Tema 2. Técnicas Espectrométricas

Curso 2012-13. Ciclo Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico.
Tema 2. Técnicas espectrométricas
TEMA 2. TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS:
1. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
2. FLUORIMETRÍA
3. QUIMIOLUMINISCENCIA
4. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
5. FOTOMETRIA DE LLAMA
6. NEFELOMETRIA Y TURBIDIMETRIA
7. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
8. REFRACTOMETRÍA
Las técnicas espectrométricas se basan en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la

materia. Las principales técnicas espectrométricas empleadas en la actualidad en los laboratorios de
bioquímica clínica son:
La espectrometría de absorción molecular en el ultravioleta y en el visible
La fluorimetría
La turbidimetría
La nefelometría
La luminometría
La espectrometría de absorción atómica
La espectrometría de emisión atómica
Naturaleza de la radiación electromagnética

La radiación electromagnética es una forma de energía radiante; se representa como un campo
eléctrico y otro magnético situados en fase y con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto un campo
respecto al otro y, a su vez, con la dirección de propagación; se propaga por lo tanto en forma de ondas.
En este fenómeno ondulatorio se definen:
Longitud de onda (λ): se define como la distancia entre 2 máximos de un ciclo completo del movimiento
ondulatorio; esta distancia se expresa, según el Sistema Internacional de Unidades (SI) en nanómetros (nm
,10-9 m); otras unidades ya obsoletas son: ángstrom (A) y milimicra (mµ); la relación entre estas medidas es:
1nm = 1mµ = 10 A = 10-9 m.

1
Frecuencia (v): es el número de oscilaciones (ciclo) que una partícula realiza en una unidad de tiempo,
generalmente un segundo (ciclos por segundo); es la inversa de la longitud de onda.
v = c/λ siendo c = velocidad de la luz

Pero es que además la luz está formada por fotones, o paquetes discontinuos de energía; la energía
de un fotón depende de su frecuencia y de su longitud de onda:
E = h.v siendo v = frecuencia y h = constante de Planck

E = h. c/λ

Por lo tanto la relación entre la longitud de onda y la energía de una radiación electromagnética es
inversa: cuanto mayor es la longitud de onda, menor es la energía; por ejemplo, la radiación UV a
200 nm posee mayor energía que la radiación infrarroja a 750.
La relación de la longitud de onda con la frecuencia y con la energía de radiación es inversa, por lo que las
radiaciones más energéticas, las más penetrantes, son a su vez las de mayor frecuencia y menor
longitud de onda

Se denomina espectro electromagnético al conjunto de radiaciones electromagnéticas, y se ha dividido en
varias regiones o bandas espectrales caracterizadas por determinados parámetros de longitud de onda,
frecuencia etc.
Espectro electromagnético

RADIACIONES EM Longitud de onda (nm)

Rayos gamma 10-5 -10-3
Rayos X 10-3 -101
Ultravioleta 200-380
Luz Visible 380-780
Infrarrojo 780-50.000
Microondas 108 -109
Frecuencias de Radio >109
El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y los 750 aproximadamente,
pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitación, y permiten la medida de
radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores (UV).
2
La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones de distinta
longitud de onda que al ojo humano se reconoce como “blanca”, es decir, es una radiación policromática.
En la región visible, la luz se descompone en colores y sus complementarios:
Descomposición del espectro visible y ultravioleta en colores y sus complementarios

Longitud de onda (nm) Nombre de la región Color absorbido Color complementario
o de la solución

180-220 UV corto No visible --
220-340 UV No visible --
380-430 Visible Violeta Amarillo verdoso
430-495 Visible Azul Amarillo
495-555 Visible Verde Rojo
555-600 Visible Amarillo Azul
600-650 Visible Naranja Azul verdoso
650-780 Visible Rojo Verde azulado
El color que presentan los distintos objetos o soluciones se debe a la interacción de la radiación
policromática (luz blanca) con ellos. Un objeto o solución está formada por partículas que absorben
radiaciones de determinada longitud de onda y no absorben otras, que son las que pueden verse,
denominándose color complementario. Por ejemplo, si una solución absorbe luz entre 430 y 480 nm (azul),
tendrá un color amarillo, por tanto, el amarillo es el color complementario del azul.
En consecuencia, una solución que se observa de un color determinado al ojo humano, deberá ser
iluminada para las mediciones fotométricas con un haz de luz del color que se absorbe; por ejemplo una
solución de color rojo se irradia con luz de aproximadamente 500 nm.
Fenómenos de interacción entre luz y materia

Cuando se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, entre otros, fenómenos de
absorción o emisión energética.
1.- Proceso de absorción:

Cuando una partícula que se encuentra en “estado de reposo” o “estado fundamental”, interacciona con un
haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina “estado excitado”.
En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula (tipo de
enlaces, etc) y de la energía (λ) de la luz que interacciona.
3
La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental, desprendiendo

la energía absorbida en forma de calor.
A0 + h . v A* A0 + calor
Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental

A* = absorbente en estado excitado
h.v = energía del fotón absorbido (h = cte de Planck y v = frecuencia de la radiación)
Cada especie absorbente (cromógeno) tiene lo que se llama un “espectro de absorción característico”, Este
espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que representa una
solución de la especie, en condiciones definidas de trabajo. Al gráfico que resulta de representar en un eje de
coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a la λ (abscisas), es a lo que llamamos espectro de absorción

Los espectros de absorción son de utilidad para:
Seleccionar la λ más adecuada para una medida cuantitativa (λ a la que la absorción es máxima).
Fines de identificación cualitativa.
La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución de una especie absorbente, es el fundamento en
que se basan las técnicas de espectrofotometría de absorción.
2.- Proceso de emisión:

Algunos compuestos tienen la propiedad, tras ser excitados, de retornar a su estado fundamental,
produciendo una emisión de energía radiante.
La luz emitida se puede medir, y ello constituye el principio de algunas técnicas, como la fotometría de llama
(emisión atómica) o la Fluorescencia.
A0 + h.v1 --------> A* -------> A0 + h.v2
Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental

A* = absorbente en estado excitado
h.v1 = energía de excitación
h.v2 = energía de emisión.
Explicación:

En los átomos, los electrones ocupan alrededor del núcleo determinados niveles energéticos, que
definen orbitales característicos para cada tipo de átomo. Un átomo en estas condiciones, se encuentra en su
“estado fundamental” o de menor energía, su configuración electrónica es estable y tiende a mantenerla o a
recuperarla si esta ha sido alterada.
En el caso de la radiación correspondiente a la banda espectral del UV y/o del visible, la radiación
absorbida tiene la energía suficiente como para producir el desplazamiento de los electrones de enlace a
posiciones más energéticas y por tanto, menos estables, denominados “estados excitados”. Los átomos
tienden a estar en el estado de mayor estabilidad que coincide con el estado fundamental o menos
energético, por lo que los electrones al volver total o parcialmente a este estado en el proceso denominado
“relajación”, la energía que fue previamente absorbida, es reemitida en forma de radiación electromagnética,
cuya λ está íntimamente ligada a la cantidad de energía incidente.
Este fenómeno es la base de técnicas espectroscópicas de análisis como la absorción, la absorción
atómica, la emisión, la fotometría de llama (emisión atómica), la fotoluminiscencia (fluorescencia y
fosforescencia), la nefelometría, la turbidimetría, etc.
4
ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR:

La espectrofotometría de absorción consiste en la medición de la radiación que llega a un detector
tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente.
En química clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y las medidas se hacen
ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800 nm.
Es aplicable tanto para análisis cualitativos como cuantitativos.
Leyes de absorción

Cuando un haz de luz de intensidad I0 incide
sobre una cubeta cuadrada que contiene una solución
coloreada que absorbe luz a una determinada λ, se produce en la solución un proceso de absorción, y el haz
de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta y considerar así sólo la absorción del
compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una “solución de referencia” o “blanco”, que
contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura, menos el compuesto a medir. Todas las
medidas que se hagan a continuación serán referidas a esta medida inicial.
Se define transmitancia a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:
T = Is/Io

Y el porcentaje de transmitancia:
%T = Is/Io . 100

En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de absorbancia (A), ya que la
relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la
relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional.
A = - log Is/Io = - log T = log 1/T = log 100/%T = log 100-logT  A = 2 –log %T

Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas la relación entre la absorbancia y
concentración y el %T y la concentración observamos que al aumentar la concentración del compuesto
absorbente en solución, más luz es absorbida y menos transmitida.
En los aparatos que se usan hoy en día, las lecturas de %T son transformadas en absorbancias y
presentadas así al operador, pero no hay que olvidar que la absorbancia no es en sí misma medible, sino que
se obtiene por un cálculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotométrico.
La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta solución
absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorción.
La Ley de Beer indica que la concentración de la sustancia es directamente proporcional a la
cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
La fórmula matemática establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras 2
variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través de la
solución. Según esta ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a
la longitud del paso de luz:
A = a.b.c
Siendo: A = absorbancia
5
a = coeficiente de absorción (es una cte relacionada con la naturaleza del soluto)
b = longitud del paso de la luz en centímetros (en la cubeta); su valor está estandarizado
en 1 cm para todos los espectrofotómetros
c = concentración del absorbente
El coeficiente de absorción (a) se denomina coeficiente de extinción molar, representado con el

símbolo ε cuando las unidades de b son centímetros y las de c son moles/litro; es constante para un
compuesto dado cuando se fijan condiciones de λ, pH, solvente, temperatura, y otros factores; sus unidades
son 1 / mol . cm.
En la práctica el significado del coeficiente de extinción molar es el siguiente: cuanto mayor sea ε en
una sustancia, mayor será la absorbancia de ese compuesto y por tanto, mayor será la sensibilidad del
método que lo emplea.
Cálculo de concentraciones

La Ley de Beer tiene una aplicación práctica para averiguar la concentración de una sustancia de interés
en una solución basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración; así podemos conocer la
concentración de una sustancia de 2 maneras:
Por comparación con una solución conocida

Por la curva de calibración
Por comparación con una solución conocida:

Si tenemos 2 soluciones, P (problema) y S (estándar de concentración conocida), podemos establecer la
siguiente relación matemática entre ellas:
AS/ Ap = Cs/ Cp Cp = Cs . Ap / As

Siendo: As = absorbancia de la solución estándar
Ap = “ “ “ “ problema
Cs = concentración de la solución estándar
Cp = “ “ “ “ problema
Conocemos el valor de Cs y por la analítica los valores de As y Ap ; con estos datos calculamos el
cociente Cs/As estableciendo así el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las
absorbancias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las
concentraciones de estas soluciones problema.
Cp = Cs / As . Ap = F . Ap siendo F = factor de calibración
b) Curva de calibración:

Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a
concentración (abscisas).
El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de
concentraciones conocidas, determinar sus absorbancias y a continuación construir la curva de calibración
(que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a absorbancias gráficamente; en la
construcción de la curva se emplean un mínimo de 3 puntos y a continuación se traza una línea recta que se
aproxime a ellos lo más posible.
Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por interpolación de las
absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración.
6
Estas 2 formas de trabajo sólo son válidas si el cromógeno obedece la Ley de Beer, y tanto las soluciones
estándar como los problemas son leídas en idénticas condiciones.
En toda determinación fotométrica se debe conocer la linealidad, que es el intervalo de concentraciones
del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia, es decir,
se cumple la Ley de Beer. Cuando la concentración del cromógeno en la solución sobrepasa los límites de
linealidad, la Ley de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de ese
punto de concentración; la lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad, se traduce en una
concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta situación, hay que diluir la muestra para que su
concentración entre dentro de los límites de linealidad.
Desviaciones de la Ley de Beer

Son desviaciones producidas en la linealidad de la relación entre concentración y absorbancias; la recta
se curva antes de su límite de linealidad. Pueden causarlas diversos factores:
Se miden concentraciones muy elevadas de cromógeno
La radiación incidente no es monocromática
La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto
La luz es transmitida por otros mecanismos (luz errática, o luz monocromática que llega al detector)
Los lados de la cubeta no son paralelos
Si hay interferentes (otros cromógenos absorben también a esa longitud de onda)
Si existe fenómeno de fluorescencia
Componentes de un espectrofotómetro

Los principales componentes son:
Fuente de radiación
Rendijas de entrada y de salida
Sistema selector de la longitud de onda
Compartimento para la muestra: cubeta
Detector de la energía radiante
Sistema de recogida y transformación de datos
Fuente de radiación:

Es el origen de la emisión energética en forma de radiación electromagnética, y proporciona la
energía radiante que es absorbida por el compuesto que se investiga. Sus características ideales son: 1) que
la radiación emitida sea de gran potencia; 2) que se estable y 3) que emita radiaciones de longitudes de onda
de un intervalo del espectro amplio y sin discontinuidades.
Pueden clasificarse, según la naturaleza del espectro que emiten, en continuas y discontinuas.
a) Fuentes continuas (de radiación continua): se conocen también como lámparas; existen distintas
lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y UV:
Lámparas de filamento de tungsteno: se utilizan habitualmente como fuentes de radiación para longitudes
7
de onda del espectro visible y UV próximo; son fuente de un espectro continuo de energía radiante entre
360-950.
Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duración, producen más luz a longitudes
de onda cortas y emiten energía radiante de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno; para
mediciones en la región visible y UV próximo.
Lámparas de hidrógeno y deuterio: producen un espectro continuo en la región UV (220 a 360); se
emplean para medidas en esta región del espectro, siendo más usada la de deuterio, de mayor intensidad
que la de hidrógeno.
Lámparas de arco de xenón: para λ entre 200 y 10.000 nm.
b) Fuentes discontinuas (de radiación discontinua): sólo emiten radiaciones de determinadas λ aisladas, por
lo que se pueden considerar monocromáticas para cada una de ellas; son útiles para la calibración de la λ
pero resultan poco prácticas para hacer medidas de absorbancia (a no ser que se pretenda emplear una λ
fija); no son utilizadas en muchos espectrofotómetros: Lámparas de vapores de mercurio: emiten un espectro
discontinuo o “espectro de líneas” (313, 365, 405, 436 y 546 nm); se emplean en espectrofotómetros para
cromatografía HPLC.
2. Rendijas:

Son de 2 tipos: de entrada y de salida
a) Rendija de entrada: su función es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa penetre en el
sistema de selección de la longitud de onda.
b) Rendija de salida: su función es impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que generaría
desviaciones a la Ley de Beer.
3. Sistemas de selección de longitud de onda:

Su finalidad es seleccionar la λ o intervalos de λ deseados para el análisis (ya que las lámparas no
emiten luz monocromática, es decir radiación de una única λ)
Se clasifican en 2 tipos: filtros y monocromadores
a) Filtros: es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una λ y
absorbe todas las demás; permiten el paso de intervalos, relativamente amplios y característicos, de
longitudes de onda.
Básicamente existen 2 tipos: de absorción y de interferencia
Filtros de absorción: según el tipo de intervalo de λ que seleccionen, se pueden distinguir:
Filtros de corte: son filtros de absorción que impiden el paso de radiaciones de λ superior o inferior a un

determinado valor.
Filtros de banda: son filtros de absorción que permiten el paso de radiaciones de λ entre 2 valores
determinados.
Se usan tanto para eliminar radiaciones no deseadas como para conseguir el intervalo deseado de λ.
Suelen estar hechos de vidrio homogéneo, generalmente coloreado o de otros materiales teñidos
Los filtros de vidrio están compuestos por una o más capas de vidrio coloreado
Los filtros Wratten están compuestos por una capada gelatina coloreada entre dos láminas de vidrio
transparente.
La anchura de banda que ofrecen es relativamente grande (entre 35 y 50 nm) y además se calientan
mucho, pero son baratos.
8
Filtros de interferencia: están constituidos por una capa de fluoruro de magnesio o calcio entre 2
capas semitransparentes de plata; la radiación que incide sobre el filtro sufre una serie de reflexiones
entre las capas de plata y se producen interferencias tanto positivas como negativas (sus
intensidades se duplican o se anulan entre sí), de modo que sólo consiguen atravesar el filtro
aquellas radiaciones que tienen unas determinadas longitudes de onda. La selección depende del
grosor de la capa de fluoruro.
Los filtros de interferencia separan intervalos más estrechos de λ que los de vidrio.
b) Monocromadores: los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas
que los filtros y, tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una amplia zona del
espectro. Son dispositivos que constan de:
Una rendija de entrada de radiaciones policromáticas

Una lente colimadora para producir haces de radiación paralela
Un sistema dispersor de las radiaciones
Una rendija de salida que permite seleccionar la λ de las radiaciones
A veces se coloca, delante de la rendija de entrada, un filtro que hace una primera selección de la radiación.
El sistema dispersor puede ser: un prisma o redes de difracción (en la actualidad utilizada en la mayoría de
los espectrofotómetros):
Prismas: son fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro material que
permita la transmisión de la luz.
La dispersión de la radiación que los atraviesa se debe a la refracción y ofrecen una buena
separación entre las λ dispersadas; sin embargo, tienen el inconveniente de que desvían más las
radiaciones de λ más corta y por tanto la dispersión no es lineal (esto supone que si se quiere trabajar
con la misma anchura de banda efectiva hay que corregir la anchura de la rendija de salida para cada
zona del espectro; para ello se debe conocer la curva de dispersión, facilitada por el fabricante del
aparato).
Si se trabaja en la zona del visible y en la del UV próximo, se pueden utilizar prismas de vidrio pero si
se trabaja en el UV lejano, han de ser de cuarzo.
Redes de difracción: consisten en un gran número de líneas (hendiduras) paralelas, situadas a distancias

iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cuando incide la luz blanca sobre ella,
cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; se producen interferencias positivas y negativas de
las diferentes λ contenidas en la radiación policromática y el resultado es que sólo se propagan las
radiaciones de determinadas λ.
La mayoría de los monocromadores en vez de transmitir luz de una sola longitud de onda dejan pasar
todo un rango de longitudes de onda. Este se identifica como ancho de banda y mide la pureza espectral
del instrumento o grado de mono-cromaticidad. Mientras más angosto sea el ancho de banda más pura
es la luz.
Ancho de banda: Es el rango de longitudes de onda que un monocromador puede aislar entre dos puntos de
un campo espectral, en el cual la Transmitancia equivale a la mitad de la Transmitancia máxima.
Longitud de onda nominal de un haz de luz: es la λ en la que se halla el máximo de intensidad de luz. Se

emplea para definir los filtros.
El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En los monocromadores, la rendija de
entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difracción sobre el cual será dispersada y la rendija de
salida determina el ancho de banda de la luz que será seleccionada del espectro de dispersión;
aumentando el ancho de la rendija de salida, el ancho de la banda de la luz emergente se hace más
9
amplio, con lo cual aumenta la intensidad de la energía, pero disminuye la pureza espectral.
4. Compartimento para la muestra:
El receptáculo en el que se deposita la muestra se suele denominar cubeta; su función es, por tanto,
mantener la solución en el instrumento mientras se realiza la medición de la absorción; necesariamente deben
ser transparentes a la radiación utilizada.
Forma: pueden ser

Cilíndricas
Cuadradas
Rectangulares: las más empleadas; las 2 caras que van a ser atravesadas por la radiación, están pulidas y
son perfectamente transparentes.
Tamaño: habitualmente tienen 1 cm de paso de luz

Rectangulares: existen 3 versiones que tienen idénticas dimensiones externas pero varían
las internas:
Normal
Semimicro
Micro
Material: puede ser
Vidrio (borosilicato): la mayoría ; para λ de 320-950 nm
Plástico: para λ de 320-950 nm
Cuarzo: para λ inferiores a 320 nm, porque el vidrio absorbe la luz UV; también se podrían emplear para λ
superiores pero su costo lo desaconseja
En algunos casos existen dispositivos termostatizadores que mantienen las cubetas a la

temperatura adecuada para la medición (generalmente con una corriente de agua a la temperatura deseada,
que fluye a través de una camisa que envuelve el alojamiento de la muestra); importante cuando se
determinan actividades enzimáticas o se emplean enzimas para realizar las mediciones.
Hay cubetas de flujo continuo que poseen un orificio de entrada y otro de salida que permita el paso
continuado de la disolución mientas se realiza la medida.
Es importante que las cubetas se mantengan limpias y sin arañazos para evita errores en la medida;
no se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las que haya de incidir el rayo de luz; la colocación
incorrecta de las cubetas en el fotómetro también es un error muy común; cuando se utilizan cubetas
redondas, éstas deberían marcarse cerca de su parte superior y colocarse siempre en la misma posición.
5. Sistema de detección de radiaciones:

Son sistemas que amplifican y transforman la energía radiante no absorbida por la muestra en
energía eléctrica y la convierten en una señal eléctrica y cuantificable.
Los tipos de detectores que se emplean en la actualidad difieren ante todo en las propiedades físicas que
utilizan para la detección; pueden ser: dispositivos fotoemisores y diodos
Dispositivos fotoemisores: pueden ser

Células fotovoltaicas
Fototubos
Fotomultiplicadores
Células fotovoltaicas: consisten en una lámina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material
10
semiconductor, como selenio (u óxido cuproso); ésta capa está recubierta por una capa de metal transparente
(que sirve como electrodo colector); al iluminarse a través del electrodo transparente, se produce un flujo de
electrones que puede ser medido con un amperímetro.
Sólo se usan en espectrómetros de filtro baratos.
Fototubos: suelen contener un fotocátodo cóncavo de níquel recubierto de plata que absorbe
bien los fotones; los electrones que se desprenden de él son atraídos por el ánodo gracias al
establecimiento de una diferencia de potencial de unos 90 V.
Fotomultiplicadores: son dispositivos que amplifican la corriente original; su funcionamiento es
similar al del fototubo, pero el fotomultiplicador consta de un conjunto de electrodos llamados
dínodos entre los que se establecen diferencias de potencial: cada dínodo es unos 90 V más
positivo que el precedente; esto permite acelerar los electrones que han sido extraídos del
fotocátodo.
Un fotón provoca la extracción de un electrón pero éste al ser acelerado, es capaz de chocar con
varios electrones (de 2 a 5) del primer dínodo y extraerlos; a su vez, cada uno de estos puede
extraer a otros tantos del segundo dínodo y así sucesivamente (de 10 a 15 veces); al final el
ánodo puede llegar a recibir unos 107 electrones por cada fotón que impacta en el fotocátodo.
El tubo fotomultiplicador tiene una gran detectabilidad y su respuesta es muy rápida (10-9 s).

Diodos: son dispositivos semiconductores de distintos tipos; el más habitual es el fotodiodo de silicio.
Fotodiodo de silicio: consta de 3 capas, una de silicio intrínseco (es decir, no recubierto) entre otras 2 de
tipos p y n (de ahí que también se denominen diodos p-i-n); además están flanqueadas por 2 electrodos
metálicos que permiten la conexión eléctrica. Cuando los fotones inciden sobre la capa p, sus electrones son
desplazados y dejan huecos capaces de aceptar electrones procedentes del electrodo adyacente. Por su
parte, los electrones desplazados atraviesan las otras capas de silicio y se dirigen al otro electrodo, de forma
que se origina una corriente electrónica proporcional a la potencia de la radiación.
El fotodiodo de silicio no se comporta igual a todas las λ.
6. Sistemas de presentación de datos:

La energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de datos.
Hoy en día todos los aparatos incorporan ya la lectura digital (la señal eléctrica analógica se
transforma mediante un microprocesador en señal digital), la cual unida también a la introducción de
microprocesadores, permite cálculos directos de concentración con arreglo a factores de calibración prefijados
y lectura contra estándares, o curvas de calibración en memoria.
Tipos de aparatos

Según el sistema selector de longitud de onda, se clasifican en 2 tipos:
Fotómetros: emplean filtros
Espectrofotómetros: emplean monocromadores
Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en:

Espectrofotómetros de haz simple: se denominan así porque no hay más que un haz de radiación desde la
fuente hasta el detector. Sus componentes son los que se han estudiado en el apartado anterior.
Espectrofotómetros de doble haz: tienen los mismos componentes que el de haz único, además de un haz
de referencia y uno de muestra para corregir las variaciones de intensidad de la fuente luminosa. En este tipo
de espectrofotómetros, una vez que la radiación ha atravesado el monocromador, un dispositivo con
capacidad reflectante (chopper) le obliga a seguir alternativamente dos direcciones. Una de ellas atraviesa la
cubeta en que se deposita el blanco y la otra atraviesa la cubeta en que está la muestra. Ambas cubetas
deben de ser idénticas. A continuación, las radiaciones separadas o bien llegan a detectores separados (en el
11
espacio) o bien son reorientados mediante espejos para que lleguen al mismo detector (en el tiempo), que
medirá alternativamente Po y Pt.
Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: todos los componentes están duplicados menos la

lámpara; dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los diferentes componentes separados en el
espacio.
El dispositivo de lectura compara la señal que produce cada detector y calcula la proporción entre las dos
señales, que constituye una indicación del voltaje de salida.
Espectrofotómetro de doble haz en el tiempo: emplean un “chopper”, consistente en un interruptor rotativo
del haz luminoso (es una rueda giratoria con secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuación
de la rendija de salida; un sistema de espejos dirige la porción de luz reflejada por el chopper a través de la
cubeta de referencia y de ahí al detector común; el detector ve alternativamente el haz de luz procedente de
la muestra y el de referencia.
Los espectrofotómetros de doble haz son más útiles cuando se requieren análisis espectrales porque
automáticamente restan la transmisión luminosa a través de la solución de referencia a distintas longitudes de
onda.
Aspectos prácticos

Empleo de blancos: antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un “blanco”: esta maniobra
eliminará las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta o el solvente del
cromógeno.
Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se establecerá una
intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales de trabajo.
La absorbancia del blanco se restará de las absorbancias que se midan para los problemas.
Hay distintos tipos de blancos:
Blanco de suero: la lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporción en un solvente inerte,
con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que pueda producir la propia muestra (por ejemplo
hemólisis, lipemia, bilirrubinemia, color de la orina, etc), antes de que se produzca la reacción.
Blanco del reactivo: la lectura inicial se hace con el reactivo, antes de adicionarle la muestra. Elimina las
posibles interferencias que pueda producir el reactivo.
Blanco muestra: Cuando el espécimen biológico que se analiza puede interferir la señal que se detecta.
Blanco agua destilada.
Blanco aire

Curvas de calibración: se construyen ensayando soluciones de distintas concentraciones conocidas (patrón
o estándar) y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una determinada λ.
Cuando se trabaje con una curva de calibración, cualquier cambio en el aparato, o en los reactivos con que se
fabricó, requieren la construcción de una nueva curva.
Empleo de factores de calibración: otra forma de trabajo es emplear factores de calibración; se hallan

comparando concentraciones y absorbancias de estándar y problema.
A estándar = a . b . c estándar estándar

A estándar
C
A problema = a . b . c problema A problema C problema

C problema = A problema . C estándar
A estándar

C estándar/A estándar es constante, es el factor de calibración
12
Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc) requiere el
cálculo de un nuevo factor de calibración.
Tipos de análisis espectrofotométricos

En el laboratorio de análisis clínicos al unirse la muestra biológica con los reactivos comerciales, se
desencadenan una serie de reacciones que dan lugar a un cambio apreciable y mesurable por el equipo
instrumental gracias al cual, se puede obtener información sobre la presencia, ausencia, concentración,
cantidad y/o actividad del analito.
A+B+C D + E
Siendo A = muestra
B y C = reactivos comerciales
Los tipos de análisis se pueden clasificar:

Según el desarrollo de la reacción:
A punto final
Cinéticos
Según algunas características de la reacción:
Colorimétricos
Enzimáticos

1. Según el desarrollo de la reacción:

A punto final:
La reacción entre la muestra y los reactivos se produce hasta el final, se agota A, B y/o C y se
forma D y/o E. En las determinaciones con reactivos comerciales suele haber exceso de reactivos
para asegurar que el parámetro reacciona en su totalidad en las condiciones de Tª, pH, tº, etc,
indicadas en sus protocolos.
La concentración del parámetro es directamente proporcional a la concentración de alguno de
los productos formados en la reacción bien
de forma directa, por variación en la estructura del parámetro al unirse a algún reactivo
de forma indirecta, al aparecer o desaparecer algún compuesto mesurable, por la existencia del parámetro en
la muestra biológica.
Generalmente en las condiciones establecidas por el protocolo de la casa comercial, se cumple la
Ley de Lambert-Beer; en caso de no cumplirse habrá que realizar la dilución de la muestra y el
factor de corrección para que se encuentre dentro del rango lineal.
A = ε . b . c
Para la determinación de la concentración problema (la del parámetro) se suele emplear una
disolución acuosa patrón del mismo parámetro, de concentración conocida e indicada por la
casa comercial; aplicando la Ley de Lambert-Beer para la solución patrón y para la muestra
problema:
Cproblema = Cpatrón . A problema

A patrón
Cinéticos:
Se mide la velocidad de la reacción antes de que esta concluya; es muy importante
mantener las condiciones de la reacción descritas en los protocolos comerciales sobre temperatura,
tiempo de medida, etc para garantizar la fiabilidad de los resultados.
En estas determinaciones analíticas, la absorbancia no es directamente proporcional a la
concentración del parámetro biológico en la muestra problema. Es la variación de la absorbancia
13
durante una unidad de tiempo establecida, lo que es proporcional a la concentración y/o
actividad del parámetro.
Esto es debido a que la presencia del parámetro en la muestra va a dar lugar a al
aparición o desaparición de sustancias capaces de absorber la radiación a la λ de medida. La
presencia de estas sustancias está ocasionada por la existencia del parámetro (incluso a veces es el
mismo parámetro biológico el que varía por acción de los reactivos). La Ley de Lambert-Beer que se
aplica en estos casos queda modificada o adaptada como:
ΔA = ε . b . c
Siendo Δ, la que representa la variación de la magnitud que viene a continuación, en este
caso la absorbancia, extinción o densidad óptica, por lo que también se expresa como:
ΔA = ΔE = ΔDO
Generalmente se toma el minuto como unidad de tiempo de medida de la variación de la
densidad óptica por lo que se expresa:
ΔDO/min = ε . b . c
Al ser ε y b, dos valores constantes, se expresa su producto como un factor numérico que a
menudo lo proporcionan las casas comerciales de tal manera que la concentración del parámetro
viene expresada como:
c = ΔDO/min . ΔDO/min . F
ε . b
La reacción que da lugar a una variación de la absorbancia se desencadena al añadir
los otros reactivos a la muestra biológica convenientemente preparada y con las condiciones de
reacción controladas.
A mayor concentración del parámetro biológico, mayor será la variación de absorbancia
en la unidad de tiempo. En el caso de que el parámetro sea una enzima, y que lo que se esté
determinando sea su actividad enzimática la variación de absorbancia en la unidad de tiempo será
directamente proporcional a su actividad.
2. Según algunas características de la reacción:

Colorimétricos:
Se denominan así las reacciones analíticas que se miden empleando longitudes de onda
dentro del visible.
La mayoría de las sustancias no son coloreadas y por tanto no absorben luz en la región
UV-visible, debido a que no tienen grupos cromóforos en su estructura química; entonces, debe
realizarse alguna estrategia con tal de poder analizar espectrofotométricamente estas sustancias. La
estrategia consiste en introducir estructuralmente a estas sustancias no coloreadas los grupos
cromóforos que no poseen; de esta forma estas sustancias se transformarán en otras,
coloreadas, que absorberán luz y podremos analizarlas en el UV-visible por espectrofotometría: una
forma de hacerlo consiste en hacer reaccionar la sustancia no coloreada con un reactivo específico,
de forma que el producto que se obtenga sea coloreado y ahora sí absorba en el UV-visible, de esta
forma podrá ser leído en el espectrofotómetro:
Muestra + Reactivo Producto coloreado

(Sustancia no coloreada) específico
[ ? ] Mg/dl
Concentración lectura Absorbancia

(Espectrofotómetro)
Esta técnica se denomina técnica colorimétrica y consiste en la determinación por

14
colorimetría de la concentración de una sustancia o bien el producto de su reacción con un reactivo

específico.
La absorbancia del producto obtenido es proporcional a la concentración de la sustancia en la
muestra.
Para determinar la concentración se pueden emplear patrones acuosos y la siguiente
expresión:
Cproblema = Cpatrón . A problema
A patrón

ya que suelen ser, por lo general, reacciones colorimétricas a punto final, pero también pueden ser
colorimétricas y cinéticas, por lo que se emplearía la siguiente expresión:
Cproblema = C patrón . ΔDO problema

ΔDO patrón

Enzimáticos:
Son aquellos métodos analíticos en las que alguno(s) de los reactivos (s) son enzimas; no
tienen por qué ser métodos donde lo que se mida sean actividades enzimáticas. El enzima añadido
como parte de los reactivos al unirse al parámetro desencadena una reacción que permite su
determinación bien por aparición de un compuesto coloreado (reacción a punto final), bien por
variación de la absorbancia por unidad de tiempo, etc.
Técnica enzimático-colorimétrica: es otra estrategia para poder analizar

espectrofotométricamente sustancias no coloreadas (que no absorben en el UV-visible); consiste en
acoplar una reacción enzimática al método, de forma que la sustancia problema no coloreada es
sustrato de un enzima específico. Este enzima transforma la sustancia problema en un producto
coloreado que absorbe en el UV-visible, de forma que pueda leerse en el espectrofotómetro.
La concentración del producto coloreado obtenido es proporcional a la concentración de la
sustancia problema.
Muestra + enzima producto coloreado

(Sustancia no coloreada) específico
actúa de substrato de
[ ? ] mg/dl
Concentración lectura absorbancia

(Espectrofotómetro)
La única diferencia respecto a una técnica colorimétrica es que en lugar de establecerse una
reacción química con la sustancia problema, se establece una reacción enzimática.
Ejemplo: para la determinación de la glucosa es muy conocida la técnica de Trinder: el enzima

que actúa sobre la glucosa es la glucosa oxidasa (GOD), transformándola en agua oxigenada y ácido
glucónico:
GOD
Glucosa + O2 + H2O H2O2 + ácido glucónico
(No coloreada) (No coloreada) (No coloreado)
El agua oxigenada formada se hace reaccionar con fenol y 4-aminofenazona para formar un
15
complejo que en presencia de un segundo enzima, la peroxidasa (POD) se transforma este complejo
en quinona, un producto rojo que ahora sí puede ser leído al espectrofotómetro.
POD
2 H2O + Fenol + 4-AF Quinona + 4 H2O
(No coloreada) (Roja)
La absorbancia leída correspondiente a la quinona es directamente proporcional a la cantidad

de glucosa en la muestra.
2. FLUORIMETRÍA

Principios

El fenómeno de fluorescencia se encuentra dentro de los fenómenos llamados de “luminiscencia” que
incluye además de éste, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Todos ellos son resultantes de la
interacción de la luz con la materia que acaba con “emisión” de energía radiante.
Ao + h.v1 A* Ao + h.v2

Siendo: Ao: absorbente en estado fundamental
h.v1: energía de excitación
A*: absorbente en estado excitado
h.v2: energía de emisión

Según el tipo de energía absorbida por la molécula se pueden clasificar los distintos fenómenos
luminiscentes en:
Fotoluminiscencia: cuando la fuente de excitación electrónica es una radiación luminosa; son fenómenos de
este tipo la fluorescencia y la fosforescencia.
Quimioluminiscencia: cuando es una reacción química la que produce la energía capaz de excitar la
molécula.
Existen otros tipos de luminiscencia como son: bioluminiscencia, termoluminiscencia, radioluminiscencia
etc.
Los tipos de luminiscencia que tienen mayor aplicación en bioquímica clínica son la fluorescencia y
la quimioluminiscencia.
La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz (longitud de onda de excitación),
pasa a un estado excitado y al retornar a su estado fundamental, emite luz (longitud de onda de emisión); la
fluorescencia será por tanto la emisión de esa radiación. La energía de la radiación emitida es menor y
por tanto, la longitud de onda es mayor que la de la radiación absorbida. La diferencia o aumento entre
estas 2 longitudes de onda se denomina desviación de Stokes y, de forma general, los mejores resultados
de las medidas de fluorescencia se obtienen con compuestos que tienen grandes diferencias entre las 2
longitudes de onda de excitación y de emisión.
Sólo ciertas sustancias poseen la propiedad de ser fluorescentes: son los fluorocromos (fluoróforos).
Compuestos que no son en sí mismo fluorescentes o sólo débilmente, pueden convertirse en derivados muy
fluorescentes mediante reacciones químicas como condensaciones, sustituciones, deshidrataciones u
oxidaciones, o simplemente modificando su pH particular.
La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas direcciones, pero sólo se mide una
pequeña parte que llega al detector.
El tiempo transcurrido entre la absorción de la radiación electromagnética y la emisión de la
16
fluorescencia es muy pequeño, del orden de 10-8 segundos (10-8 - 10-4) (es más lento el fenómeno de
fluorescencia que el de absorción ya que la absorción se produce en 10-15 seg)
La fluorescencia emitida puede cuantificarse; la luz fluorescente se puede utilizar para cuantificar
la cantidad de compuesto fluorescente que la emite. Se puede aplicar al fenómeno de fluorescencia la Ley
de Beer, siempre que se trabaje con soluciones diluidas: según ella, la intensidad de la radiación fluorescente
es proporcional a la concentración de la sustancia en solución (esta relación es sólo válida para soluciones
diluidas donde la absorbancia es <2% de la radiación excitante ya que si es mayor aparece el efecto de “filtro
interno”).
Factores que afectan a las mediciones fluorimétricas

Los más importantes son los siguientes:
Dispersión de la luz: la radiación incidente no sólo es absorbida o transmitida por la muestra, sino que
también es dispersada en todas direcciones; parte de esta luz dispersada puede ser detectada junto con la
radiación fluorescente contribuyendo a elevar el ruido de fondo y ocasionando una pérdida de sensibilidad
metrológica (esto tiene especial importancia cuando se utilizan fluoróforos con un desplazamiento de Stokes
pequeño, es decir, cuando la radiación fluorescente tiene lugar a unas longitudes de onda cercanas a las de
la radiación de excitación).
Para disminuir esta interferencia se pueden utilizar filtros de interferencia o sitemas monocromadores
tanto en la parte de emisión como en la de excitación.
Efecto de filtro interno: en aquellos casos en que el fluoróforo está a concentraciones muy elevadas

podría aparecer el efecto de filtro interno, detectándose menos fluorescencia que la correspondiente al
mismo fluoróforo en una solución más diluida; este efecto paradójico es debido a lo siguiente: sólo se
mide la fluorescencia de una pequeña porción de la muestra, un elemento de volumen colocado exactamente
en el centro de la cubeta; para que la luz llegue al elemento de volumen del centro de la cubeta, previamente
ha de atravesar una parte de la muestra que a su vez absorbería luz de excitación, por lo que la intensidad de
luz incidente que llega al elemento de volumen central será tanto menor cuanto mayor sea la concentración
de fluoróforo y, como consecuencia, menor será la emisión fluorescente. A este efecto se le conoce como de
filtro interno y ha de ser evitado hasta donde sea posible; para ello lo aconsejable es disminuir la
concentración de la muestra: normalmente para transmitancias mayores del 95%, lo cual significa valores
de absorbancia inferiores a 0,022, el efecto de filtro interno es prácticamente despreciable.
Atenuación de la fluorescencia: la florescencia es bastante susceptible a ciertas variables en la solución

como son:
La naturaleza del solvente
El pH: provoca alteraciones de carga molecular  modifican la fluorescencia
La temperatura: las variaciones de la temperatura afectan a la viscosidad de la matriz y por tanto al número
de colisiones de las moléculas fluorescentes con las moléculas de la matriz
La presencia de impurezas
La presencia de iones: aniones como I-, Br - y Cl- tienen un marcado efecto de atenuación de la fluorescencia
de ciertos compuestos
Impurezas fluorescentes:

Pueden existir impurezas fluorescentes propias de los solventes, tampones, reactivos, algunos
materiales de vidrio o plástico, residuos de detergentes para limpieza de material etc que pueden
absorber la luz de excitación o la de emisión y ser capaces de emitir fluorescencia. No es recomendable
utilizar mezcla crómica para limpiar material de vidrio.
Se debe hacer un blanco de espectro (en el cual la cubeta contenga el solvente y todo aquello
que se utilice en la determinación, sin el fluoróforo).
17
Asimismo, las muestras de suero u orina pueden contener sustancias fluorescentes distintas de las que

se quiere investigar que también contribuyen a la fluorescencia de fondo: las proteínas y la bilirrubina son
las que con mayor frecuencia contribuyen a esta fluorescencia no deseada (sin embargo las proteínas tienen
una λ de excitación máxima entre 260 y 290 nm, y su interferencia es menor cuando se utilizan radiaciones de
excitación por encima de los 300 nm).
Instrumentación

Para la medida de la fluorescencia se emplean fluorímetros o espectrofluorímetros; la diferencia entre
ellos es el sistema de selección de la λ de excitación y de emisión:
Fluorímetro: emplea filtros interferenciales o de vidrio
Espectrofluorímetro: emplea prismas o redes de difracción
Los componentes básicos de estos aparatos son:

fuente de luz de excitación
rendijas de excitación y de emisión
selector de la λ de excitación
compartimento para la muestra: cubeta
selector de la λ de emisión
detector
registro
La luz procedente de la lámpara de excitación se hace pasar por el filtro o monocromador de excitación,
que selecciona la λ adecuada que incide sobre la cubeta con el espécimen; parte de la luz se absorbe y como
consecuencia del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor λ ; ésta se hace pasar por el filtro o
monocromador de emisión colocado perpendicularmente al primero, para evitar interferencias de la luz de
excitación (si no se colocase así, se detectaría no sólo la luz emitida por fluorescencia sino también aquella
transmitida). Finalmente la luz llega al detector, donde se transforma en energía eléctrica.
Fuente de energía:
Las lámparas que se emplean deben emitir energía radiante de intensidad elevada porque para
detectar la emisión fluorescente será necesario previamente excitar el mayor número de flluoróforos
posible (la intensidad de la radiación fluorescente es directamente proporcional a la intensidad de la
radiación de excitación).
El espectro de absorción de la mayoría de los compuestos fluorescentes de interés se sitúa entre los
300-500 nm; por ello es conveniente una lámpara intensa capaz de emitir energía radiante en
una región espectral amplia. Las fuentes de luz que mejor se ajustan a este criterio son:
La lámpara de arco de xenón: produce un espectro continuo entre 250 y 600 nm con un máximo en 470 nm.
La lámpara de mercurio de alta presión: produce un espectro discontinuo con líneas de emisión entre los
365 y 734 nm.
Otras fuentes: lámparas halógenas y combinación de las lámparas de mercurio-xenón, a veces también el
láser.
Rendijas:
Las rendijas de entrada y salida son similares a las de un espectrofotómetro.
Selectores de la de excitación y emisión:

Mediante:
Filtros: interferenciales o de vidrio coloreado
Monocromadores. prismas o redes de difracción
De todos ellos, los filtros interferenciales son los más utilizados, pues los filtros transmiten más luz y
son menos costosos que los monocromadores.
Los selectores se colocan antes y después del compartimento de la muestra.
18
Fin: los de excitación, seleccionar la λ de la radiación de excitación y los de emisión, seleccionar la

λ de la radiación de emisión (eliminar las no deseadas) antes de que la luz incida en el detector.
Compartimento para la muestra:

Forma: las cubetas utilizadas son generalmente rectangulares, por lo menos con 2 caras adyacentes
transparentes; las 2 caras restantes pueden ser también transparentes o pueden tener una superficie
reflectante para dirigir la emisión fluorescente hacia el detector. También pueden ser cilíndricas.
Material: generalmente de cuarzo para UV-visible. Las de vidrio sólo para la zona del visible, a veces de
plástico para la zona del visible, pero pueden causar fluorescencia adicional, lo que produciría pérdida de
sensibilidad
5. Detector:
Los más utilizados son los tubos fotomultiplicadores (ya que son capaces de cuantificar la pequeña
señal fluorescente, logrando así el deseado nivel de sensibilidad en la medida).
Generalmente están dispuestos en ángulo recto respecto del haz de luz incidente.

Aspectos prácticos

La ventaja más importante de la fluorimetría es su enorme sensibilidad: puede llegar a ser de 100 a
1000 veces más sensible que las técnicas colorimétricas.
Como ya se dijo, las medidas de fluorescencia, se deben hacer sobre soluciones diluidas.
Las medidas de fluorescencia se realizan con referencia a un estándar de fluorescencia máxima: el
aparato se lleva a cero con un blanco adecuado no fluorescente (solvente puro) y a continuación se coloca en
la cubeta el estándar de mayor valor y se ajusta el aparato a 100%. Se miden el resto de los estándares y las
muestras y sus valores se expresan como porcentaje del estándar mayor (con los estándares se obtiene una
recta de calibración).
La necesidad de una recta patrón surge de que en las medidas de fluorescencia no hay una magnitud
equivalente al coeficiente de extinción molar (ε) y, por tanto, no se puede desarrollar una ecuación similar a la
de Lamber-Beer.
Aplicaciones en bioquímica clínica

Una gran variedad de compuestos se pueden determinar mediante métodos fluorimétricos, tanto de
forma directa porque sean ellos fluorescentes, como de forma indirecta, acoplando una sustancia no
fluorescente a un reactivo fluorescente.
Estos procedimientos tienen interés porque debido a su enorme sensibilidad metrológica y bajo límite
de detección, pueden determinarse sustancias que están presentes en concentraciones muy bajas en los
distintos fluidos biológicos como: vitaminas, enzimas (oxidoreductasas, peroxidasas….), hormonas
(estrógenos urinarios…), fármacos (fenitoína, fenobarbital…).
La utilización de marcadores fluorescentes en inmunoanálisis (fluoroinmunoanálisis) (Acs
monoclonales marcados) ha supuesto una alternativa importante a los marcadores radiactivos; en este campo
es donde la espectrometría de fluorescencia molecular tiene mayor interés en bioquímica clínica.
3. QUIMIOLUMINISCENCIA

A.- INTRODUCCIÓN

La Luminiscencia es la emisión de luz por moléculas orgánicas. La mayoría de los compuestos
19
luminiscentes emiten luz por una reacción de oxidación, que puede estar o no catalizada. Los principales
catalizadores son las enzimas, los iones metálicos y los complejos metálicos.
La luminiscencia se diferencia de la fluorescencia y de la fosforescencia en que la emisión de luz se
produce como consecuencia de una reacción química y no por la absorción previa de luz que produce una
excitación.
Esta técnica es muy utilizada para inmunoanálisis debido a su gran sensibilidad. El límite teórico de
detección de la luminiscencia es menor que el del marcaje isotópico. Asimismo, la luminiscencia es más
sensible que las medidas de fluorescencia. También es empleada para la detección de la reacción enzimática
en los enzimoinmunoensayos.
La luminiscencia puede dividirse en dos tipos: bioluminiscencia y quimioluminiscencia.

La bioluminiscencia es un fenómeno natural que se presenta en muchas formas de vida inferiores.
Existen diversos tipos de bioluminiscencia natural de acuerdo con las enzimas implicadas y el mecanismo de
emisión de luz. Los más conocidos son:
La luciferasa (EC 1.13.12.7): es el sistema bioluminicente más estudiado. En la luciérnaga americana

(Photinus pyrales), para la producción de luz el ATP actúa como cofactor de esta enzima, que requiere
además Mg 2+ y oxígeno molecular. La reacción tiene lugar en óptimas condiciones a 25 ºC y en tampón
glicina con pH = 7,8. Los cambios en el pH, fuerza iónica y temperatura pueden alterar la intensidad y la
longitud de onda de la emisión de luz.
Alcano monooxigenasa (unida a FMN) (EC 1.14.14.3): Es una enzima procedente de dos bacterias marinas
bioluminiscentes (Photobacterium fischeri y vibrio fischeri
Aequorea: El sistema bioluminiscente de las medusas del género Aequorea consiste en unos complejos
cromóforo-proteínas que reaccionan de forma específica con el ion calcio produciendo una radiación luminosa
(469 nm), independientemente del oxígeno disuelto.
La quimioluminiscencia es la emisión de luz que se produce en algunas reacciones químicas de

oxidación. La energía química que se genera como resultado de la descomposición de un enlace débil
produce intermediarios de estado excitado que vuelven a su estado basal emitiendo luz.
Existen muchos tipos de moléculas con características estructurales muy diversas que producen
quimioluminiscencia. Los sistemas quimioluminiscentes tienen en común el ser detectores de peróxido de
hidrógeno, producto final de numerosas reacciones que intervienen en los métodos de medida empleados en
el laboratorio clínico. Los más utilizados son:
Luminol y sus derivados: El luminol es una de las moléculas quimioluminiscentes más estudiadas.
Esteres de acridinio: Este compuesto es muy utilizado en inmunoanálisis ya que cumple con todos los
requisitos para ser un buen marcador.
Piridopiridazinas .
Dioxetanos.
B.- INSTRUMENTACIÓN
La emisión luminiscente se mide mediante un espectrómetro de quimioluminiscencia molecular,

al que se denomina comúnmente luminómetro.
En un luminómetro la detección de la luz emitida por el compuesto quimioluminiscente se realiza a
través de un fotomultiplicador, que se enfrenta directamente a la muestra. Si la señal se trata digitalmente,
cada fotón se transforma en un impulso eléctrico y su número por unidad de tiempo será proporcional a la
intensidad de luz emitida. La emisión de luz se produce frecuentemente a partir del momento en que se ponen
en contacto la muestra y el reactivo, y su intensidad dependerá de la concentración de los reactivos.
La eficiencia de la emisión de luz de una molécula quimioluminiscente se expresa como rendimiento
de “cuantos luminiscentes” , que describen el número de moles de fotones emitidos por un mol de reactivo.
Un rendimiento de 1 cuanto significa que cada molécula de reactivo da lugar a un fotón.
20
C.- APLICACIONES EN BIOQUÍMICA CLÍNICA
En los últimos años ha aumentado la utilización de procedimientos basados en fenómenos bio y

quimioluminiscentes en el laboratorio clínico, pues poseen grandes ventajas respecto a otros procedimientos.
Las ventajas de la quimioluminiscencia en los ensayos incluyen sensibilidad (límites de detección de moles,
nanogramos, picogramos) y velocidad (señal generada en unos pocos segundos y en algunos casos estable
por varias horas), sin residuos peligrosos, y procedimientos simples. Gracias a ello estos procedimientos
pueden desplazar a los radioinmunológicos, en muchos casos, utilizando las sustancias quimioluminiscentes
como marcadores, como en el Fluoroinmunoanálisis y Quimioluminoinmunoanálisis.
La mayoría de las aplicaciones son inmunoensayos, marcaje de proteínas, ensayos en moléculas de
DNA, y se utilizan para el diagnóstico de enfermedades del tiroides (TSH, T3 y T4), estudios de fertilidad
(hormonas esteroideas, β-HCG), cáncer (marcadores tumorales), drogas de abuso, fármacos, enfermedades
metabólicas e infecciosas, etc.
4. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA

A.- PRINCIPIOS

Esta técnica está basada en el fenómeno de absorción de luz. Es decir, en la absorción de luz a
longitudes de onda muy definidas por parte de átomos vaporizados en estado de reposo. Las bandas de
absorción son muy estrechas, por lo que el espectro total de absorción de un átomo se define como espectro
de líneas (0,001 a 0,01 nm).
El elemento de estudio es situado en una llama, donde es disociado de sus enlaces químicos y, por
ganancia de electrones, se sitúa en un estado atómico base neutro no excitado ni ionizado.
En este estado basal, el átomo es capaz de absorber la radiación emitida por una fuente, consistente
en una lámpara de cátodo hueco, construida del metal a estudiar, y que emite el espectro de líneas
característico de éste. La longitud de onda de la energía radiante absorbida es la misma que sería emitida si
el elemento se encontrase excitado. Por lo tanto, la característica de interés en las medidas por absorción
atómica es la cantidad de luz, a la longitud de onda seleccionada, que es absorbida, cuando la luz pasa a
través de una nube atómica.
Con ayuda de un monocromador, se selecciona la longitud de onda de interés, y se mide la
atenuación de la luz incidente a su paso por la nube atómica. Esta atenuación es consecuencia de las
interacciones de los fotones con los átomos en estado fundamental que se encuentran en el vapor atómico.
A++ + 2 e- A0
A0 + h A* (Proceso de absorción de luz)
A++ = ión en solución

A0 = elemento en estado basal
h = fotón de energía característica.
A medida que el número de átomos se incrementa en el paso de luz, aumenta la cantidad de luz
absorbida. La Ley de Lambert-Beer es válida para relacionar la concentración de átomos en la llama con la
absorción de la luz. De esta manera, se puede efectuar una determinación cuantitativa del analito presente,
midiendo la cantidad de luz absorbida.
La nube de átomos requerida para las mediciones en absorción atómica es producida por la adición
de suficiente energía térmica (llama) o energía eléctrica (cámara de grafito) a la muestra, para disociar los
21
compuestos químicos en átomos libres. La aspiración de la solución de la muestra, dentro de la llama

alineada con el rayo de luz, sirve para ese propósito. Bajo condiciones apropiadas de llama, muchos de los
átomos permanecerán en la forma de su estado fundamental, y serán capaces de absorber la longitud de
onda apropiada proveniente de una fuente de luz.
B.- EQUIPOS DE INSTRUMENTACIÓN EN EAA
Los espectrofotómetros de absorción atómica constan de:

Fuente de luz: Lámpara de cátodo hueco o de descarga sin electrodo.
Modulador.
Quemador.
Componentes fotométricos.
Microprocesador.
1.- Fuente de luz: Emiten una radiación monocromática (de una sola o de un estrecho rango de longitud de
onda) específica. Las más utilizadas son:
Lámpara de cátodo hueco (HCL): Está constituida por un cátodo hueco formado del metal a medir, o de una
aleación apropiada de éste. Habitualmente se emplea una lámpara para cada elemento, aunque hay
lámparas para varios elementos, compuestas por aleaciones de los elementos de interés. El ánodo y el
cátodo se encuentran en un cilindro de vidrio sellado y lleno de un gas inerte, normalmente Neón o Argón a
baja presión. Tiene una ventana, de vidrio o cuarzo, que permite la transmisión de la luz.
La lámpara funciona de la siguiente manera: se suministra una corriente eléctrica al cátodo, que hace que
se liberen iones metálicos de éste y llenen la lámpara con el vapor atómico. Los átomos de vapor se
excitan por colisión con los átomos del vapor inerte, con la resultante excitación electrónica; cuando
regresan a su estado fundamental, emiten su energía radiante característica (espectro de líneas). De esta
forma, obtenemos una energía radiante de una longitud de onda adecuada para ser absorbida por los
átomos en estado de reposo que se encuentren en la llama.
Lámpara de descarga sin electrodos (EDL): Está constituido por una pequeña cantidad o una sal del analito
situado en un tubo sellado de cuarzo que contiene un gas inerte a baja presión. El tubo está rodeado de una
bobina de RF (radiofrecuencia) que produce un campo del orden de 30 Mhz y protegido por una armadura y
con una ventana transparente. Cuando se aplica un potencial a la lámpara, el gas se excita y vaporiza el
metal o su sal.
Las lámparas EDL tienen mayor intensidad y duración que las HCL por lo que permiten analizar
elementos volátiles y/o cuya concentración en la muestra es inferior. Tardan más tiempo en alcanzar la
estabilidad, pero ésta es superior comparada con las de HCL. Son más caras, en general, pero su duración es
mayor.
22
2.- Modulador: Es un dispositivo situado entre la fuente de radiación y el sistema selector de longitud de onda
que regula la salida de la fuente para que su intensidad oscile a una frecuencia constante. Así, la energía
radiante incide sobre la muestra de forma intermitente (a pulsos). Al detector llegan dos tipos de señal, una
alternante desde la fuente y otra continua que procede de la llama. Su finalidad es la de discriminar la
absorbancia del analito de la absorbancia de fondo, independiente de éste. El modulador interrumpe el haz y
en ese momento, el detector sólo registra la radiación que absorbe la muestra. Como modulador se pueden
emplear filtros o discos metálicos cortantes.
3.- Quemador: El quemador o mechero tiene por objeto colocar el elemento de estudio en un estado en el
que se produzca la absorción de luz.
En este componente tienen lugar dos procesos:
Nebulización de la muestra, que tiene por objeto transformar la solución en un fino aerosol antes de ser
introducida en la llama. El nebulizador se considera parte integrante del mechero.
Atomización: una vez en el interior de la llama, el solvente se evapora (desolvatación) y deja en su lugar
partículas microscópicas que se desintegran bajo la influencia del calor, dando lugar así a la formación de
átomos.
En general, las llamas están compuestas por varias zonas:
Zona de combustión primaria, donde es difícil alcanzar un equilibrio térmico por lo que no se emplea para la
atomización de la muestra.
Zona interconal, donde la temperatura es máxima y homogénea. E s la más utilizada para la atomización.
Cono exterior, donde se producen una serie de reacciones secundarias. Tampoco se utiliza.
Las características de la llama (forma, Tª alcanzada, velocidad de combustión, etc.) dependen de la
mezcla de gases que la componen, siendo la más habitual la mezcla aire-acetileno en el laboratorio clínico. La
temperatura de la llama es fundamental en el proceso de atomización. Dependiendo de ésta se distinguen
llamas frías (aire-propano, 1800 ºC) útiles para medir elementos de fácil atomización como los metales
alcalinos y alcalinotérreos; llamas calientes (aire-acetileno, 2400 ºC), capaz de atomizar más de 30
elementos y llamas más calientes óxido nitroso-acetileno, cercano a los 3000 ºC), útiles para la
determinación de elementos de difícil atomización como el aluminio, el silicio y el titanio. Esta no es muy
empleada en clínica.
4.- Componentes fotométricos: Se emplean espectrofotómetros de haz simple o de doble haz. Con los de
doble haz se obtienen mejoras muy grandes en las lecturas.
Los monocromadores son del tipo de redes de difracción; tienen que ser de alta calidad, pues deben
seleccionar un haz de luz de la longitud de onda del estudio, sin perder una cantidad excesiva de luz.
Los detectores son del tipo fototubos, de gran sensibilidad para detectar la señal que les llegue.
5.- Microprocesador: Va integrado en el equipo y se maneja con un teclado. Se emplea para:
Selección de la magnitud medida (absorbancia, transmitancia, altura del pico, área del pico, etc.)
Selección de las condiciones de medida ( rendija, tiempo de integración, etc.)
Registrar los valores de señal obtenidos e interpretarlos, trabajando con curvas de calibración, incluso fuera
de los límites de linealidad.
Absorción atómica sin llama (Atomización electrotérmica)
La llama, cuya finalidad es convertir la muestra en vapor atómico, puede ser reemplazada por otros
métodos, de los cuales el más empleado es el horno de grafito, que aporta mayor sensibilidad que la llama y
se emplea en la determinación de vapores pesados, como el plomo. Las desventajas que presenta con
respecto a la atomización de llama son el elevado tiempo por análisis y la mayor destreza requerida por parte
del operador.
C.- INTERFERENCIAS EN ABSORCIÓN ATOMICA
En las técnicas de absorción atómica existen fenómenos de interferencia que tienen gran importancia en las
23
determinaciones. Se solucionan empleando distintos métodos, según la naturaleza del fenómeno.

Interferencia química: Se producen cuando se forman ciertos compuestos que la llama no se puede disociar.
Para arreglarlo, se añaden soluciones de elementos que desplazan el elemento de interés de esas uniones
químicas indeseables por mayor afinidad con el anión. Por ejemplo, para la determinación del Ca, se añade
una solución de lantano.
Interferencia por ionización: Se produce cuando los átomos de la llama están ionizados en lugar de estar en
estado de reposo. En esta situación, no absorben energía incidente, y hay una aparente disminución de
concentración de la sustancia. Se puede corregir añadiendo un exceso de una sustancia fácilmente ionizable,
que provea de electrones libres al sistema. El exceso de electrones hace que los átomos pasen del estado
ionizado al de reposo, y sean capaces de absorber energía. La interferencia se reduce también disminuyendo
la tª de la llama de aire-acetileno.
Interferencia en la matriz: Pueden originarse errores por diferencia en la imposición de estándares y
muestras. Estos efectos se disminuyen procurando que las soluciones estándar y los problemas sean lo más
parecidos posible en su composición.
Interferencia de emisión: Se produce cuando una parte apreciable de átomos en la llama se excitan, y
decaen luego a su estado fundamental emitiendo energía en su espectro de líneas característico. Esta
energía llega al detector, junto con la restante del proceso de absorción en la llama, y hace que aparezca que
ha habido menos absorción, apareciendo, por tanto, la concentración de elemento falsamente disminuida.
Puede ser eliminada por el uso de un “chopper” o fragmentador del haz de luz que sale de la lámpara.
D.- PRINCIPALES APLICACIONES EN BIOQUIMICA CLÍNICA
Los dos requisitos que debe satisfacer un elemento para que pueda ser cuantificado mediante
espectrometría de absorción son: la posibilidad de que el elemento sea vaporizable en átomos y que la
longitud de onda en que se produce la absorción esté comprendida en el intervalo de 200 a 800 nm, en el que
pueda medirse con relativa facilidad. No es, por tanto, aplicable a la determinación de muchos compuestos,
entre ellos los halógenos, fósforo, azufre, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno o carbono.
La espectrometría de absorción atómica ha sido utilizada en bioquímica clínica como método de
cuantificación de diversos elementos, especialmente metales, en diferentes medios biológicos.
Su aplicación más generalizada es la determinación de la concentración de calcio, magnesio, cobre,
cinc o hierro en suero u orina.
Se utiliza especialmente para el diagnóstico de enfermedades profesionales derivadas de intoxicaciones
por plomo, cadmio, cromo, manganeso, oro, talio y para el estudio de exposiciones a estos elementos en
distintos medios laborales.
Además ha sido empleada para el análisis de elementos contenidos en materiales biológicos diferentes
al suero u orina:
Saliva humana, procedente de parótida: cadmio, cobre, cinc.
Tejidos: cadmio, cinc, plomo, cobre, níquel, cobalto, plata, hierro, oro.
Otros materiales biológicos: cobalto.
En la determinación de metales alcalinos (sodio, potasio y litio) se ha mostrado menos útil.
5. FOTOMETRIA DE LLAMA

1.- PRINCIPIOS

Esta técnica se utiliza fundamentalmente para la determinación de sodio, potasio y litio en líquidos
biológicos, y está basada en el fenómeno de emisión de luz. Cuando un átomo en estado fundamental es
sometido a la energía calorífica de una llama, sus electrones se excitan, pasando a niveles superiores de
energía. Los electrones son inestables en ese estado excitado, y al volver a su estado inicial desprenden la
energía en forma de luz. La luz desprendida puede poseer distintas longitudes de onda (distintos niveles de
24
energía o líneas de espectro) que son características de cada elemento, de modo que se selecciona para un
elemento aquella longitud de onda en la que emite con mayor intensidad, y tiene menos probabilidad de que
se presenten otras longitudes de onda muy cercanas que puedan interferir.
A+ + e- A0

0
A + calor (llama) A*
0
A* A + hy ( h · c /
Siendo: A+ = ión en solución

A0 = átomo en estado fundamental

A* = átomo en estado excitado
h = fotón con una energía determinada por su frecuencia y longitud de onda.
Los metales alcalinos (Li, Na, K) son los más fáciles de excitar en la llama de un mechero ordinario de
laboratorio. En la práctica, este fenómeno se traduce en que cuando se pone una solución de estos metales
en contacto con una llama, cada uno da un color característico y distinto a esa llama (litio = rojo, sodio =
amarillo, potasio = violeta). Las longitudes de onda que corresponden a estos colores son las empleadas para
la determinación de los iones correspondientes.
En condiciones constantes y controladas, la intensidad luminosa de la longitud de onda típicamente
producida por cada uno de los átomos resulta directamente proporcional al número de átomos que emiten
energía, lo cual es a su vez directamente proporcional a la concentración del ión en la muestra.
Otros metales (Ca, Mg...) no son excitados tan fácilmente en la llama convencional, por lo que no
resulta tan sencillo aplicar esta técnica para su medida, por lo que se utiliza poco.
2.- INSTRUMENTAL
El fotómetro de llama consta de:

Gases.
Aspirador y atomizador de la muestra.
Componentes fotométricos.
1.- Gases: Suelen emplearse gas natural, acetileno o propano con aire u oxígeno. Todos ellos funcionan bien
y difieren en la temperatura de la llama de cada uno de ellos, que incide en la sensibilidad que cada
combinación proporciona. La elección de la llama (gases) depende de la temperatura que se desee. Para
determinaciones de sodio y potasio es suficiente el propano-aire. Es esencial que la temperatura de la llama
se mantenga constante, para lo cual se precisan reguladores que mantengan un flujo constante de gas.
2.- Atomizador y llama: Tiene como función disgregar la solución problema en pequeñas gotas, para que los
átomos absorban la energía térmica de la llama y se exciten. La solución suele entrar a gran velocidad y
choca con las paredes de una cámara, disgregándose en finas gotas.
3.- Componentes fotométricos: Las rendijas, monocromadores y detectores tienen la misma función que en
la espectrometría de absorción. Los monocromadores deben ser de alta calidad, para seleccionar
adecuadamente la longitud de onda de interés y hacerla pasar al detector. Deben tener un paso de banda lo
suficientemente estrecho como para seleccionar la longitud de onda de interés con suficiente intensidad,
evitando a su vez la interferencia de todas las emisiones producidas en la llama por elementos no iónicos. Los
detectores más empleados y que mejor resultado dan son los fototubos.
6. NEFELOMETRIA Y TURBIDIMETRIA

1. Fundamento
25

Estas técnicas se basan en la propiedad que poseen las partículas en suspensión de dispersar la
radiación electromagnética. Por tanto, la muestra está compuesta por partículas no transparentes en el seno
de un líquido: precipitados, suspensiones coloidales, etc.
Cuando un haz de luz choca contra una partícula en suspensión parte de esa luz es dispersada, parte
absorbida, parte reflejada y parte transmitida.
El modelo de dispersión y la intensidad de la dispersión dependen de varios factores como la longitud
de onda de la radiación incidente, el tamaño y peso molecular de la partícula, la distancia entre la cubeta de la
muestra y el detector y la concentración de partículas en la muestra.
Todos estos factores se relacionan entre sí mediante fórmulas matemáticas complejas que
constituyen la ley de Rayleigh.
El modo de dispersión depende de la relación entre la longitud de onda de la radiación incidente y el tamaño
de la partícula.
Cuando el diámetro de las partículas es mucho menor que la longitud de onda del haz incidente es simétrica a
un eje de 90º y además la radiación dispersada a ángulos cercanos sería muy poco, esta dispersión se llaman
Rayleigh.
Cuando el tamaño de la partícula es un poco mayor, es decir que se aproxima al de la longitud de onda del
haz incidente. En este caso la dispersión no es simétrica y se dispersa más luz en el sentido de avance de la
radiación incidente que en sentido contrario y la dispersión será mayor para ángulos cercanos a los 0. Este
tipo de dispersión se llama Rayleigh-Debie
Cuando el diámetro de las partículas es muy superior a la longitud de onda del haz incidente. En este caso la
luz se dispersa en el sentido del avance de la luz incidente. La dispersión sería mayor para ángulos cercanos
a los 0º. Esta dispersión se llama Mie.
La intensidad de la dispersión es:

-directamente proporcional al peso molecular de la partícula y a la concentración de las
partículas.
- inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz incidente. A menor longitud de
onda, mayor intensidad.
También es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia de la muestra al detector.

Para que las medidas sean reproducibles será necesario fijar unas condiciones de trabajo que mantengan
constantes y controladas las longitudes de onda, la distancia detector cubeta, temperatura etc.
26
2. Técnicas para medir la radiación dispersada

2.1. Turbidimetría

Va a medir la turbidez. Estos métodos turbidimétricos se basan en la medición de la intensidad de luz
transmitida, después de que un haz de luz atraviese una suspensión de partículas.
En realidad mide la pérdida energética debida a fenómenos de absorción reflexión y dispersión.
La intensidad de luz bloqueada por la muestra es directamente proporcional a la concentración de
partículas, siguiendo la ley de Lambert-Beer en un intervalo limitado de concentraciones.
Esta intensidad transmitida se mide en un espectrofotómetro normal de absorción molecular.
Generalmente se hacen mediciones entre 300-380 nm y entre 500-650 nm.
27
2.1.1.Interferencias
Pueden ser que en la muestra que haya otros elementos en esa muestra que absorban, que
dispersen y que emitan fluorescencia.
2.2. Nefelometría

Se basa en la medida de la luz dispersada por la suspensión de partículas a un ángulo distinto al del
haz incidente.
Miden la luz dispersada, por eso se utilizan aparatos específicos, nefelómetros.
El detector está ubicado a un ángulo de 15 º o 90 º con respecto al haz incidente. Los hay que están
fijos y los hay en los que se puede modificar el ángulo. La gran mayoría de los nefelómetros tienen un
monocromador situado antes de la muestra y otro después. En estos medimos la luz dispersada.
Requiere soluciones diluidas.
3. Aplicaciones

Turbidimetría
Determinación de proteínas totales en orina y líquido cefaloraquídeo
Determinación de ciertas proteínas plasmáticas mediante métodos de inmunoturbidimetría.
Para el contaje de crecimiento bacteriano en cultivos.
También tiene aplicaciones en hematología (detección formación coágulo, etc.)
Nefelometría
Inmunonefelometría, se determinan proteínas plasmáticas y también se utilizan para la determinación de
fármacos.
Para hematología, los citómetros para el contaje de células.
7. ESPECTROMETRÍA DE MASAS

1.- INTRODUCCIÓN

La Espectrometría de masas es una técnica analítica que se utiliza para establecer las masas
moleculares y la estructura química de determinadas sustancias.
Aunque esté incluida entre las técnicas espectroscópicas, la espectrometría de masas no es una de
dichas técnicas pues no utiliza ninguna radiación del espectro electromagnético para irradiar la muestra y
observar la absorción de dicha radiación.
Al contrario que en aquellas en la E M la muestra es ionizada (y por tanto destruida) usando diversos
procedimientos para ello. De todos ellos el más usual y/o utilizado es la técnica denominada de Impacto
Electrónico (EM-IE) consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada mediante el uso de
alto vacío y una fuente de calor) con una corriente de electrones a alta velocidad.
Ello produce que la sustancia pierda a su vez algunos electrones y se fragmente dando diferentes iones,
radicales y moléculas neutras. Los iones (moléculas o fragmentos cargados), y solo ellos, son entonces
conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte
campo magnético y conducidos a un colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones
en función de la relación carga/masa de los mismos. Posteriormente dichos impactos son transformados en
un espectro de masas en el que la intensidad de los picos nos indica la cantidad relativa de iones que poseen
dicha relación carga/masa.
28
El espectro de masas de una sustancia es una representación X-Y en la que en abscisas se

representa la relación carga/masa (m/z) de los fragmentos iónicos producidos y en ordenadas su abundancia
relativa.
En general, la mayor parte de los iones producidos tienen carga unidad, lo que supone en la práctica
la equivalencia del término m/z y la masa molecular del fragmento iónico. En idénticas condiciones
experimentales, una sustancia producirá siempre los mismos fragmentos iónicos y con idéntica abundancia.
Esto equivale a decir que el espectro de masas es siempre el mismo y, por lo tanto, la identificación de un
compuesto determinado se facilita enormemente, sobre todo si se dispone de patrones o de un archivo de
espectros de masas.
2.- INSTRUMENTACIÓN

Los componentes esenciales de un espectrómetro de masas son los siguientes:
Un sistema de introducción de la muestra a analizar, distinto según sea ésta un sólido, un líquido o un gas.
Un sistema de producción de iones o fuente de iones.
Un sistema de separación o filtraje de los iones formados, o analizador de iones.
Un sistema de detección y amplificación de los iones producidos.
Un sistema de tratamiento de los datos recogidos.
Así mismo, para su funcionamiento, la mayoría de EM requiere sistemas de bombeo de alta capacidad
con el fin de obtener un gran vació, necesario para que los procesos mencionados (producción, separación y
detección de los iones) no se vean interferidos por la presencia de aire, ya que éste induce una pérdida de
carga y desviación de las trayectorias, lo que se traduce en una pérdida de detección.
3.- APLICACIONES CLINICAS

Debido a su gran especificidad analítica, no superada por otra técnica, y a la existencia de diversos
sistemas de introducción de muestra y detección, la EM permite el análisis de prácticamente cualquier
compuesto, independientemente de su composición química o estado físico.
Las principales aplicaciones en bioquímica clínica son:
Establecer valores definitivos a materiales de referencia y estándares.
Identificación y cuantificación de compuestos en un intervalo de concentraciones nmol/L y mol/L. Por ejemplo,
análisis de contaminantes ambientales en aguas, sustancias prohibidas (dopaje) o tóxicos en fluidos
biológicos.
Estudio del metabolismo y de la cinética de fármacos.
Etc...
En el caso, por ejemplo de sustancias prohibidas (control de dopaje), es posible identificar compuestos
minoritarios tras su análisis por EM, simplemente por comparación de su espectro de masas con los
contenidos en las bases de datos. Una vez identificados, se seleccionan varios iones de su espectro de
masas para realizar el análisis cuantitativo mediante registro selectivo de iones. De este modo se lleva a cabo
el análisis cuantitativo y cualitativo con cantidades mínimas de muestra.
8. REFRACTOMETRÍA

Se denomina refractometría, al método de calcular el índice de refracción de una muestra para
conocer su composición o pureza. Los refractómetros son los instrumentos empleados para determinar este
índice de refracción. La luz se mueve a diferentes velocidades en diferentes materiales. Si un rayo de luz con
29
una longitud de onda definida en un ángulo fijo cruza un superficie límite entre dos materiales diferentes el
ángulo del rayo cambiará de acuerdo con el índice de refracción de los medios. En condiciones constantes
con características de material conocidas se puede determinar el índice de refracción de un segundo medio
desconocido mientras se mantenga el ángulo de refracción y el índice de refracción del material conocido.
Los refractómetros actuales funcionan con luz natural o con la iluminación de una lámpara blanca. La
luz llega a través de una ventana sobre una superficie de entrada del prisma superior.
Calibración y lectura de la medición

Antes de la medición se realiza siempre un calibrado con agua destilada, moviendo el tornillo hasta hacer
coincidir la rejilla de medición con el cero. Ese tornillo permite conducir el rango luminoso hacia el cruce de las
retículas, actuando sobre el ángulo del espejo dispuesto a la salida del prisma. Este ángulo corresponde al
índice que se registra sobre la escala graduada en índice de refracción, visible en el visor.
En el visor se ofrece el valor de la densidad y su correspondencia en concentración. Son útiles para
determinar proteínas totales en sangre, densidad o concentración de proteínas u otras sustancias en orina…
30

Tema 2. Técnicas Espectrométricas

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Tema 2. Técnicas Espectrométricas

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Curso 2012-13. Ciclo Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico.

Tema 2. Técnicas espectrométricas

TEMA 2. TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS:

1. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR

4. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA

Las técnicas espectrométricas se basan en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la

Naturaleza de la radiación electromagnética

En este fenómeno ondulatorio se definen:

1nm = 1mµ = 10 A = 10​-9 ​m.

​v = c/λ ​siendo c = velocidad de la luz

E = h.v ​ siendo v = frecuencia y h = constante de Planck

Rayos X 10​-3​ -10​1

Luz Visible 380-780

Microondas 10​8​ -10​9

Frecuencias de Radio >10​9

Descomposición del espectro visible y ultravioleta en colores y sus complementarios

380-430 Visible Violeta Amarillo verdoso

430-495 Visible Azul Amarillo

495-555 Visible Verde Rojo

555-600 Visible Amarillo Azul

600-650 Visible Naranja Azul verdoso

650-780 Visible Rojo Verde azulado

Fenómenos de interacción entre luz y materia

1.- Proceso de absorción:

La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental, desprendiendo

A​0 ​+ h . v A* A​0​ + calor

Siendo: A​0​ = absorbente en estado fundamental

2.- Proceso de emisión:

A​0 ​+ h.v​1​ --------> A* -------> A​0​ + h.v​2

Siendo: A​0​ = absorbente en estado fundamental

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR:

​%T = I​s​/I​o​ . 100

El coeficiente de absorción (a) se denomina ​coeficiente de extinción molar​, representado con el

Por comparación con una solución conocida

Por comparación con una solución conocida:

​A​S​/ A​p =​ C​s​/ C​p​ C​p =​ C​s​ . A​p /​ A​s

​C​p​ = C​s​ / A​s​ . A​p​ = F . A​p​ siendo F = factor de calibración

Desviaciones de la Ley de Beer

3. Sistemas de selección de longitud de onda:

Filtros de absorción:​ según el tipo de intervalo de λ que seleccionen, se pueden distinguir:

Filtros de corte: ​son filtros de absorción que impiden el paso de radiaciones de λ superior o inferior a un

Una ​rendija de entrada​ de radiaciones policromáticas

Redes de difracción: consisten en un gran número de líneas (hendiduras) paralelas, situadas a distancias

Longitud de onda nominal de un haz de luz: es la λ en la que se halla el máximo de intensidad de luz. Se

4. Compartimento para la muestra​:

Forma:​ pueden ser

Tamaño:​ habitualmente tienen 1 cm de paso de luz

En algunos casos existen ​dispositivos termostatizadores que mantienen las cubetas a la

5. Sistema de detección de radiaciones:

Dispositivos fotoemisores:​ pueden ser

6. Sistemas de presentación de datos:

Según la ​disposición de los componentes fotométricos​, se pueden clasificar en:

Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: todos los componentes están duplicados menos la

Empleo de factores de calibración: otra forma de trabajo es emplear factores de calibración; se hallan

A estándar = a ​.​ b . c estándar​ ​ estándar​

Tipos de análisis espectrofotométricos

Los tipos de análisis ​se pueden clasificar:

C​problema​ = C​patrón .​ ​A ​problema

2. Según algunas características de la reacción:

Muestra + Reactivo Producto​ ​coloreado

Concentración lectura Absorbancia

Esta técnica se denomina técnica colorimétrica y consiste en la determinación por

colorimetría de la concentración de una sustancia o bien el producto de su reacción con un reactivo

C​problema​ = C ​patrón .​ ​ΔDO ​problema

1nm = 1mµ = 10 A = 10-9 m.

v = c/λ siendo c = velocidad de la luz

E = h.v siendo v = frecuencia y h = constante de Planck

Rayos X 10-3 -101

Microondas 108 -109

Frecuencias de Radio >109

A0 + h . v A* A0 + calor

Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental

A0 + h.v1 --------> A* -------> A0 + h.v2

Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental

%T = Is/Io . 100

El coeficiente de absorción (a) se denomina coeficiente de extinción molar, representado con el

AS/ Ap = Cs/ Cp Cp = Cs . Ap / As

Cp = Cs / As . Ap = F . Ap siendo F = factor de calibración

Filtros de absorción: según el tipo de intervalo de λ que seleccionen, se pueden distinguir:

Filtros de corte: son filtros de absorción que impiden el paso de radiaciones de λ superior o inferior a un

Una rendija de entrada de radiaciones policromáticas

4. Compartimento para la muestra:

Forma: pueden ser

Tamaño: habitualmente tienen 1 cm de paso de luz

En algunos casos existen dispositivos termostatizadores que mantienen las cubetas a la

Dispositivos fotoemisores: pueden ser

Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en:

A estándar = a . b . c estándar estándar

Los tipos de análisis se pueden clasificar:

Cproblema = Cpatrón . A problema

Muestra + Reactivo Producto coloreado

Cproblema = C patrón . ΔDO problema

Muestra + enzima producto coloreado

Ejemplo: para la determinación de la glucosa es muy conocida la técnica de Trinder: el enzima

Ao + h.v1 A* Ao + h.v2

Efecto de filtro interno: en aquellos casos en que el fluoróforo está a concentraciones muy elevadas

Asimismo, las muestras de suero u orina pueden contener sustancias fluorescentes distintas de las que

Los componentes básicos de estos aparatos son:

Fin: los de excitación, seleccionar la λ de la radiación de excitación y los de emisión, seleccionar la

La luciferasa (EC 1.13.12.7): es el sistema bioluminicente más estudiado. En la luciérnaga americana

La quimioluminiscencia es la emisión de luz que se produce en algunas reacciones químicas de

La emisión luminiscente se mide mediante un espectrómetro de quimioluminiscencia molecular,

A++ + 2 e- A0

A0 + h A* (Proceso de absorción de luz)

A++ = ión en solución

A+ + e- A0

Siendo: A+ = ión en solución

El espectro de masas de una sustancia es una representación X-Y en la que en abscisas se