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CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC
 2) Paracetamol
Resumen—En el laboratorio se determinó una pastilla de
sevedol por cromatografía de líquidos de alta eficiencia, es la
técnica analítica de separación más ampliamente utilizada, la
razón es por su sensibilidad, y su fácil adaptación a la
determinación cuantitativa exacta, se prepararon la fase móvil y
los correspondientes estándares para la lectura de cada uno , una
vez identificada en que tiempo salió cada pico , se dispuso a
elaborar la muestra problema y las alícuotas de 1 hasta 5 ml de
los estándares, cuando se dispuso a leer los estándares estas
lecturas variaron , por la variación del pH ya que la fase móvil se
dejó una semana completa ,por lo que los resultados obtenidos se
hacen con las primeras lecturas que se hicieron cambiando el flujo
de 1 ,1.5 y 2.0 al cambiar el flujo cambia el tiempo de contacto de
la fase móvil y la fase estacionaria
I. INTRODUCTION
A. SEVEDOL
El sevedol está compuesto de Ácido acetilsalicílico 250 mg;
acetaminofén (paracetamol) 250 mg; cafeína 65 mg, su
formulación está dirigida para dolores intensos de cabeza, es
elaborado por Laboratorio Franco Colombiano. Se encontró
que hay una relación estadísticamente considerable a favor de
la combinación Paracetamol-Aspirina y Cafeína (PAC), en la
reducción de síntomas (específicamente el tiempo para sentir
alivio. (Humo , 2009)
1) Cafeína
Figura 1. Estructura cafeína
La cafeína disminuye el sueño por el bloqueo del receptor de
adenosina, todo el tiempo que estamos despiertos las neuronas
de nuestro cerebro están produciendo esta sustancia, que actúa
en diversos procesos bioquímicos y tiene también “efectos
sedantes e inhibitorios sobre la actividad neuronal”. Nuestro
sistema nervioso está monitorizando constantemente los
niveles de adenosina mediante diversos receptores y cuando
alcanzan un cierto punto, lo normal es que comencemos a
sentir sueño o ganas de descansar. (NAUKAS, 2016)
Figura 2. Estructura del paracetamol
El paracetamol actúa principalmente en el cerebro y parece
tener un efecto sobre muchas formas diferentes en que
sentimos dolor. Donde inhibe la producción de sustancias
químicas que causan dolor e inflamación, llamadas
prostaglandinas. Las prostaglandinas se encuentran en todo el
cuerpo, pero paracetamol trabaja principalmente sobre
aquellas en el cerebro. Debido a esto, no solo puede aliviar el
dolor y la fiebre en forma efectiva, sino también tiene pocos
efectos colaterales cuando se toma en las dosis recomendadas.
(panadol, 2016)
3) Ácido acetilsalicílico
Figura 3.estructura de AAS
El ácido acetilsalicílico es un fármaco que actúa impidiendo la
formación de prostaglandinas en el organismo, ya que inhibe a
la enzima ciclooxigenasa. Las prostaglandinas se producen en
respuesta a una lesión, o a ciertas enfermedades, y provocan
inflamación y dolor. El ácido acetilsalicílico reduce la
inflamación, la fiebre y el dolor (plusesmas, 2016)
La siguiente información se basó en el articulo (Toledo
Marante, 2016)
B. La Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
Es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. La HPLC es
una técnica utilizada para separar los componentes de una
mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas
entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna
cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente,
un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo
de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La
muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus

componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a
medida que adelantan por la columna. El grado de retención de
los componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la
fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto en ser eludido de
la columna se denomina tiempo de retención y se considera una
propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión
en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de
los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión
dentro de la misma mejorando la resolución de la
cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el
metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones,
sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan
a la separación de los compuestos.
Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa
puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma
lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía
en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente
separa los componentes de la muestra como una función de la
afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la
afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un
gradiente agua/acetonitrilo, los compuestos más hidrofílicos se
eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los
compuestos más hidrofóbicos se eluirán a concentraciones
elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie
de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma
que permita una buena separación de los compuestos
1) Tipos de HPLC:
a) Cromatografía de fase normal
La cromatografía de fase normal fue el primer tipo de sistema
HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por
separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica
utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se
utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria.
La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la
polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto
polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase
móvil) aumenta el tiempo de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos
funcionales del compuesto de interés, sino también de factores
estéricos, de forma que los isómeros estructurales a menudo se
pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes
más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención
de los compuestos mientras que los disolventes más
hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención
b) Cromatografía de fase reversa
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada.
Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de
cromatografía es la sílica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es
una cadena alquilica tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de
retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
2
mientras que las moléculas de carácter polar se eluyen más
rápidamente.
El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente
apolar a la fase móvil y disminuye con la introducción de
disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa
es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se
basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que
resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente
relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una
fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del
compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente. El efecto
hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la
fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma
que el compuesto se mueve por la columna y se eluye.
El tiempo de retención aumenta con el área de la superficie
hidrofóbica que suele ser proporcional al tamaño del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluirse más
rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie
total de contacto se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de
la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden
afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de
sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión
superficial, y como la entropía de la interfase compuesto-
disolvente está controlada precisamente por la tensión
superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de
retención.
Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la
hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de
métodos utilizan un tampón como el de fosfato de sodio para
controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero
también neutralizan la carga o cualquier resto de sílica de la fase
estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contra
iones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los
tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general
mejoran la separación cromatográfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor
facilidad que las columnas de silica normales. Aun así, muchas
columnas de fase reversa están formadas por silica modificada
con cadenas alquílicas y no se deben utilizar nunca con bases
en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de
silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en medio
acuoso ácido pero no deberían estar expuestas demasiado
tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del
aparato de HPLC
c) Cromatografía de exclusión molecular
La “cromatografía de exclusión molecular”, también conocida
como “cromatografía por filtración en gel”, separa las partículas
de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata
de una cromatografía de baja resolución, de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificación .En esta
cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros
entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los
fines prácticos, las columnas se empaquetan con pequeñas
partículas esferoidales formadas por esos polímeros

entrecruzados. En consecuencia, estas partículas son porosas, y
el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las
demasiado grandes) no podrán penetrar en esos poros, en tanto
que otras (las suficientemente pequeñas) si podrán hacerlo. Los
poros quedan conectados formando una malla o red, lo que
determina una serie de caminos por los que emigran las
moléculas que acceden al interior de esta.
d) Cromatografía de intercambio iónico
En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa
en la atracción electrostática entre los iones en solución y las
cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la
misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta
son retenidos por la columna. Algunos tipos de
intercambiadores iónicos son:
(1) Resinas de poliestireno
(2) Intercambiadores iónicos de celulosa y
dextranos (geles)
(3) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro
controlado.
En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de
iones de carga elevada y radio pequeño. Un incremento en la
concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales
de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en
el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de
intercambio catiónico mientras que una disminución del pH
reduce el tiempo de retención en las cromatografías de
intercambio aniónico. La formación de estos complejos implica
la participación de fuerzas intermoleculares como las
atracciones de van der Waals, atracciones ión-ión, interacciones
dipolo-dipolo, y puentes de hidrógeno entre las partículas de la
muestra y la fase estacionaria
2) Parámetros:
a) Diámetro interno
El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto
crítico que determina la cantidad de muestra que se puede
cargar en la columna y también influye en su sensibilidad. Las
columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan
normalmente en la purificación de compuestos para su
utilización posterior (cromatografía preparativa). En cambio,
las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan
en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por
el aumento de la sensibilidad y la minimización del consumo de
disolventes que conllevan (cromatografía analítica). Las
columnas correspondientes se suelen denominar columnas de
rango analítico y normalmente están asociadas a un detector
UV-VIS ó de índice de refracción. Aparte, existen otros tipos
de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior
a 0.3 mm, que se utilizan principalmente con detectores de
espectrometría de masas.
3
b) Tamaño de las partículas
La mayoría de los HPLC tradicionales se realizan con una fase
estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica.
Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de
5-10 μm de diámetro las más utilizadas. Partículas más
pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación,
pero la presión que se requiere para conseguir una velocidad
lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al
cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir
la medida de las partículas a la mitad aumentaría la resolución
de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en
un factor de ocho.
c) Tamaño de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una
mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor
superficie mientras que los poros de mayor medida
proporcionan una cinética mejor, especialmente para los
compuestos de tamaño más grande.
d) Presión de la bomba
La presión de las bombas es variable según el modelo y
fabricante, pero su rendimiento se mide por su habilidad para
generar un flujo constante y reproducible. La presión puede
lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los
aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para
poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder
utilizar partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2
µm). (Toledo Marante, 2016)
La cromatografía liquida (HPLC) tiene diferentes partes para
su funcionamiento como: dispositivo de suministro de
eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes),
dispositivo de inyección, columna, conducciones, conexiones,
detector y registrador.
El sistema de entrega del solvente tiene 3 funciones básicas;
1-Proporcionar el flujo exacto y constante, 2- Proporcionar la
Composición exacta de la fase móvil y 3-Proporciona la fuerza
necesaria para empujar la fase móvil a través de la columna.
Es muy importante filtrar todos los solventes y las muestras, de
la misma manera es importante usar y guarda la columna,
limpiar la columna para remover sales después de su uso, tapar
la columna cuando no se use. Almacenar la columna en el
solvente apropiado. Tener en cuenta el rango de
funcionamiento del pH de la columna.
La elección de los solventes adecuados, se hace teniendo en
cuenta las polaridades de los compuestos que deseas separar,
Una vez que se tiene el solvente, hay que ver si el HPLC es de
bomba binaria o cuaternaria. En el primer caso, el equipo tiene
capacidad de hacer pasar solo 2 solventes, en el segundo se
pueden usar hasta 4 solventes simultáneamente.
Luego se deben determinar las condiciones de la cromatografía
(flujo, porcentaje de cada solvente, tiempo de la corrida
cromatografía, longitudes de onda, etc.; un método preexistente
y el tratamiento al solvente como filtración, desgasificado, y
pH, es fundamental para ver bajo qué condiciones se obtienen
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los mejores picos. B. Preparación de la muestra

se tomo la tableta
se tomo 1 ml y se
sevedol que peso
aforo a 10 ml
0.737 g

A continuación el siguiente esquema

se masero se llevo a 100 ml

C. Preparación de los estándares

se peso 100mg
se toman las lecturas en
acetaminofen 100mg
el cromatogrofo
AAS y 20 mg de cafeina

se tomo 5 alicotas de 10
ml en las que se tomo 1 ,
se llevo a 100 ml 2 , 3 , 4 , 5 ml y se
aforaron a 10 ml con
HPLC

En el laboratorio cuando se inició las lecturas de los estándares,

y las muestras el software arrojo resultado inesperados lo cual
se detuvo las lecturas y los resultados se hicieron con la primera
preparación que se determinó a que tiempo salió los estándares
en diferentes picos
Para la determinación del contenido de cafeína, acetaminofén
y/o ácido acetilsalicílico en cromatografía liquida (HPLC) se III. RESULTADOS
debe tener en cuenta ciertas condiciones experimentales como:
1. Volumen de inyección 10 μL
Tabla1. Resultados a un flujo de 1 ml / sg
2. Detección a 254 nm
3. Flujo y presión a optimizar flujo: 1 ml/ sg longitud de onda :210
4. Soluciones para preparar fase móvil
1 pico : tiempo inicial 3,787
- Solución A 1000 Ml de una solución acuosa 1%
tiempo final 5,033
ácido acético
- Solución B 1000 Ml de una solución de metanol tiempo de retencion 4,05
grado HPLC al 1 % ácido acético. ( el ácido Area 72260814
acetaminofen
acético se emplea para igualar la fuerza iónica de Altura 4219875
las fases y no define la polaridad de las mismas) Ancho 1,246
(Aznar, 2011) Numero de platos 169,08
2 pico : tiempo inicial 5,033
II. MATERIALES Y METODOS tiempo final 5,675
tiempo de retencion 5,36
A. Preparación de la se móvil y patrones
Area 16541502
cafeina
preparacion fase
filtrar todas las Altura 1348429
acetaminofen 25 mg muestras antes de
movil . 30% ACN y Ancho 0,642
en 50 ml de HPLC colocarlas en el
70% HPLC
cromatogrofo 1115,27
Numero de platos
3 pico : tiempo inicial 5,675
tiempo final 7,089
cafeina 25 mg en 100 toma de lectura de
ajustar ph 2.53
ml de HPLC flujo y area tiempo de retencion 5,83
Area 16657877
AAS
Altura 1270412
Ancho 1,414
preparar con la acido acetil salicilico
solucion anterior la s 10 mg en 100 ml de Numero de platos 271,993
soluciones estandar HPLC
Tabla 2.resultados a un flujo de 1.5 ml/ sg
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descendente prueba numerosos caminos de flujo empleado en

flujo: 1,5 ml/ sg longitud de onda :210
cada uno un tiempo breve.
1 pico : tiempo inicial 2,515 En el laboratorio se separó la practica en dos, una en la
tiempo final 3,363 preparación de la fase móvil y corridas de los estándares y en la
tiempo de retencion 2,693 siguiente semana la preparación de la muestra problema y
Area 48768157 disoluciones de estándares , cuando se fue a analizar los
acetaminofen
Altura 3551104 estándares en el equipo comparando con las primeras lecturas ,
Ancho 0,848
dio resultados inesperados , ya que como se preparó la fase
Numero de platos 161,36
móvil una semana antes dejándolo en un pH 2.53 al pasar tanto
2 pico : tiempo inicial 3,363
tiempo el pH volvió a su estado inicial provocando cambios en
tiempo final 3,761
3,56
la selectividad y capacidad de retención . Los compuestos
tiempo de retencion
Area 12429143 ácidos presentan mayor retención a valores del pH por debajo
cafeina de su pKa y los compuestos básicos presentan una retención
Altura 1244809
Ancho 0,398 más prolongada a valores del pH por encima de su
Numero de platos 1280,13
3 pico : tiempo inicial 3,761
tiempo final 4,738 V. CONCLUSIONES
tiempo de retencion 3,877  La cromatografía agrupa un conjunto importante y
Area 12663103 diverso de métodos, que permite separar componentes
AAS
Altura 1025063 estrechamente relacionados en mezclas complejas
Ancho 0,977
 La eficiencia de la columna cromatografía aumenta
Numero de platos 251,95
cuanto mayor es el número de platos y cuanto menor
Tabla 3. Resultados a un flujo 2.0 ml / sg es la altura de número de platos
flujo: 2 ml/ sg longitud de onda :210  El efecto de los tampones sobre la cromatografía
puede variar, pero en general mejoran la separación
1 pico : tiempo inicial 1,859 cromatográfica
tiempo final 2,515  La posición de los picos en el eje del tiempo puede
tiempo de retencion 2,05 servir para identificar los componentes de la muestra ,
Area 35683880 y las áreas bajo los picos proporcionan una manera
acetaminofen
Altura 3305612 cuantitativa de la cantidad de cada componente
Ancho 0,656  En la práctica se evidencio que el PH del solvente es
Numero de platos 156,25 fundamental para poder tener un mejor pico.
2 pico : tiempo inicial 2,515  El procedimiento que se le debe hacer a la muestra,
tiempo final 2,81 patrón y al HPLC es limpieza, filtrado y desgasificado
tiempo de retencion 2,707 todo esto con el objetivo de que los picos muestre
Area 4833143 información aceptada, para su posterior análisis.
cafeina
Altura 719907
Ancho 0,295
Numero de platos 1347,26 VI. BIBLIOGRAFÍA
3 pico : tiempo inicial 2,81 Humo , H. (28 de noviembre de 2009). la farmacologia .
tiempo final 3,517 Obtenido de
tiempo de retencion 2,92 http://farmaceutaspaz.blogspot.com.co/2009/11/seved
Area 4515650 ol-es-el-medicamento-de-venta.html
AAS NAUKAS. (23 de mayo de 2016). Obtenido de
Altura 796113
Ancho 0,707 http://naukas.com/2010/07/15/lo-que-la-cafeina-le-
272,93
hace-a-tu-cerebro/
Numero de platos
panadol. (23 de mayo de 2016). Obtenido de
http://www.panadol.com/cb/conocimiento-
colectivo/como-funcionan-los-analgesicos.html
IV. ANALISIS DE RESULTADOS plusesmas. (23 de mayo de 2016). Obtenido de
En la tabla 1,2 y 3 podemos observar como varia los resultados http://www.plusesmas.com/salud/medicamentos/aceti
de acuerdo al cambio del flujo, esto es por la magnitud de los lsalicilico_acido_(analgesico)/2666.html
efectos cinéticos sobre la eficiencia de la columna que depende Skoog, D. A., Holler, j., & Nieman, T. (2001). principios de
del tiempo de contacto de la fase móvil y la fase estacionaria, el analisis instrumental. españa: McGRAW- HILL.
cual influenciado por el del caudal de la fase móvil, Ya que si Toledo Marante, F. J. (23 de mayo de 2016). Informe sobre la
la velocidad del flujo es muy pequeña tiene lugar un gran utilización de Cromatografía Líquida de Alta
número de transferencias y cada molécula en su desplazamiento Eficacia (HPLC) en el estudio de los Polisacáridos
Mucilaginosos de Aloe vera (AVMP). Obtenido de
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266794817_Informe_sobre_la_utilizacion_de_Croma
tograia_Liquida_de_Alta_Eficacia_HPLC_en_el_est
udio_de_los_polisacaridos_mucilaginosos_de_Aloe_
vera_AVMP