El ensamblado de un Sistema nervioso require la extension de axones y dendritas a regiones especificas

donde ellas son emparejadas con objetivos sinapticos apropiados. A pesar de que las señales que guian
la extension de largo rango han sido caracterizadas extensivamente, mecanismos adicionales son
requeridos para explicar la direccion de corto rango en el desarrollo neural.
Usando una combinacion complementaria de lapso de tiempo, imagines por microscopios de
fluorescencia confocaly microscopios de serie de bloqueo de cara de electron, identificamos un Nuevo
tipo de proyeccion presinaptica que participa en el ensamblamiento del Sistema nervioso de los
vertebrados. La formacion sinaptica por cada celula ciliada de las lineas laterales del pez cebra ocurren
durante un intervalo particular despues del nacimiento de la celula. Durante el mismo periodo, las
proyecciones emergen del soma celular, extendiendose hacia una subpoblacion especifica de celulas
ciliadas maduras e interactuando con las terminales nerviosas aferentes de polaridad especifica. Las
temrinales entonces se extienden a lo largo de as proyecciones para emparejar apropiadamente sitios
presinapticos, despues de las cuales las proyeciones se alejan. Nuestros resultados sugieren que las
proyecciones presinapticas actuan como andamios transitorios para el emparejamiento de corto alcance,
un mecanismo que puede ocurrir en otra parte en el Sistema nervioso.

Como muchos otros vertebrados acuaticos, el pez cebra posee organos de lineas laterales que sienten
Corrientes de agua (Metcalfe et al 1985). La linea posterior lateral en cada lado de la larva de 3 dias
inicialmente comprende siete neuromastos , cada uno de los cuales es un racimo de celulas ciliadas
mecanosensitivas separadas por celulas de soporte y rodeadas por celulas del manto (Ghysen and
Dambly-Chaudiere 2004). Las celulas ciliadas existen en dos subpoblaciones opuestamente polarizadas:
La mitad de ellas son sensitivas a la estimulacion mecanica en la direccion anterior, y la otra mitad de
ellas son responsables de la direccion posterior (Flock y Wersall 1962, Lopez-Shier et al.2004). Las nuevas
celulas ciliadas llegan en toda la vida del pez por mitosis de celulas precursoras, cada uno de los cuales
produce una anteriormente y posteriormente celula ciliada polarizada (Lopez-Shiery Hudspeth 2006).
Dos horas despues de la mitosis, las celulas hijas van bajo de un reordenamiento característico de su
somas (Wibowo et al 2011, Kindt et al 2012). Cerca de despues de 18 horas de la mitosis, las celulas de
cabello estan funcionalmente maduras (Fig 1F). Desde el ganglio de la linea lateral posterior, la cual se
encuentra inmediatamente caudal al oido, varias neuronas bipolares extienden acones sensoriales para
contactar un neuromasto (Metcalfe et al 1985). Cada fibra aferente recive la entrada sinaptica desde las
celulas ciliadas de solamente una polaridad, una especificidad que sucede intependientemente de la
actividad de la celula ciliada (Nagiel et al 2008,2009). Para prender como estos patrones sinapticos
surgen, estuadiamos la formacion de la sinapsis por nuevamente celulas ciliada diferenciadas en larvas
de 2-4 dias post fertilizacion (dpf).

RESULTADOS
Nosotros buscamos primero determinar cuando la diferenciacion de las celulas ciliadas forman la
sinapsis. Usando microscopios de fluorescencia confocal para observar las celulas ciliadas recien surgidas
y fibras aferentes durante las 20 horas siguientes de la mitosis, encontramos que las celulas ciliadas
hicieron contactos minimos con los axones durante el reordenamiento y completaron el proceso sin
asociarse establemente con las terminales aferentes. Inmediatamente los siguientes reordenamientos,
sin embargo, los contactos entre las celulas ciliadas y aferentes se incrementaron significativamente, y
por la hora 15 despues de la mitosis, las celulas ciliadas se han asociado establemente con las terminals
(Fig 1A). Adicionalmente confirmamos que los marcadores pre y postsinapticos de la cinta funcional de
sinapsis, ribeye y membrane asocuada guanilato kinasa (MAGUK) (Sheets et al. 2011), estaban ausentes
de las celulas ciliadas en temprana madurez pero aparecen por la madurez tardia (Fig 1B-F)
 A pesar de que los microscopios confocales proveen medios utiles de evaluar el period de la
synaptogenesis, nosotros fuimos incapaces de identificar las polaridades funcionales de los terminals
axonales por esos medios. En orden de determinar si las celulas ciliadas hacen sinapsis de polaridad
especifica desde el comienzo, investigamos reconstrucciones tridimensionales de neuromastos por
microscopia de electron de bloque de cara (SBEM) [Figura supplemental S1, Pelicula supplemental 1,
Denk y Horstmann 2004]. Un arbol neuronal fue clasificado como una terminal aferente si este
fueyuxtapuesto a uno o mas Cintas sinapticas de celula ciliada. En contraste, un terminal eferente hizo
contacto extensivo con todas las celulas en un neuromasto sin aposicion (chato, este es un termino
cientifico que se refiere al hecho de colocar juntas dos partes de algo) con alguna cinta sinaptica. Una
polaridad funcional de una terminal aferente fue asignada sobre la base de la polaridad de las celulas
ciliadas maduras para quellas Cintas sinapticas fueron yuxtapuestas, las cuales puedieron ser
determinadas por la orientacion de haces ciliares relevantes.
Encontramos que por la madurez temprana, solo la mitad (seis de doce) de las Cintas sinapticas en
celulas ciliadas fueron yuxtapuestas con fibras nerviosas aferentes, indicando que la formacion de la
sinapsis continua durante este periodo. Por la madurez tardia, cerca de todas las Cintas sinapticas (21 de
22) fueron yuxtapuestas con terminals aferentes. En todas las etapas de diferenciacion, las terminals
aferentes en las Cintas sinapticas representaron la subpoblacion de la polaridad apropiada (madurez
temprana, seis de seis, madurez tardia, 20 de 21). Estos resultados indicant que la sinapsis se forma de 2-
15 horas depsues de la mitosis y que la especificidad de la polaridad comienza tempranamente en este
proceso.
Las Imagenes de lapso de tiempo de las celulas ciliadas nacientes durante este period de
synaptogenesis revelan sorprendentes proyecciones que sobresalian de la base de cada soma (Fig 2A,
pelicula supplemental 2,3). Originando que 41 min ± 25 min (N=12) despues del reordenamiento y
extendiendose a 15 μm, las proyecciones fueran diversamente filamentosas, ramificadas, o con la forma
de clavo (con la parte mas guesa hacia arriba). Las proyecciones se extendieron y retrajeron
dinamicamente pero surgieron constantemente desde los mismos dos o tres sitios en cada soma. El
etiquetado fluorescente revelo que las proyecciones contenian numerosos filamentos de actina como en
el Mapa 1B, indicando la prescencia de microtubules (Fig 2B). Las proyecciones desde las celulas ciliadas
nacientes extendidas hacia las celulas ciliadas maduras vecinas en una manera parcial: Las proyeccones
procedentes de las celulas ciliadas de cada polaridad generalmente se aproximaron a la vecindad de las
celulas ciliadas maduras de la misma porlaridad (Fig 2C).
El neuromasto es un Sistema modelo util para epitelios mecanosensoriales debido a su pequeño
tamaño, la accesibilidad microscopica, el desarrollo bien caracterizado, y la inervacion de la polaridad
especifica. Para asegurar que nuestras recomendaciones con esta preparacion son de más relevancia
general, sin embargo, nosotros tambien llevamos a acabo imagenes en lapso de tiempo del desarrollo
del oido interno del pez cebra. Las celulas ciliadas en el utriculo extendido desde las proyecciones de la
superficie basal, cuya morfologia y comportamiento coincide con aquellos de las celulas ciliadas de la
linea lateral (Pelicula Suplemental 4). Para las razones indicadas anteriormente, enfocamos nuestras
investigaciones restantes en las proyecciones de las celulas ciliadas de la línea lateral.

Figura 1. Las celulas ciliadas forman sinapsis de 2 a 15 horas despues de la mitosis. (A) La fraccion de
las ceulas ciliadas nacientes hacen contacto con terminals aferentes (azul/azules) eleven rapidamente los
siguientes reordenamientos celulares. A pesar de que los contactos son transitrioes en el inicio, su
duracion se incrementa progresivamente hasta que, cerca de las 15 horas despues de la mitosis, la
pendiente de la linea se aproxima a la unidad, indicando la complete estabilidad (roja). El tiempo es
denotado en horas despues de la mitosis. La banda gris señala el period del reordenamiento celuar, y la
linea segmentada señala la emergencia de las proyecciones. N=30 (B-E) (proteina de fusion
RibeyemCherry (B,D) y membranas asociadas guanilato de quinasa (MAGUK) (C,E) Puntoslacrimales
(cabezas de flecha) aparecen en celulas de madurez tardia y complete (asteriscos en B,C). Para D y E,
p<0.0001; para D, N =8, 34, 47, y 176 mediciones para las etapas celulares respectivas, para E, N = 8, 16,
16 y 58 mediciones. (F) Una linea de tiempo de diferenciacion de celulas ciliadas. La caja magenta
denota la extension de proyecciones desde las celulas ciliadas nacientes como de costumbre despues de
su reordenamiento hasta que las sinapsis estables son formadas (ver figuras 2-4).

Figura 2. Las ceulas ciliadas nacientes extienden proyecciones basales dinamicas. (A) Imagenes de
lapso de tiempo por microscopia de fluorescencia confocal de celulas ciliadas expresado GFP fusionada a
actina muestran la emergencia de la proyeccion basal (cabezas de flecha) como de costumbre despues
de la terminacion del reordenamiento. Los tiempos son denotados en minutos desde el fin del
reordenamiento. (B) Una proyeccion de celula ciliada (cabeza de fleche) contiene la proteina de fusion
Map1b-GFP, indicative de la prescencia de mirotubulos. La escala acorde con A. (C) Las proyecciones se
extienden predonminantemente hacia las celulas ciliadas maduras de la misma polaridad y
ocasionalmente hacia una celula Hermana o a una celula no ciliada. P <0.0001 para ambas
comparasiones de grupos; N= 9para celulas ciliadas anteriormente polarizadas, y N= 12 para celulas
posteriormente polarizadas. (D) Una vista basal de una reconstruccion SBEM de todos los tipos de
celulas ciliadas en un neuromasto muestra que celulas ciliadas de madurez temprana (asteriscos) pero
no de madurez tardia o madurez complete soportan proyecciones. El plano de vista es tangencial a la
superficie larval.
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Intrigados por la aparicion de proyecciones de celulas ciliadas durante el period de formacion de

sinapsis, investgamos mas cercamente las interacciones entre las proyeciones y las terminals aferentes.
Los datos SBEM, los cuales otorgaron una vista de las proyecciones y sus compañeros de interaccion
sobre una escala de un nanometro, confirmaron que las celulas ciliadas extienden proyecciones durante
madurez temprana pero no despues de eso (Fig 2D). Las no proyecciones fueron observadas ya sean
celulas de soporte o celulas del manto. Las proyecciones formaron areas extensas de contacto con las
terminals aferentes, menos contacto con fibras eferentes, y casi no contacto con otras celulas ciliadas
(terminals aferentes 20.0 0 μm2 ± 9.6 μm2 ; terminals eferentes, 3.9 μm2 ± 3.1 μm2 ; celulas ciliadas
maduras , 0.5 μm2 ± 0.5 μm2 ; celulas ciliadas hermanas 0.4 μm2 ± 0.4 μm2 ; N = 4). A pesar de que, en
peliculas de lapso de tiempo, frecuentemente observamos proyecciones extendiendose a agregaciones
de terminals aferentes debajo de celulas ciliadas maduras , reconstrucciones SBEM revelarn que las
proyecciones fueron impedidas de hacer contacto directo con aquellas celulas por la intervencion de
fibras nerviosas (Fig 3A,B). Exhaustivas reconstrucciones SBEM de otros tipos de celulas no revelaron
alguna estructura que aparecio para jugar un rol en la genesis o estructura de las proyecciones (Pelicula
supplemental 5).
Los arboles de terminales aferentes de la línea lateral incluyen porciones inmobiles que residen bajo
celulas ciliadas maduras como bien como filopodios delgados que vagan en todo el neuromasto e inician
contacto con celulas ciliadas nacientes (Faucherre and Lopez-Schier 2014). Estos filopodios
frecuentemente se extienden a lo largo de una proyeccion de celula ciliada hacia el soma asociado (Fig
3C). Las reconstrucciones SBEM proporcionaron varios ejemplos de filopodios aferentes pasando
directamente a lo largo de una proyeccion (Fig 3D). De hecho, el 94% de los filopodios aferentes que se
colocalizo con las somas de las celulas ciliadas nacientes en las peliculas de lapso de tiempo lo hicieron
en los sitios en los cuales las proyecciones se extendian (N= 77 instancias de colocalizacion en 10 celulas
ciliadas). Los datos SBEM revelaron que todos los contactos de las celulas ciliadas de maudrez temprana
con las fibras aferentes ocurrieron a lo largo de proyecciones (Fig 3E). Ademas, las proyecciones de las
celulas ciliadas de una polaridad dada contribuyeron significativamente areas mayors de contacto con
terminales de la misma polaridad funcional que a aquellos que se oponian a la polaridad (Fig 3F). Estos
contactos preferenciales ocurrieron incluso cuando las proyecciones de las celulas ciliadas de polaridad
opuesta se extendieron en la misma agregacion de neuronas aferentes (Pelicula supplemental Fig S2).
Debido a la apariencia de las proyecciones coincidian con el inicio de abundantes contactos entre
celulas ciliadas y terminales aferentes, nos preguntamos si las fibras nerviosas aferentes eran necesarias
para la formacion de las proyecciones. Para dirigirse a esta pregunta, actuamos con imagenes en lapso
de tiempo de neuromastos en larvas cuyas neuronas aferentes habian estado sometidas a ablacion por
luz ultravioleta de los ganglios de la linea lateral. Los datos SBEM revearon una ausencia completa de
terminales nerviosas en los neuromastos de un especimen tratado y demostraron que el foramen en la
lámina basal a través el cual las neuronas se extienden normalmente desde el nervio de la linea lateral
posterior en los neuromastos estaba cerrado. Las proyecciones sin embargo, surgieron como de
costumbre, poco después de la conclusion de reordenamiento celular (Fig. 3G,H). Ademas, las
proyecciones en las muestras que se sometieron a la ablación eran menos estables que los de las
muestras que conservaron terminales aferentes (Fig 3I).
En imagenes de lapso de tiempo, a menudo observamos terminales aferentes
detenerse cerca de las bases de las proyecciones. Sobre investigando la estructura de tales regiones por
SBEM, descubrimos recimos de vesiculas tambien como de Cintas sinaptias inmaduras con vesiculas
sinapticas asociadas, estructuras cercanamente ausentes en otra parte en la celula (Fig 4A,B). La mitad
de las Cintas sinapticas inmaduras (6 de 12) fueron yuxtapuestas con terminales nerviosas aferentes, las
cuales en cada caso pertenecian a la subpoblacion de polaridad apropiada. En dos instancias,
observamos laminas de membranas de celulas ciliadas abrazando las terminales nerviosas yuxtapuestos
como si ellas estuvieran sujetandose en su sitio (Fig 4C).
Los tamaños de las proyecciones variaron mediante el curso del analisis con imagenes de lapso de
tiempo. En las celulas ciliadas cuyas bases fueron establemente asociadas con terminales aferentes, las
proyecciones fueron significativamente mas pequeñas que en aquellas sin aferentes asociados
establemente (Fig 4D). Las proyecciones tambien tendieron a ser mas largas en muestras carentes de
neuronas de lineas laterales (Fig 4D; pelicula supplemental 6). En los datos SBEM, las proyecciones
asociadas en sus bases con un mayor numero de Cintas sinapticas desapareadas tuvieron volumenes
mas grandes. Observamos que las celulas ciliadas en las muestras sin neuronas de lineas laterals
continuaron extendiendo proyecciones más tarde que aqueyas en neuromastos normales (Fig 4E). Las
celulas ciliadas madurs en especimenes carentes de neuronas de linea lateral contenian ciintas sinapticas
y vesiculas.

Figura 3. Las neuronas aferentes atraviesan proyecciones que se extienden a la sinapsis Madura. (A)
Una reconstruccion SBEM muestra que las proyecciones de las celulas ciliadas (verde) que se extienden
en una reunion de terminales axonales de varios colores debajo de Cintas de sinapsis maduras fueron
hechas por otra celula ciliada (yellow). (B) En un cuadro de secuencia de lapsode tiempo, una proyeccion
(cabeza de flecha) se esxtiende hacia una cinta sinaptica presunta (asterisco). (C) Una serie de imagenes
de lapso de tiempo confocal muestra la extension de un terminal aferente a traves de la proyeccion
(cabeza de flecha). Los tiempos son denotados en minutos despues del reordenamiento. (D) Una
terminal aferente reconstruida (magenta) que atraviesa una proyeccion de ceula ciliada (turquesa). (E)
Una reconstruccion SBEM demuestra que todas las neuronas en contacto con el soma celular naciente
en sus dos proyecciones (asteriscos). (F) Las proyecciones elevadas de las celulas ciliadas anterior y
posteriormente polarizadas hacen las mayores areas de contacto con neuronas aferentes de la misma
polaridad. P < 0.02; N = 4. (G) Una inusualmente larga proyeccion (cabeza de flecha) se forma en la
ausencia de las neuronas de la línea lateral. (H) Las celulas ciliadas hermanas reconstruidas de una larva
cuyo ganglio de linea lateral han sido sometidas a ablacion exhiben numerosas y largas proyecciones. (I)
En la ausencia de las neuronas de la linea lateral, las proyeccionas muestran estabilidad reducida.
P < 0.01; N = 12 and 11.
Discusion.
Este studio ha usado una combinacion de microscopia de lapso de tiempo y SBEM para identificar
nuevas proyecciones celulares involucradas en la inervacion durante el periode de 2-12 horas despues
del nacimiento de la celula ciliada. Los datos sufieren el siguiente modelo de inervacion de celulas
ciliadas (Fig 5). Una celula ciliada naciente extiende proyecciones desde su soma dentro de la proximidad
de celulas maduras ciliadas de sinapsis. Las terminales axonales de polaridad apropiada interactuan con
estas proyecciones, creciendo a lo largo de ellas hasta alcanzar sitios sinapticos en el soma. Finalmente,
despues de que las terminales aferentes han alcanzado los sitios sinapticos y se opusieron a las Cintas
sinapticas, las proyecciones de las celulas ciliadas se retraen.
A pesar de que las somas de las celulas ciliadas son generalmente consideradas como estructuras
estables, la presente evidencia indica que ellos participan activamente en la synaptogenesis. La
participacion de las proyecciones celulares como andamios transitorios que median la inervacion de
polaridad especifica en los nuevos sitios sinapticos pueden ofrecer varias ventajas. Primero, la longitud
de las proyecciones las hace objetivos grandes para atraer contactos de filopodios aferentes. Seguido, la
prescencia de las proyecciones solamente cuando los sitios sinapticos posibles estan disponibles
economiza el proceso de inervacion. Tercero, su estructura lineal provee un adecuado sustrato para
terminales aferentes dirigentes, el cual es faciculado extensivamente con otras neuritis, a sus objetivos.
Finalmente, a extension de las proyecciones hacia terminales aferentes cercanas reduce una busqueda
de terminal para nuevos sitios sinapticos de tres dimensiones a solo uno.
Debido a que la inervacin de polaridad especifica de las celulas ciliadas de la linea lateral ocurre en
la auscencia de actividad de celulas ciliadas, un mecanismo de quimioafinidad puede ser responsible por
emparejamiento (Nagiel et al. 2009). A pesar de que las proyeccione de celulas ciliadas son mas
probables que se extiendan en la proximidad de celulas ciliadas maduras de la misma polaridad, esta
predileccion sola es improbable de conferir inervacion especifica en la medida que las terminales
aferentes de ambas polaridades funcionales residen bajo celulas ciliadas maduras. El mecanismo de
quimioafinidad puede en lugar ser basado en parte sobre la ascociacion preferencial de las proyecciones
de celulas ciliadas con terminales aferentes de la misma polaridad funcional.
Queda por ser determinado si las proyecciones median inervacion por las celulas ciliadas homologas
del odifo interno de los mamifeos tambien. Las Protuberancias que contienen la cinta de sinapsis se
extienden desde las bases de las células ciliadas de tipo II en el utrículo murino pero, a diferencia de las
proyecciones celulares reportadas aqui, persiste a traves de la vida (Pujon et al. 2014). Los procesos
transitorios descritos aqui se parecen a los filopodios que establecen gradientes de morfógeno y
moléculas de señalización de intercambio con objetivos distantes (Ramirez-Weber y Komberg 1999;
Hsiung et al. 2005; Sanders et al. 2003; Kornberg y Roy 2014; Roy et al. “014). Las proyecciones de las
celulas ciliadas pueden igualmente soportar proteinas que median sus interacciones con terminales
nerviosas con el fin de lograr inervacion de polaridad especifica.

Figura 4. La retraccion de las proyecciones es asociada con el contacto aferente estable. (A) Una
imagen SBEM mostro una cinta sinaptica inmadura (cabeza de flecha) en una proyeccion de celula
(silueta azul). (B) En una reconstruccion de celuas ciliadas hermanas de una division reciente, las Cintas
sinapticas (rojo) racimos en sitios desde los cuales las proyecciones emergen. N=10. In esta vista basal,
los haces ciliares parcialmente desarrollados son evidentes en los finales apicales de las celulas
(asterisco). (C) Una terminal aferente de la subpoblacion de la funcionalidad apropiada (verde) contacta
Cintas sinapticas inmaduras (rojo) sobre una proyeccion de celulas ciliadas (azul). Una lamina de
membrane de celulas ciliadas (asterisco) se pliega sobre la terminal aferente. (D) Las proyecciones
alargadas son asociadas con la ausencia de contactos nervioso estables (P < 0.001) o de neuronas de la
linea lateral (P< 0.0001). N = 10, 12, y 11. (E) El periodo total durante el cual las proyecciones emergen
desde las que las celulas ciliadas se incrementan en la ausencia de las neuronas de la linea lateral.
P<0.01; N = 23 y 18.

Figura 5. El diagrama de una proyeccion basada en el modelo de la inervacion de celulas ciliadas. (A)
Durante su reordenamiento, las celulas ciliadas hacen pocos contactos transitorios y contactos no
estables con terminales aferentes. (B) Siguinedo la terminacion del reordenamiento, las celulas ciliadas
desarrollan ptoyecciones basales. (C) Las proyecciones se extienden hacia las agregaciones de neuronas
aferentes en el vecindario de celulas ciliadas de sinapsis. (D) Los filopodioasde las terminales aferentes
se extienden a lo largo de las proyecciones hacia las somas de las celulas ciliadas. (E) Los filopodios
aferentes alcanzan los sitios presinapticos disponibles en las bases de las proyecciones. (F) Las terminales
aferentes de los contactos estables en los sitios presinapticos, y las proyecciones de celulas ciliadas se
retraen.