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Tercera evaluación Ingeniería de Biomoléculas.

2017-‐02
Karen Nattaly Valero González – Universidad Nacional de Colombia-sede Medellin
DESARROLLO DE NUEVO MEDICAMENTO CONTRA LA PROTEASA DEL HIV-1
(VALEROFIR) MEDIANTE EVALUACIÓN EN LA HERRAMIENTA COMPUTACIONAL
DOCKING

INTRODUCCIÓN
La proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-1) es fundamental para
alcanzar la maduración viral, escinde las proteínas estructurales y replicativas que surgen
de los principales genes del VIH. La inhibición de esta proteína des inactiva la actividad
proteolítica, evitando de esta manera la formación de las proteínas virales, lo que genera
partículas virales inmaduras no infecciosas. Por lo dicho anteriormente esta molécula ha
servido como diana terapéutica, generándose desde varios siglos atrás, una cantidad
variada de inhibidores para dicho receptor. Sin embargo, la eficacia de estos fármacos se
ve obstaculizada por la aparición de mutaciones resistentes a los medicamentos, lo que
provoca alteraciones en la unión del fármaco con el sitio de unión de la proteasa. De esta
manera es necesaria la fabricación de nuevos inhibidores para el tratamiento de la
infección. Recientemente las herramientas computacionales han sido empleadas para el
desarrollo de medicamentos, su uso se enfoca en realizar simulaciones basadas en
dinámica molecular para predecir la estructura de posibles medicamentos terapéuticos.
Una de las herramientas computacionales es el docking molecular, el cual se emplea para
predecir la manera predecir la manera a través de la cual un posible fármaco se une a su
molécula diana o receptor.
En el presente trabajo utilizaremos dicha herramienta para generar y evaluar un posible
fármaco dirigido a la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-1).
Se evaluarán tres inhibidores Ritonavir (1hxw), Lopinavir (2q5k) y Nelfinavir (3ekx), los
cuales se analizarán para Validar los parámetros del docking empleado para la fabricación
del nuevo fármaco.

Además del uso de docking, la fabricación del fármaco se realizara en base a los 5
principios de Lipinski , los cuales deben cumplir que la masa Molecular del compuesto
sea menor a 500 una . El c coeficiente de reparto octanol-agua (log P) debe ser inferior a
5. El número de donadores de puentes de hidrogeno debe ser menor a 5,m al igual que el
número aceptores de enlaces de hidrogeno debe ser menor a 10.

DESCRIPCIÓN DE LA CALIBRACIÓN DE LOS PARAMETROS UTILIZADOS EN


DOCKING

Para la validación del fármaco que se diseñará, se realiza la calibración de los parámetros
más relevantes que afectan los resultados del docking en los tres medicamentos análogos
mencionados anteriormente.
En autodocktools existen parámetros preestablecidos, que pueden mantenerse contantes
o pueden ser modificados para generar un proceso predictivo más óptimo.
La decisión de dejar algunos parámetros contantes y otros variables se tomaron por las
recomendaciones de algunos foros de discusión sobre docking y por la evaluación que
se hizo en el docking verificando que para dichos parámetros era mejor dejar los
preestablecidos.
Parámetros constantes:
Ligando:
➢ Residuos flexibles del ligando: Al dejar los enlaces de rotación del ligando
contantes (propios de la proteína) se le confiere a la molécula más grados de
libertad para que se acomode dentro del sitio activo, sin influenciar en las posibles
conformaciones que tome dentro del sitio activo.
Receptor:
➢ Residuos rígidos del receptor: Los residuos del receptor se dejan constantes , para
minimizar todas la posibles conformaciones aleatorias que podrían tomar la unión
del ligando y el receptor si este fuera el caso; además debido a que la estructura
tridimensional de la moléculas escogidas como receptor fueron determinada por
cristalografía de rayos x o resonancia magnética, se puede inferir que el receptor
unido al ligando en estado natural suele presentar los residuos en las posiciones
preestablecidas.
Docking:

➢ Número de generaciones: En el foro de


discusión recomendaban mantener este
número constante (27.000).
➢ Máximo número de evaluaciones: Según el
foro de preguntas frecuentes de autodock,
El número de evaluaciones de energía
necesarias para un acoplamiento dependerá
del número de torsiones en el ligando (y del
receptor, si es flexible).ver tabla 2.

Tabla 1. Parámetros constantes para la estandarización del


docking.

Tabla2.Cantidad de evaluaciones respecto al número de torsiones.

En el caso de los inhibidores utilizados todos presentan más de 10 enlaces rotables


por lo que el número de evaluaciones debería ser mayor a 25000000, sin embargo, se
usó un valor de 2500000, los errores que pueda generar no usar el indicado pueden
ser solventados por el número alto de runs que fueron generados.
➢ Número de generaciones: En el foro de discusión recomendaban mantener este
número constante (27.000).
Máximo número de evaluaciones: Según el foro de preguntas frecuentes de autodock,
El número
➢ Tamaño de la población: Hace referencia al número de evaluaciones de energía que
se calculará para los clústeres generados, se recomienda generar un tamaño de 150 a-
300, en nuestra validación se utilizó un tamaño constante de 150.
Los anteriores parámetros descritos dentro del algoritmo genético son los que más se
tienden a variar, en general los otros parámetros que se presenta en la tabla2 se toman por
defecto los preestablecidos, de la misma manera se tomaran constantes para la validación
de nuestros inhibidores.
➢ Método de simulación: Docking presenta varios algoritmos como el algoritmo
genético, el lamarkiano y el local para la evaluación de la simulación, sin embargo, el
más utilizado y que combina parámetros del genético y el local ese el Lamarkiano,
por lo cual será este establecido para nuestras simulaciones.
Parámetros variables:
Grid:
➢ Grid Box: Se realizaron dos docking
para cada uno de los inhibidores, en
cada uno se estableció el volumen de la
caja box por medio de la molécula
original situada en el sitio activo; Lo
anterior se empleó para ayudarle al
docking restringiéndole el espacio que
no se considera sitio de unión al
receptor.
Imagen1.Establecimiento del volumen del
Grid con la ayuda de la proteína original.

Coordenadas
Inhibidores Dirección en x Dirección en y Dirección en z x y X
Ritoravir 43 39 41 10.976 22.27 3.333
Lopinavir 2Q5K 39 37 35 20.011 30.174 12.924
Nelfinavir 3EKX 38 38 36 20.088 30.725 14.453
Medicamento
Tabla 3. Coordenadas espaciales para la ubicación de la caja box escogidas para la realización de los
docking empleados para cada uno de los inhibidores.
Docking:
Número de runs: indica cuántos modelos se construirán durante el docking. El número
de run es muy importante para validar el modelo, entre mayor cantidad de runs se tiene
más fiabilidad de los resultados. Se recomienda un mínimo de 50 para garantizar la
validez del clúster (a mayor número de run, mayor precisión en el resultado). Por tanto,
este será un parámetro muy importante para la validación de nuestro medicamento. En la
estandarización del modelo (ver página 4) se observa que inicialmente se trabajó para el
inhibidor Ritonavir un número de runs de 20, el cual no proporciono resultados muy
fiables, al cambiar este valor a 50, el ki se acercó al valor convencionalmente verdadero
y el clúster con la conformación más estable adoptó una conformación tridimensional
muy similar.
VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE DOCKING UTILIZANDO TRES
MEDICAMENTOS ANALOGOS

Para la validación del fármaco que se construirá a partir de inhibidores que ya se


han descrito, se utilizaron tres inhibidores: Ritonavir (1hxw), Lopinavir (2q5k) y
Nelfinavir (3ekx), los cuales van dirigido a la proteasa del virus de la inmunodeficiencia
humana tipo I (VIH-1).
Preparación del docking: Cada una de las moléculas (receptor y ligando) fue preparada,
eliminando aguas, y agregándole los hidrógenos polares que pueden participar en la
unión receptor-ligando.
Se realizó un alineamiento de las secuencias de aminoácidos en el sitio activo del receptor,
se observan que por algunas mutaciones la secuencia de ritonavir no coincide totalmente,
por lo que para cada una de las evaluaciones se utilizó el ligando con su respectico
receptor obtenido del pdb.

Imagen2. Alineamiento de los receptores de los tres inhibidores utilizados para la estandarización.

Compuestos Ki Extraídas de pdb ki Extraídos de Artículos


Ki: 0.015 nM
Ritoravir 0,16microM

Lopinavir 2Q5K Ki: 0.005 nM 1.0microM


Ki: 2 nM
Nelfinavir 3EKX Kd: 0.39 nM 1.0microM
Medicamento
Tabla 4. Ki Constantes de inhibición para los 4 inhibidores evaluados.
Ritonavir (1hxw):

Imagen3.Ritonavir 2D Tabla5. Propiedades de Ritonavir

Para este inhibidor se observa que existen


una unión con el receptor por medio de
cuatro enlaces de hidrógenos. Este
inhibidor presenta muchos enlaces rotables
y grupos polares que le permiten interactuar
a través de fuertes atracciones
electrostática, la razón por la cual los
átomos polares e incluso los no polares
juegan un papel muy importante en la unión
ligando -receptor. Como se puede observar
ritonavir presenta muchos átomos (N, O),
donadores y aceptores, lo que lo hace una
molécula muy polar capaz de interactuar
con los grupos polares del sitio activo.
Imagen4.Interacciones entre Ritonavir y la
proteasa del VIH .

Docking evaluando 20 runs

Inicialmente se pensó en realizar para para cada uno de los docking un numero de runs
igual a 20, pero el valor de inhibición del mejor clúster difería de los valores encontrados
en la literatura, por lo que se aumentó el número de runs a 50 .
Imagen5. Docking realizados con un parámetro de 20 runs. A. Parámetros. Clúster. C. sobreposición
cluser1(verde) a ligando natural (azul)

En la evaluación realizada para 20 runs se observa que el clúster de menor energía libre
a sobreponerlo al ligando natural adopta una conformación muy diferente a la esperada,
además la constante de inhibición 86.06Nm, se aleja mucho de las contantes encontradas
en la literatura. (tabla4).

Docking evaluando 50 runs

Imagen6. Docking realizados con un parámetro de 50 runs. A. Parámetros. Clúster. C . sobreposición


cluser1(Violeta) a ligando natural (amarillo)

En la evaluación realizada para 50 runs se observa que existen muchos clúster , los cuales
contiene varios números de conformaciones, por lo que se tomó el de menor energía libre,
al sobreponerlo al ligando natural no adopta una conformación, sin embargo, se observa
que la molécula organiza sus átomos en el espacio muy similar a nuestro inhibidor, lo que
indica que podría generar las mismas interacciones, por el lado de la contante 924Nm, al
igual que la anterior en el docking de 20 runs se aleja mucho de las contantes encontradas
en la literatura. (tabla4).
Lopinavir(2q5k):

Tabla 6. Propiedades Lopinavir.

Imagen7.Lopinavir2D

Al igual que Ritonavir, Lopinavir es una molécula


grande, rompiendo con las 5 relas de lipinski para la
elaboración de farmacos, Al igual que el anterior
inhibidor Lopanivir interacua con la ASP
29generandose puentes de hidrogeno al igual que
presenta una gran cantidad de grupos donadores y
aceptores que le permite interactuar
electroestáticamente con el centro activo de la Imagen8. Interacción de Lopinavir con la
proteasa, pues observando los aminoácidos que proteasa de VIH
interactúan con el inhibidor, la mayoría son
aminoácidos polares.

Imagen9. Docking realizados


con un parámetro de 50 runs. A.Parametros ,B. Clusters. C . sobreposición cluser1(verde) a ligando natural
(azul)

En la evaluación realizada para 50 runs se observa que el clúster de menor energía libre
al sobreponerlo al ligando natural no adopta totalmente la misma conformación, es este
caso se observa cómo se intercambian dos pedazos de la cadena , mientras que las otras
dos coinciden espacialmente, comparando este docking con los realizados anteriormente
la Ki 9.92 Nm se acerca a la constante extraída del pdb Ki: 0.005 nM (tabla4).
Nelfinavir(3ekx):

Imagen10.Nelfinavir 2D

Como se puede observar el inhibidor es Imagen11.Interacciones de Nelfinavir con


un poco más pequeño que los anteriores, la proteasa de VIH.
presenta 12 enlaces rotables. No se
observa la formación de puentes de
hidrogeno, por lo que las interacciones
son netamente electroestáticas entre los N
y O con los aminoácidos como la pro, asp
e Ile.
Tabla 7. Propiedades Nelfinavir.

Imagen12. Docking realizados con un parámetro de 50 runs. A. Parámetros. Clúster. C. sobreposición


cluser1(verde) a ligando natural (Café).

En la evaluación realizada para 50 runs se observa que el clúster de menor energía libre
al sobreponerlo al ligando natural no adopta la misma conformación, la molécula se
posiciona en el mismo espacio, pero se intercambiaron las cadenas, en este caso se
observa cómo se intercambian dos pedazos de la cadena. En este docking la Ki es muy
pequeña 1.75 Pm, difiriendo mucho de las extraídas de pdb Ki: 2 nM
Ki: 0.39 nM y de los artículos 1.0microM.
Teniendo en cuentas las reglas de Lipinski esta molécula, las anteriores moléculas rompen
tres de las 5 reglas, por lo que se buscará del nuevo fármaco sea de menor tamaño, tenga
menos de 10 aceptores de puente de hidrogeno y el coeficiente (CLogP) < 5.

Un buen fármaco debe ter cierta polaridad para poder interaccionar con la molécula
Diana, pero también debe tener una parte lipofílica para poder incorporarse a través de la
membrana de la célula, aunque, se busca una molécula que no tenga un grado de
saturación alto pues las moléculas con un grado alto de saturación tienden a tener menos
puntos de fusión, ser más soluble, y tener menor probabilidad de éxito clínico.

Se mejorará la unión de Nelfinavir a la proteasa, por


tanto el nuevo farmaco se derivara de este. Nelfinavir
es una Molécula pequeña , al observar las interacciones
de la molécula con el receptor, vemos que sólo ocurren
interacciones electrostaticas, pero no se observan
formación de enlaces de puente de
hidrogeno(imagen11) por la posición en la que la
molecula se acomoda dentro del sitio activo, por tanto
se modificó una parte de la cadena que queda continua
a Asp 25 , imitando el modelo de Lopinavir para que se
forme un puente de hidrogeno .(Imagen13).
Imagen13.Interacciones Asp29 receptor
Valerovir: con una parte de la cadena de Lopinavir.

Imagen14. Docking realizados con un parámetro de 50 runs. A. cluser1(verde) Nelfinavir (Azul)


.B Clusters.

En la figura A se tiene la molécula a la cual el docking le calculo el menor número de


energía libre y la cuál tuvo mayor número de conformaciones , Valerovir(molécula verde)
fue alineada con la molécula a partir de la cual fue diseñada (Nelfinavir), se observa que
la posición en el espacio de los átomos es la misma, se acomoda conforme lo hace
Nelfinavir, por lo que los nuevos átomos colocados N y O podrán interactuar con Asp
para formar un enlace de hidrogeno y dar más estabilidad .
En cuanto al Ki de Valerovir ki = 9.86Pm es parecido menor al de
Nelfinavir 1.75 pM , por lo que podría ser un buen inhibidor , si
las calibraciones estuvieran perfectas, y se pudiera dar fe del
docking realizado.

Imagen15.Caracteristicas clúster
de Valerovir.

Conclusión:
➢ El Nuevo compuesto generó una constante de inhibición buena y se organiza dentro de
la molécula como se esperaría que lo hiciera, sin embargo los docking para validar el del
fármaco , no fueron perfectos, las constantes de inhibición generadas eran mucho
menor a las reportadas en la literatura y las posiciones de algunas partes de las cadena
de las moléculas ,no coinciden con las esperadas, por lo que realmente no se puede
validar bien el modelo, se tendrá que ser mas estricto con los parámetros escogidos,
quizás aumentar el número de generaciones y evaluaciones , para cada una de las
validaciones para ver si se parecen más los ki con los reportados.

Elokely, K. M., & Doerksen, R. J. (2013). Docking Challenge: Protein Sampling and Molecular
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