como se describió previamente ( Eldridge et al., 2007 ; Sanseverino et al.,
Sphingopyxis Strain KCY1 [DQ983313.2] 1,2
2005 ).

Sphingopyxis sp. M20 [AY177357] 3

2.9. Determinación de las enzimas responsables de la degradación triclosan

Sphingomonas sp. PH-07 [DQ185574] 1,2

sphingomonadaceae

El aislado se proyectó para la presencia de 2,3dioxygenase catecol y / o catecol 1,2-dioxigenasa

usando un spectrophotometricmethodasdescribedpreviously ( KleckaandGibson, 1981 ; Nakai et Sphingomonas sp. SS3 [DQ185574] 2

al., 1988 ). Además, la degradación de triclosan vía

Sphingomonas sp. Rd1 [AF292238] 1

meta- vía de escisión se puso a prueba mediante la adición de uorocatechol 3-fl (50 mg / L) o en
0.1
ausencia de la misma. 3-Fluorocatechol es un inhibidor de la catecol 2,3-dioxigenasa que

cataliza meta- reacciones de escisión ( Bartels et al., 1984 ; Toyama et al., 2010 ). La falta de Figura 1 mi Un árbol filogenético que muestra la relación relativa entre la cepa KCY1 y

triclosan degradationinthepresenceof uorocatecholwould 3-fl, por lo tanto, sugieren que una meta- especies afines (familia:

reacción de escisión es esencial para la degradación de triclosán. Sphingomonadaceae). El árbol filogenético fue construido usando el método de vecino a

participar con sus raíces y arranque haciendo referencia a thermolithotrophicus

Methanococcus. los valores de arranque de apoyo de 1000 repeticiones se indican en los

nodos de ramificación. La barra de escala corresponde a 10 sustituciones por 100 posiciones

2.10. Análisis químico de nucleótidos. 1 bacterias Triclosan-degradantes; 2 Difenil-éter bacterias degradantes; 3 bacterias

fenantreno-degradantes.

Las concentraciones de cloruro se midieron usando un sistema DX-Ion 80 La cromatografía (IC)

(Dionex, Sunnyvale, CA) equipada

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de la cepa KCY1 a otros agentes de degradación de contaminantes conocidos, ya que muchos 100 4
la respuesta androgénica liberación
miembros de los géneros Sphingopyxis, y los sphingomonads eran conocidos por su capacidad relativa Triclosan Cloruro

para degradar una amplia gama de xenobióticos-contaminantes ( Stolz, 2009 ; Tani et al., 2011 ).

* Liberación Cloruro (mol de

80
3

respuesta androgénica relativa (%)

cloruro / mol de triclosan)

Triclosan restante (%)
60

3.2. Características de la cepa KCY1 2

o
40

Desde cepa KCY1 puede crecer rápidamente en agar R2A, se espera que la cepa también
1
20
puede crecer en glucosa, succinato de sodio, y acetato de sodio ( Figura 2 ). Se observó un

rendimiento de crecimiento más altas cuando el acetato de sodio se suministra como una fuente
0 0
de carbono. Los rendimientos medios observados ( Y) oscilado 0,10-0,22 mgprotein / mg-BOD L. Se
0 1 2 3
observaron los tiempos de duplicación que oscilan entre 5 y 9 h. La capacidad de KCY1 cepa Día

para crecer en estos compuestos orgánicos sugiere que la cepa puede crecer en presencia de
Fig. 3 mi Biodegradación de triclosán por las células en reposo de KCY1 cepa. Se observó
compuestos orgánicos comunes en las aguas residuales. Aunque cepa KCY1 puede degradar
reducción de potencial androgénica en las muestras durante la degradación triclosan. Las
triclosan (véase más adelante), no se observó aumento de la biomasa / proteína durante más de
respuestas androgénicas relativas de las muestras en el tiempo se determinaron dividiendo la
30 días cuando la cepa se suministra con triclosan como única fuente de carbono en el medio
respuesta inicial medida en el tiempo cero. Triclosan restante (círculos abiertos); respuestas
NMS (datos no mostrados). Este resultado sugiere que la cepa KCY1 fue incapaz de crecer con
androgénicas relativas (rombos abiertos); liberación de cloruro de (cuadrados abiertos). * 3
triclosán. Además, la cepa KCY1 se encontró que era de kanamicina y resistentes a la
moles de cloruro se libera teóricamente por 1 mol de triclosan degradado.
trimetoprima, pero sensibles a la ampicilina (datos no mostrados).

3.3. La degradación de triclosán por KCY1 cepa

las tasas de degradación, única comparación cualitativa se pueden hacer a continuación. Por

Como se muestra en Fig. 3 , Cepa KCY1 degrada aproximadamente 90% de triclosán inicial (5 ejemplo, un tiempo mucho más largo (4 mi se necesitaba 9 días) para las bacterias triclosán

mg / L) en 24 h y llegó a la eliminación de 100% en el día 2. La tasa de la degradación fi degradantes de dos suelos, Pseudomonas putida y Alcaligenes xylosoxidans subsp latas fi

específica inicial para triclosan osciló desde 0,099 hasta 0,103 mg-triclosán mg proteína / / día ( Fig. denitri para degradar 0,15 mi 0,18 mg / L de triclosan ( Meade et al., 2001 ). degradación triclosan

3 ). Strain KCY1 era capaz de triclosan completamente degradante a una tasa de degradación incompleta fue reportado por Sphingomonas sp. Rd1 y consorcio triclosan-degradantes (35% de

más rápida que las de los microorganismos degradadores triclosán conocidos ( Hay et al., 2001 ; Kim triclosan (500 mg / L) en 14 días) ( Hay et al., 2001 ), y por europaea N. ( 50% de triclosan (1 mg /

et al., 2011 ; Meade et al., 2001 ; Roh et al., 2009 ). Dado que los estudios anteriores no contienen L) en 1 día) ( Roh et al., 2009 ). Un estudio reciente mostró que Sphingomonas sp. PH-07 puede

datos suf fi ciente para el cálculo del específico degradar 25% de triclosan (10 mg / L) en 8 días ( Kim et al., 2011 ). Desde el triclosán es un

compuesto clorado, la cantidad de liberación de cloruro de biodegradación triclosan podría ser

utilizado para evaluar el grado de descloración. Suponiendo que 5 mg / L (0,017 mmol / L)

triclosan está completamente sin cloro, una concentración de cloruro teórica de 1,84 mg / L

(0,052 mmol / L) se espera (nota: el cálculo se basa en 3 moles de cloruro se libera

D-glucosa succinato sódico teóricamente por 1 mol de triclosán degradado). Al final del experimento de degradación (es
300 Acetato de sodio Controlar decir, en el día 3), se observó 107% de la cantidad teórica de la liberación de cloruro de (1,96
El contenido de proteína (mg / L)

mg / L), lo que sugiere que el triclosán fue completamente decloran mediante KCY1 cepa. Para

nuestro conocimiento, este es el primer estudio que informó decloración completa de triclosán
200
por una rápida microorganismo triclosandegrading aguas residuales.

100

0
0 1 2 3 4 5
Día

Figura 2 mi Las curvas de crecimiento y la cinética de KCY1 cepa con tres orgánicos

diferentes: glucosa, acetato de sodio, succinato de sodio y. Se calcularon los rendimientos 3.4. potencial androgénica y estrogénica de metabolitos de
de crecimiento y tiempos de duplicación durante el crecimiento exponencial. un Y [ producir degradación triclosan y productos finales
coeficiente. segundo Sobre la base de la demanda de oxígeno teórica: 1 mgglucose / L [ 1,1

mg-BOD L / L; 1 succinato mg-sodio / Byles y BLYAS assayswere utilizarse para evaluar el potencial estrogénico y androgénica de

degradationmetabolites triclosán y productos finales. El triclosán en sí desencadena la actividad

L [ 0,6 mg-BOD L / L; 1 mg de acetato de sodio / L [ 0,5 mg-BOD L / androgénica débil en el ensayo BLYAS, pero no la actividad estrogénica en el ensayo BLYES en

L. 1 g-proteína [ 1.5 g-VSS (medido en el laboratorio). * Los rendimientos de los heterótrofos este estudio. Los diferentes resultados observados por el ensayo de BLYES y por las células de

aerobios van de 0,42 g-VSS / GBOD L con otros donadores de electrones a 0,49 g-VSS / cáncer de mama humano ( Gee et al., 2008 ) Podría ser debido a las diferentes respuestas y

GBOD L
con BOD carbohidratos ( Rittmann y McCarty, 2001 ).
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sensibilidades entre las células de levadura y células de cáncer de mama humano. Como se sabe si la tensión KCY1 conservaría su capacidad de degradar el triclosán después de que ha

muestra en Fig. 3 , El potencial androgénica de las muestras líquidas disminuyó en tres pasos crecido en nutrientes complejos. Para determinar los efectos de los nutrientes sobre la

diferentes: una muy rápida disminución de la primera 6 h, seguido de un ritmo mucho más lento biodegradación triclosán por cepa KCY1, la cepa se cultivó inicialmente en medio rico en

disminuir entre hora 6 y día 2, y luego se redujo a la tasa amoderate entre el día 2 y día 3 . Este nutrientes (100% R2A) sin triclosan durante 8 días (4 Transferencias consecutivos cada 2 días).

patrón de declive no correspondwell a la tendencia a la degradación triclosán mi Después crecido en medio rico en nutrientes sin triclosán, cepa KCY1 perdió su capacidad de

degradación hacia triclosan ( tabla 1 ). Sin embargo, cuando triclosan estaba presente en el

medio de crecimiento (ya sea 5 o 500 metro g / L), la cepa fue capaz de degradar completamente

aproximadamente 95% de triclosán se degradó en el día 1 y la concentración triclosan estaba 5 mg / L de triclosán dentro en cuatro días (datos no mostrados). Como se muestra en tabla 1 ,

por debajo del límite de detección en el día 2. Algunos intermedios desconocidos con mayor o Se observó una tasa de degradación específico triclosan inicial mucho más lento (masa de

menor potencial androgénico podría haber sido producido durante la transformación triclosan. triclosán / biomasa / tiempo) para las células cultivadas con 100% R2A y 5 metro g / L de

Sin embargo, al final de la degradación de triclosan, estos metabolitos conocidos y compuestos triclosan que las células cultivadas con 100% R2A y 500 metro g / L de triclosán. Sin embargo,

intermedios desconocidos convierten en productos finales / metabolitos con potencial no y / o después de la exposición a 5 mg / L de triclosan para 1 día, se observaron tasas similares

menos androgénica. específicos c triclosán de degradación (entre el día 1 y día 2) tanto para células con exposición

previa a triclosan. De hecho, estas tasas de degradación observados entre el día 1 y día 2

estaban muy cerca de los tipos mostrados por las células pre-cultivaron en medio R2A 100%

Desde el triclosán es un compuesto orgánico clorado, la disminución del potencial con 5 mg / L triclosan. Estos resultados sugieren que es necesario para la cepa KCY1 para tener

androgénica con el tiempo podría correlaciona con el grado de descloración durante la una exposición previa a triclosan, independientemente de las concentraciones, con el fin de

degradación triclosan. La disminución del potencial androgénico podría explicarse por la mantener su capacidad para degradar triclosan. Por otra parte, bajo la fuerza del medio de

disminución de la concentración inicial triclosan y la transformación en metabolitos menos richnutrient (20% vs. 100% de medio R2A) podría mejorar la tasa de degradación triclosan de

cloradas de que se detectaron en este estudio antes del día 1 (ver identi fi cación de metabolitos strainKCY1. Como las concentraciones de triclosán ambiente en el rango de las aguas

a continuación). Betweenday1andday2, la actividad thereductionrateofandrogenic convirtió más residuales de 0,61 a

lento que la velocidad de degradación de triclosán, lo que sugiere que (i) otros metabolitos

androgénicos pueden ser producidas durante este periodo o (ii) androgenicmetabolitesmight ser

transformado a una velocidad más lenta que la velocidad de degradación triclosan.

Curiosamente, la respuesta androgénica ( w se observó 40% de respuesta original) a pesar de

que el triclosán ya no se detectó después de día 2. Esto indicó una lenta transformación de

metabolitos triclosán con androgenicidad, como 2,4-diclorofenol. Estudios previos han informado

de que el 2,4-dichloropehnol exhibió en vivo actividad androgénica en cebra embriones de peces 5.1 metro g / L ( Thompson et al., 2005 ; Yu y Chu, 2009 ) Y las aguas residuales está lleno de

( Sawle et al., 2010 ) Y en células de cáncer de próstata humano ( Kim et al., 2005 ). La compuestos orgánicos fácilmente disponibles, la cepa KCY1 puede ser capaz de groweffectively

declaración es apoyada por 84% de la onday2 liberación cloruro estequiométrica. Onday3, no se inwastewater mientras degradar triclosan a una velocidad razonable. El fenómeno de la pérdida

detectó androgenicpotential de thesample y se obtuvo mayor que 100% de recuperación de de capacidad de degradación triclosan después de crecer en medio rico en nutrientes sin

cloruros, lo que sugiere la decloración y la descomposición de los metabolitos que contienen triclosan sugirió que el gen implicado en triclosan biodegradationmight estar en un plásmido ( Singh

cloro en los productos finales ninguno-clorado sin actividad androgénica. et al., 2004 ; Vega et al., 1988 ). También es posible que la cepa KCY1 requiere un período más

largo de tiempo para recuperar su capacidad degradación triclosan después de pre-crecido en

medio rico en nutrientes. Estos aspectos no fueron explorados en este estudio. Se necesitan

estudios adicionales para aislar el plásmido e identificar los genes catabólicos que son

responsables de la biodegradación triclosan.

3.5. Factores que afectan a la degradación de triclosan 3.6. parámetros cinéticos de degradación para triclosan

Aswastewater contiene gama awide de compuestos orgánicos complejos que son fácilmente Los resultados de la degradación de triclosan testswere utilizados para desarrollar la relación

disponibles para el crecimiento microbiano, es importante entre especí fi tasa de degradación c triclosan ( q)

tabla 1 mi Efectos de medio de crecimiento en fi c tasas de degradación triclosan específicos de cepa KCY1.

Tratos fi c velocidad de degradación Speci (mg proteína / mg-triclosan / día)

día 0 mi 1 Día 1 mi 2

A. 100% R2A un sin degradación sin degradación

B. 100% R2A þ 5 metro g / L triclosan un 0,009 0,004 0,060 0,015

C. 100% R2A þ 500 metro g / L triclosan un 0,022 0,023 0,057 0,022

D. 100% R2A þ 5 mg / L triclosan segundo 0,059 0,008

E. 20% R2A þ 5 mg / L triclosan segundo 0,101

un Cells (A, B, y C) se subcultivaron cuatro veces (cada 2 días) en el medio de crecimiento respectivo con diferentes concentraciones de triclosan que van desde 0, 5, o 500 metro g / L antes utilizado para triclosan (5 mg / L)

experimentos de degradación en medio NMS. las células B (D y E) no se subcultivaron antes de utilizarse para triclosan (5 mg / L) experimentos de degradación en medio NMS.
 wa terresearch 4 6 (2 0 1 2) 4 2 2 6 mi 4 2 3 4 4231

y las concentraciones de triclosán ( Fig. 4 ). Los parámetros cinéticos Monod se calcularon por afectar la biodegradación triclosan. Como se muestra en Fig. 5 , La degradación de triclosan cesó

regresión no lineal fi tting a los datos experimentales (Sigmaplot, SPSS Inc, versión 16.0). las después de la adición de urocatechol 3FL en 23-hr, lo que sugiere que KCY1 cepa podría utilizar

tasas de degradación iniciales se calcularon dividiendo la cantidad de triclosan degradado el una meta- vía de escisión para degradar triclosan. Además, sólo la actividad de la catecol

plazo de 3 h más de la biomasa inicial. No se observó ningún cambio significativo en la biomasa 2,3-dioxigenasa, no 1,2dioxygenase catecol, se detectó en el extracto celular de KCY1 cepa

al final de los 3-H experimentos cinéticos. Themaximumspeci tasa de degradación triclosan fi c ( q crecido en triclosan (actividad de la enzima específica fi ¼ 337 nmol / min / mg proteína). El

metro) y la constante de media velocidad ( K metro, masa de sustrato / volumen) fueron 0,13 resultado global sugiere fuertemente que un meta-

mg-triclosan / mgprotein / día (o 1,7 mg-BOD L / mg proteína / día) y 2,8 mg-triclosan / L (o 3,7

mg-BOD L / L), respectivamente. los K metro valor es mucho mayor que las concentraciones

ambientales de triclosán en las aguas residuales (que van desde 0,61 hasta 5,1 metro g / L) ( Thompsonescisión pathwaywas implicadas en la degradación triclosan. Se necesitan más estudios para

et al., 2005 ; Yu y Chu, 2009 ), Lo que sugiere que la degradación de triclosán por cepa KCY1 aclarar aún más enzimas oxigenasa que son responsables de la degradación de triclosán.

seguiría los primeros cinética de degradación orden en las aguas residuales.

3.9. metabolitos de degradación y posible vía de degradación para

triclosan

Durante la biodegradación triclosan, cinco metabolitos se identificaron fi. Thesemetabolites

aremonohydroxy-triclosan, 6-cloro-3 (2,4-diclorofenoxi)

3.7. capacidad Degradación hacia compuestos que son estructuralmente -4-hydroxycyclohexa-3,5-dieno-1,2-diona, 3-cloro-4- (5,7-dicloro-3-oxo -2,3-dihidrobenzo [1,4]
similares a triclosan dioxin-2-il) -2-oxobut-3-enal,

Puesto que dos BDE (tri- y tetra- BDE) y DE son estructuralmente similares a triclosán y KCY1
cepa puede degradar triclosan, la hipótesis de que strainKCY1coulddegrade estos compuestos
también. Strain KCY1 fue capaz de degradar aproximadamente 78% de DE (1 g / L) dentro de
los 5 días, pero no puede utilizar DE como única fuente de carbono (datos no mostrados).
Aunque anteriormente se informó de que C mi Br y C mi bonos Cl son al menos igualmente viable
para la reacción enzimática ( Dos Santos et al., 1999 ), Cepa KCY1 fue incapaz de degradar
tri-BDE y tetra-BDE. La incapacidad de KCY1 cepa para degradar estos dos BDE podría ser
debido a una combinación de diversos factores,
3,5-dicloro-4,6-dihydroxycyclohexa-3,5-
dieno-1,2-diona, y 2,4-diclorofenol ( Fig. S3 y S4 en SI).
2,4-diclorofenol se confirmó usando el estándar auténtico. Los patrones auténticos de los otros
cuatro metabolitos no están disponibles comercialmente. Estos metabolitos fueron
tentativamente identi edbasedonmass fi spectraand los fragmentationpatterns. Los dos
edmetabolites identificaciones (monohidroxi-triclosán y 2,4dicholophenol) estaban entre los siete
metabolitos triclosán previamente observados durante la degradación triclosán por un
degradador de éter de difenilo, Sphingomonas sp. PH-07 ( Kim et al., 2011 ). Los otros tres
edmetabolites identificaciones no se han reportado antes. Todo el tiempo fi

vemetaboliteswereobservedinthe fi rst8-hrdegradation. Sin embargo, pasado este tiempo (8 h),

sólo se observó 2,4-diclorofenol en muestras de 24-hr y 32 hr, lo que indica la degradación

incluyendo la diferencia de electrones continua de estos metabolitos. Al final de degradationexperiments triclosán, ionswas observó
efectos que resultarían de la diferencia entre las especies de halógeno (Cl vs Br) y la ausencia una liberación estequiométrica de cloruro, lo que sugiere decloración completa de triclosán por
de inbothBDEs grupo hidroxilo que podrían contribuir a la selectividad de KCY1 cepa.
theenzymes.ThereasonwhystrainKCY1candegradeDEbut no tri- y tetra- BDE estaba claro en

este estudio de retirarse.

3.8. Enzimas involucradas en la biodegradación triclosán Aquí hemos propuesto una vía de biodegradación para triclosán por KCY1 cepa ( Fig. 6 ).

Basándose en los resultados de ensayos de inhibición y ensayos de actividad enzimática, la

Se llevó a cabo otra serie de experimentos para examinar si 3-fl urocatechol, una meta- inhibidor degradación triclosan es probable que siga una meta- vía de escisión. Dado que la cepa era
de la escisión, lo haría KCY1

0,004 100 triclosan + 3-fluorocatechol

triclosan
80
q ( mg-triclosan / mg proteína / h)

0,003
3-fluorocatechol añadió
Triclosan (%)

60
0,002

40
0,001

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7
0
concentración Triclosan (mg / L) 0 1 2 3
Día
Fig. 4 mi Degradación cinética de triclosán por KCY1 cepa. Se utilizó la regresión no lineal

para determinar los parámetros cinéticos de degradación Monod. diamantes sólidos son Fig. 5 mi Efectos de uorocatechol 3-fl sobre la degradación de triclosán por KCY1 cepa. Las
los datos experimentales. La línea de trazos muestra un modelo cinético de Monod fi tted. células con la adición de uorocatechol 3-fl a las 23 h (cuadrados cerrados); células sin la

adición de uorocatechol 3FL (diamantes abiertos).

4232 wa terresearch 4 6 (2 0 1 2) 4 2 2 6 mi 4 2 3 4

un 4

un 5

un 4

un 6
un 6

Fig. 6 mi Una posible vía de biodegradación para triclosán por KCY1 cepa.

capaces de degradar DE y que el DE se ha conocido a degradarse a través de una meta- vía de vía, pero una vía de hidroquinona ( Bae et al., 1996 ). La recuperación completa de iones cloruro

escisión ( Kim et al., 2007 ; Pfeifer et al., 1989 ), Hemos propuesto que un ataque inicial de una sugieren que 2,4dichlorophenol y 3,5-dicloro-4,6-dihydroxycyclohexa-3,5diene-1,2-diona se

dioxigenasa regioselectiva en la posición 2,3 de triclosanwhichhas dio como resultado la decloran completamente (la reacción

formación de 6-cloro-3- (2,4-diclorofenoxi) -4hydroxycyclohexa-3,5-dien-1, 2-diona, y

monohydroxytriclosan (detectado) y dihidroxi-triclosan (no detectado) (reacciones un y un 1 en Fig. un 6 en Fig. 6 ). Los metabolitos clorados pueden explicar la disminución retardada de la actividad

6 ). Pfeifer et al. ( Pfeifer et al., 1989 ) Habían informado de que un dioxigenación adicionalmente androgénica, incluso después de la concentración triclosan se redujo a cero el día 2 (ver Fig. 3 ).

con disociación de éter-bond simultánea se produjo durante difenil degradación éter. Por lo

tanto, es posible que el monohidroxi y dihidroxi-triclosanwere más unido por 2,3-dioxigenasa y

después se somete a una disociación de éter para producir 2,4dichlorophenol (mostrado como

reacción un 2 o un 3 o un 4 en Fig. 6 ). Otros dos compuestos intermedios de anillo de fisión pueden 4. conclusiones
ser formados; Sin embargo, no se detectó ninguno de ellos en este estudio. La detección de

3,5-dicloro-4,6-dihydroxycyclohexa-3,5-dieno En este estudio, un agua residual aislar, Sphingopyxis cepa KCY1, mostró una capacidad de

degradar completamente triclosan con una liberación estequiométrica de cloruro. Esta cepa

puede crecer con la glucosa, succinato de sodio, y acetato de sodio pero no triclosan (datanot se

muestra) o catechol.Also, su capacidad triclosandegradation puede ser retenida cuando la

cantidad traza medio contenido crecimiento de triclosan, tan bajo como 5 metro g / L. Dado que

las concentraciones de triclosán ambiente en las aguas residuales suelen oscilar entre

1,2-diona también sugirió otra ruta de degradación que implica la aparición de una disociación

de éter-bond de 6-cloro-3- (2,4dichlorophenoxy) -4-hydroxycyclohexa-3,5-dieno-1,2-diona

(mostrado como reacción un 5 en Fig. 6 ). Curiosamente, la cepa KCY1 puede crecer en fenol, 0,61-5,1 metro g / L y de aguas residuales está lleno de materiales orgánicos fácilmente

pero no en catecol, lo que sugiere que la utilización de fenol por la cepa KCY1 no puede seguir disponibles, la cepa KCY1 puede jugar un papel importante en la biodegradación triclosan en las

un catecol aguas residuales. se detectaron cinco metabolitos de transformación diferentes durante la

biodegradación triclosan.
 wa terresearch 4 6 (2 0 1 2) 4 2 2 6 mi 4 2 3 4
Nuestros resultados también sugieren que el 2,3 y dioxigenasas meta-
escisión son importantes para la degradación de triclosán. Los estudios futuros para investigar
areneeded theabundanceof strainKCY1 en diferentes entornos construidos y naturales, la
significación de su función durante la degradación triclosan en las aguas residuales, y la
posibilidad de bioaumentación con esta cepa para mejorar la biodegradación triclosan en
sistemas de ingeniería.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Dr. Hyungkeun Roh por su ayuda en los experimentos de laboratorio y
el Dr. Gary Saylor, Centro de Biotecnología Ambiental, la Universidad de Tennessee, Knoxville,
Tennessee para proporcionar la S. cerevisiae Blyes y BLYAS ensayos.
Apéndice A. El material suplementario
El material suplementario asociado con este artículo se puede encontrar, intheonlineversion, en doi:
10.1016 / j.watres.2012.05.025 .
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