FITOPATOLOGÍA

Informe laboratorio

“Botrytis cinerea; aislamiento del hongo, purificación, métodos de inoculación y análisis de resultados”

Alfonso Sebastián Flores Quezada

Profesores:

Ximena Besoain C, Dra.

Alejandra Larach, Ing. Agr., M Sc.

Ayudantes:

Laureano Alvarado

Pía González

Katherine Castro

Ignacia Cassis

25 de Abril del 2018, Calle San Francisco S/N, La Palma, Quillota – Chile
 INTRODUCCIÓN
La capacidad patogénica de ciertos organismos, incitan el desarrollo de enfermedades que dan como resultado lesiones en
las estructuras afectadas, como puede ser un fruto. Rivera (1991), establece que a las lesiones generadas por
enfermedades infecciosas, se asocian a ellas una serie de entes vivos, de los cuales no todos son patógenos. Para asociar
un patógeno a lesiones en las estructuras, es de suma importancia el desarrollo de un procedimiento, con el cual se podrá
observar sintomatologías asociadas a la especie afectada en cuestión, aislar, purificar, inocular, reaislamiento, identificar
y diagnosticar al patógeno responsable. Este procedimiento fue el que desarrollo Robert Koch (1843 – 1910), y al cual se
le conoce hoy en día como los postulados de koch.
Fuente: Rivera, G. (1991).Conceptos introductorios a la fitopatología. Editorial universidad estatal a distancia. Costa rica.
En el presente trabajo, se aplicaran los procedimientos pertinentes para la identificación de patógenos en laboratorio. El
patógeno al que se le deberá reconocer las sintomatologías pertinentes será Botrytis cinerea, el cual se obtendrá de frutos
de Solanum lycopersicum (tomate) con las síntomas correspondientes y se realizara la posterior inoculación en frutos de la
misma especie, para su posterior reaislamiento, identificación, diagnóstico y análisis.
AISLAMIENTO DE HONGOS
Aislar el microorganismo es lo primero a lo que se debe proceder para la determinación del agente causal de los daños en
las estructuras de frutos de tomate. El agente causal determinado según las sintomatologías observadas (pudrición, tejidos
de tonos marrones y humedad cerca de los lugares infectados) debe ser separado del tejido vegetal para su posterior
aislamiento según Cifuentes (1990), que además indica que se debe permitir el desarrollo del patógeno en un medio de
cultivo puro antes de proceder a su inoculación.
Fuente: Cifuentes, D. (1990). Prácticas de patología vegetal. Universidad de Murcia. España.
Objetivos específicos:
a) Realizar correctamente el aislamiento del hongo de Botrytis cinerea a partir de frutos de tomate con síntomas
de pudrición, tejidos de tonos marrones y humedad cercana a los lugares infectados.
b) Conseguir correctamente el hongo ya aislado para su posterior inoculación en frutos con un estado de
madurez pintón y maduro.
Objetivos generales:
a) Instruirse de forma correcta en el procedimiento de aislación de hongos fitopatógenos.
Metodología y materiales:
Para comenzar se debe desinfectar el mesón de trabajo con ayuda de
Algodón que se debe empapar con alcohol al 95%. Se debe
encender el mechero correspondiente al mesón de trabajo para
mantener el lugar desinfectado. Una vez realizado la correcta
desinfección de la localización donde se desarrollará el aislamiento,
se debe proceder a tomar el fruto de tomate enfermo, detectar la
zonas lesionadas y con ayuda de un bisturí esterilizado extraer 12
trozos de tejido infectado de aproximadamente 1 cm ² cada uno.
Estos trozos de tejido dañado deben ser desinfectados por 15
segundo en hipoclorito de sodio al 1% y luego lavar el tejido en
agua destilada estéril, para luego ser colocados en un trozo de
Figura 1: Materiales utilizados para el desarrollo del
toalla nova que se debe colocar cerca del mechero previamente aislamiento del hongo de Botrytis cinerea. Fuente:
encendido para acelerar el proceso de secado de los tejidos obtenidos propia, 2018.
del fruto de tomate. Subsiguientemente se deben sembrar los 12 trozos de forma equidistante en dos placas Petri,
distribuyendo 6 trozos en cada placa. Cada placa Petri debe contener un medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA)
que se compone de: 20 gr de agar; 20 gr de puré de papas; 7 gotas de ácido láctico; 22 gr de dextrosa y agua destilada. A
continuación se debe sellar cada placa individualmente para luego identificar con fecha, fruta correspondiente e
integrantes. Para finalizar, incubar en una cámara a 25°C y esperar 1 semana para observar los resultados obtenidos.
Resultado:
Los tejidos vegetales desarrollaron un total de 9 colonias distintas
distribuidas en las dos placas Petri en las cuales se aisló el patógeno,
de las cuales en su mayoría se visualizó una homogeneidad en su
morfología, por lo cual se seleccionó la colonia con las mejores
características para su purificación y posterior inoculación.
Discusión:
La elección de un medio de cultivo que permita el óptimo crecimiento
del patógeno es determinante para el éxito del aislamiento. Cifuentes
(1990) señala que existen medios de cultivo selectivo y no selectivo.
Figura 2: Placas Petri con el aislamiento de colonias
Los medios selectivos impiden el desarrollo de microorganismos no de Botrytis cinerea. Fuente: propia, 2018.
deseados y favorecen el crecimiento del microorganismo que se desea
identificar. Además, nos instruye en que el medio utilizado para el aislamiento (PDA) es el más adecuado para el
desarrollo de la mayoría de los hongos, por lo cual se asegura el éxito del aislamiento al seguir correctamente los pasos
del procedimiento, seleccionar un medio de cultivo apropiado y permitir su desarrollo a una temperatura adecuada (25°C).
Fuente: Cifuentes, D. (1990). Prácticas de patología vegetal. Universidad de Murcia. España.
PURIFICACION Y METODOS DE INOCULACION DEL HONGO Botrytis cinerea
La selección de las colonias que muestren mejores características
morfológicas será esencial para una correcta purificación del patógeno y una Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
posterior inoculación. Es importante que estas colonias cumplan con ciertas
particularidades específicas del tipo de hongo que se desea purificar.
Santos (1998) clasifica a Botrytis cinerea como el estado imperfecto, que se Sub filo: Pezizomycotina
presente con forma conidial (conidióforo), siendo esta especie pleomorfa Clase: Leotiomycetes
(presenta un estado perfecto (teleomorfa) y una forma imperfecta (anamorfa)).
Su característica morfológica más reconocible es la constitución de su micelio
Orden: Helotiales
que se compone de un conjunto de hifas y que durante su multiplicación Familia: Sclerotinicaeae
vegetativa mediante división citoplasmática presentan una forma de moho
pulvurento de coloración grisácea característico de esta patología.
Género: Botryotinia
Fuente: Santos, M. (1998). Manipulación genética del hongo fitopatógeno Especie: Botrytis cinerea
Botrytis cinerea: clonación del gen gdhA. Universidad de Cádiz. España.
Figura 4: Clasificación taxonómica Botrytis
Objetivos específicos:
cinerea. Fuente: Propia, 2018.
a) Aplicar un método apropiado para la purificación del hongo Botrytis cinerea.

b) Reconocer el método por el cual se facilita el ingreso y desarrollo del patógeno en frutos de tomate

c) Observar el ciclo biológico del patógeno, las sintomologias que se presentan y factores que inciden en un
mejor desarrollo de este.

Objetivos generales:

a) Establecer si el proceso de purificación del hongo Botrytis cinerea en un medio de cultivo PDA es adecuado,
conocer los distintos métodos de inoculación en frutos de tomates y determinar sintomatologías de la infección
por el patógeno mencionado.
 Metodología y materiales:

Para comenzar se debe desinfectar el mesón de trabajo con ayuda de Algodón que
se debe empapar con alcohol al 95%. Se debe encender el mechero
correspondiente al mesón de trabajo para mantener el lugar desinfectado. Una vez
realizado estos procedimientos corresponde obtener el inoculo de la placa Petri en
la cual se purifico el patógeno (Botrytis cinerea). Para ello se debe raspar la
superficie de la placa correspondiente e introducir el inoculo raspado en un tubo de
Figura 4: Inoculo purificado de ensayo con agua estéril y agitar para mezclar. A continuación se deben distribuir 4
Botrytis cinerea obtenido del frutos de tomates (2 tomates pintones y 2 tomates maduros) en 2 bandejas en los
aislamiento previamente realizado. cuales se colocaran 2 tomates pintones en una bandeja y en la bandeja restante 2
Fuente: propia, 2018. tomates maduros. Para proseguir a un tomate de cada bandeja se le realizar heridas
superficiales con ayuda de un bisturí previamente esterilizado y se inoculara con ayuda de una jeringa en la superficie
previamente dañadas. Y para finalizar se inoculara con ayuda de una jeringa la superficie de los 2 tomates restantes sin
heridas, se sellara la bandeja con su correspondiente tapa y rotular con nombres, fruta inoculada, método de inoculación,
nombre de patógeno y fecha. La bandeja se debe dejar a temperatura ambiente y se debe evaluar 7 días después de la
inoculación.

Resultado:

El inoculo se desarrolló con una evidente mayor intensidad en los

frutos con heridas. En los frutos sin heridas hubo muy poco
desarrollo, más que nada en el fondo de la bandeja donde se
concentró el inoculo líquido que no pudo ingresar al interior de la
epidermis del fruto debido a la ausencia de daño mecánico. Cabe
destacar que hubo un leve aumento en el desarrollo del patógeno
en el fruto maduro con heridas. Figura 5: Izquierda, Tomate pintón con presencia de
Botrytis; Derecha, tomate maduro con presencia de
Discusión: Botrytis. Fuente: propia, 2018.
El IICA (instituto interamericano de cooperación para la agricultura) señala que la perdidas en frutas y hortalizas durante
la post cosecha se genera entre uno de los tres factores, por daño mecánico como es el caso de las heridas que se
generaron con ayuda de un bisturí en los frutos pintones y maduros, debido a esto y a que la Botrytis es un parasito débil,
ya que solo infecta tejidos de material vegetal en mal estado y el proceso de infección es ayudado en buena proporción por
condiciones fisiológicas, la temperatura y formación de peridermo, los cuales afectan en forma considerable el proceso de
desarrollo de infección y crecimiento del micelio de Botrytis. La presencia de más azucares disponible para el desarrollo
del hongo es más notoria en los tomates maduros, esto, debido evidentemente a su mayor contenido de azucares a
diferencia de los tomates pintones que si bien su contenido de azucares es evidente pero en menor proporción por lo cual
el desarrollo del patógeno se generó a menor escala.

Fuente: ICCA. (1987). Tecnología del manejo de pos cosecha de frutos y hortalizas. OEA. Colombia.

ANALISIS DE RESULTADOS

Para la determinación de la patogenicidad (Botrytis cinerea), se deben cumplir con ciertos postulados que propuso koch
en 1881, esto con el fin de asegurar que existe este patogenicidad.

(1) El microorganismo debe estar siempre
asociado con la enfermedad, y a su vez la
enfermedad no debe aparecer sin que el
microorganismo esté o haya estado presente.
La fruta enferma presenta síntomas claros de Botrytis, esto
debido a la presencia de micelio poco desarrollado polvoriento
de color blanquecino (aun no comenzaba a esporular),
pudrición, tejidos de tonos marrones y humedad cerca de los
lugares infectados.
 (2) El microorganismos debe aislarse en cultivo El hongo aislado presenta micelio de color blanquecino,
puro y debe estudiarse sus caracteres septado y con estructuras conidióforos, que se observan en una
específicos. pura colonia desarrollada en el medio de cultivo PDA.
(3) Cuando el hospedante sano se inocula con el Los frutos de tomate inoculados, presentaron en tu totalidad los
cultivo puro bajo condiciones favorables, mismos síntomas que el fruto del que se aisló el hongo. Se
deben producirse los síntomas de la diferenciaron en el grado de desarrollo (se presentó más
enfermedad desarrollado en los frutos con heridas y en particular en el fruto
con heridas y con un estado maduro). Cabe desatacar que su
mayor grado de desarrollo se produjo debido a las condiciones
favorables que fueron sometidos los frutos inoculados.
(4) El microorganismo debe ser re aislado del La colonia re aislada presento las mismas características
hospedante inoculado y debe mostrar las morfológicas nombradas en el postulado 2. Solo se diferencia
mismas características en cultivo que el que se en que se observó una colonia más homogénea, esto debido al
asilo anteriormente. proceso de purificación al que fue sometido.
Fuente: Gonzales, L.C. (1981). Introducción a la fitopatología. Instituto Interamericano de Cooperación para la
Agricultura. San José, Costa Rica.

CONCLUSIÓN

Ante la aseveración que se presentó con la afirmación de los 4 postulados de koch, estamos en presencia efectiva de una
patología e infección de Botrytis cinerea. Es de suma importancia la correcta identificación de los patógenos que dañan
nuestros cultivos, para poder tomar las decisiones correspondientes a las necesidades que nos exigen los problemas
fitopatógenos que se nos presenta, para prevenir futuras decisiones que pueden incidir en un mal manejo agronómico e
inclusive en la muerte de nuestros cultivos.

BIBLIOGRAFÍA
- Rivera, G. (1991).Conceptos introductorios a la fitopatología. Editorial universidad estatal a distancia. Costa rica.
15p.

- Cifuentes, D. (1990). Prácticas de patología vegetal. Universidad de Murcia. España. 10p; 13p.

- Santos, M. (1998). Manipulación genética del hongo fitopatógeno Botrytis cinerea: clonación del gen gdhA.
Universidad de Cádiz. España. 3p; 4p.

- ICCA. (1987). Tecnología del manejo de pos cosecha de frutos y hortalizas. OEA. Colombia. 137p; 138p.

- Gonzales, L.C. (1981). Introducción a la fitopatología. Instituto Interamericano de Cooperación para la

Agricultura. San José, Costa Rica. 12p.