Ingeniería de enzimas

G-A2
"AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN
PRODUCTIVA Y DEL FORTALECIMIENTO
DE LA EDUCACIÓN"
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICO
PROFESIONAL DE
INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL
“INGENIERÍA DE
ENZIMAS”
CURSO:
LAB. ING. DE BIOPROCESOS.
CICLO:
VII
DOCENTE:
Dr.Ing. CASTILLO CALDERON Augusto.
INTEGRANTES:
 CORTEZ CRUZ Cristhian.
 MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela.
 VEGA VIERA, Jhonas Abner
 ALVA DE LA CRUZ Katherine Jhovana.
 CRUZADO RODRIGUEZ Febe Noemi.
UNIDAD
INGENIERÍA DE ENZIMAS
III
PRE- INFORME DEL EXPERIMENTO
I. INTRODUCCION:
Las enzimas, los llamados, catalizadores de la vida, son sustancias de alta especificidad
que permiten que las reacciones biológicas, normalmente poco probable, se realicen y
permitan el continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podría decirse
que son las moléculas dadoras de vida, que han permitido la evolución de las especies
a lo largo de los años.
Pese a estar presentes desde el origen de la vida, su conocimiento se reduce a tan solo
algunos siglos. Uno de los primeros desarrollos de este tipo se dio hacia la finalización
los siglos XVIII. Se descubrió la acción química de ciertas sustancias en la digestión, así
como ciertos extractos sacarificantes. A finales del siglo XIX Buchner obtuvo una
solución liquida, extraída de levaduras, que cumplía la misma función fermentativa.
Con esto se pudo inferir que un agente químico concreto realizaba tales cambios
dentro de los microorganismos.
Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los
requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química: i.-son catalizadores
muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presión,
pH, etc. 11.-son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en
una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros
de una mezcla racémica de un compuesto quiral, iii.- son catalizadores muy selectivos:
pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que
tenga varias estructuras modificables. Así pues, las enzimas parecen en principio muy
útiles para un gran numero de procesos de enorme interés social e industrial.
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UNIDAD
III
II. OBJETIVOS:
2.1. Objetivos Generales:
 Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima

Inulinasa (2,1-β-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre
de células Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 en sus formas soluble e
inmovilizada.
2.2. Objetivos Específicos:
 Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucares

reductores DNS.
 Obtener un caldo crudo Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 producido por
fermentación de un medio optimizado, en matraces.
 Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades
volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.
 Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada.
 Inmovilizar inulinasa en geles.
 Diseñar, montar y poner en marcha el sistema mini-reactor con Inulinasa
inmovilizada. Analizar su comportamiento.
III. CONSIDERACIONES
Para el diseño debes considerar:
 Usar soluciones concentradas de sacarosa:0.2M – 0.6M
 Utilizar como soporte alginato de sodio al 1.5% - 4.0% (p/v)
 Usar un sistema mini-reactor enzimático por lote agitado.
Definición de UI: Una Unidad Internacional de inulinasa es aquella cantidad de enzima
necesaria que hidroliza un micromol (1𝜇 𝑚𝑜𝑙) de azucares de sacarosa por minuto a 55 °C
y pH 5.0 (tampón citrato-fosfato 0.05M).
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UNIDAD
III
IV. RESUMEN:
En esta practica de III unidad trataremos y enfocaremos nuestra atención en la

Ingeniería de Enzimas, diseñando y realizando los mismos estudiantes diferentes
experiencias de estudios cinéticos de la enzima inulinasa de un caldo crudo libre de
células de Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571, llevaremos a cabo la obtención
de curva de calibrado de proteínas (Bradford) y DNS (azucares reductores),
determinaremos el rango de linealidad y actividad enzimática de la enzima en el caldo
crudo e inmovilizaremos la inulinasa en geles. A partir de ellos determinaremos los
parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada, además de diseñar, y poner
en marcha el sistema mini-reactor con inulinasa inmovilizada, al cual analizaremos su
comportamiento.
Se utilizaran soluciones concentradas de sacarosa: 0,2 M – 0.6 M y como soporte,
alginato de sodio al 1.5%-4.0 % (p/v)
V. FUNDAMENTO TEORICO:
5.1. ENZIMAS:
Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones
químicas en los seres vivos. Los enzimas son
catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse
en una reacción, aumentan notablemente su
velocidad. No hacen factibles las reacciones
imposibles, sino que solamente aceleran las que
espontáneamente podrían producirse. Ello hace
posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar
reacciones que sin catalizador requerirían
condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
5.1.1. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS:
Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas de carbono (C),
Hidrógeno (H), oxigeno (O), Nitrógeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero
siempre con peso molecular bastante elevado y común propiedades catalíticas
específicas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden
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UNIDAD
III
sistemático de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema funcional son

alterados de algún modo, cada organismo sufre más o menos gravemente y el
trastorno puede ser motivado tanto por la falta de acción como por un exceso de
actividad de enzima.
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la

cual se realizan los procesos fisiológicos, producidos por los organismos vivos. En
consecuencia, las deficiencias en la función enzimática causan patologías.
Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y
variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales. La fijación de la energía
solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales
dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están
dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines
energéticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida de
relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la división celular, la
reproducción, etc. Están regidas por la actividad de innumerables enzimas
responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el
individuo, sin liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH,
concentración salina, etc.; prácticamente constante.
A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las

enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de
reacción o solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan
marcadas que en general actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una
configuración precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminoácidos que tienen su
carbono , asimétrico, con estructura L-, no muestran la menor actividad sobre formas
idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D.
5.1.2. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS:
Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de

catalizadores, que son proteínas específicas denominadas enzimas. La presencia de una
enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza. Toda reacción enzimática
puede esquematizarse como sigue:
E+S [ES] E+P
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UNIDAD
III
Así, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P). El
tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que
caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define
como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo.
Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis, v, varía con la concentración de

sustrato (S) y además depende de una constante de velocidad K y de su inversa, en la
forma que muestra la fig.1 y 2.
Figura 1: representación de v en función de [S], para Figura2: representación de dobles

una enzima que obedece la cinética de Michaelis- recíprocos de la cinética enzimática
Menten.
Los parámetros cinéticos de una enzima, Vmáx. y KM pueden calcularse utilizando

distintos tipos de representación gráfica. Uno de ellos es el de dobles recíprocos que
aparece en la figura 2 y se utiliza posteriormente en esta práctica.
Cálculo gráfico.
Figura 3: Gráfico V vs S
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UNIDAD
III
Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de

una recta, calculando sólo algunos puntos se puede obtener:
1 K  S  K m 1 1
 m   
v0 V  S  V S  V
En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será:
v = k3 [E – S]
El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión

equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha
desarrollado la siguiente ecuación:
Así tendremos:
(Simplificando)
Si reordenamos la ecuación tendremos que: [S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]
Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la
velocidad es el valor de km de la enzima.
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UNIDAD
III
5.1.3. EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA.
- Efecto del pH:

Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven
afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte
de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se
desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras:
 La unión del sustrato es mejor o peor que antes.

 Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.
La velocidad enzimática se mide en M/t y la actividad enzimática en mol/t, y la

unidad internacional mol/min, cantidad de enzima que transforma un micromol de
sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es la
cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 mol/s y se la llama katal.
- Efecto de la temperatura:
Cuando la temperatura sube la velocidad de reacción aumenta. Existe una
temperatura máxima a la cual la proteína se desnaturaliza dejando de ser funcional.
La mayor parte de las enzimas se desnaturalizan a unos 50º C. La ribonucleasa se
desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70 º C.
5.2. INULINASA:
En 1900, se observó por primera vez, que Saccharomyces marxianus, poseía la capacidad
de crecer sobre sustratos que contenian inulina como fuente de carbono, hecho que se
atnbuyó a la producción de un tipo de enzima, a la cual se le denominó como inulinasa (2-
p-D-fiuctan fructohidrolasas EC. 3.2.1.7), ya que es capaz de degradar este tipo de sustrato.
Se han aislado enzimas con actividad de D-fructosidasa (inulinasa) de plantas, bacterias,
hongos y levaduras. Esta actividad de inulinasa representa un uso potencial para la
obtención de fructosa a nivel industrial a partir de desechos agrícolas, por lo que estas
enzimas han sido estudiadas ampliamente
La obtención de estas enzimas a partir de plantas presenta el inconveniente de que es muy

difícil aislarlas y, además, tienen una marcada actividad de invertasa, por lo que
actualmente se utilizan las enzimas de fuentes microbianas. Las enzimas del tipo inulinasa
producidas por diferentes microorganismos como los hongos: Aspergillus ficuum y
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UNIDAD
III
Fusarium oxysporum; las bacterias: Bacillus subtilis; y levaduras: Candida salmenticend,

Kluyveromices_fragilis y Debaryomices antarelli, además de la actividad de inulinasa,
presentan también diferentes grados de actividad de invertasa, y todas pertenecen al tipo
P-hctosidasa.
Estudios realizados sobre la producción de inulinasa por Kluyveromices marxianus,

demostraron que el extracto de levadura es la mejor fuente de nitrógeno para la
producción de esta enzima. Se ha reportado que K. fiagilis produce cantidades
equivalentes de inulinasa en un intervalo amplio de pH (3.5-6.0), que la aireación es un
factor determinante para el crecimiento de esta levadura y para la producción de la
enzima, y que la temperatura óptima para obtener una mayor actividad se encuentra entre
30 y 40°C.
En diferentes especies de Kluyveromices se ha demostrado que a diferencia de la

invertasa, la cual se encuentra principalmente dentro de la célula, la inulinasa es una
glicoproteína extracelular, parcialmente asociada a la pared celular y parcialmente
excretada al medio de cultivo, aunque también se ha encontrado enzima unida a la célula
en cantidades apreciables. La diferencia en la localización de estas enzimas se (atribuye,
principalmente, al papel fisiológico que desempeñan en el metabolismo del
microorganismo que las produce.
Se han desarrollado y reportado diferentes procedimientos para la purificación y

caracterización de la inulinasa producida por diferentes microorganismos. En el caso de la
inulinasa producida por K. fragilis, esta fue semipurificada inicialmente por Snyder y
Phaff", los cuales introdujeron el uso de la relación S/I para diferenciar la actividad de
inulinasa, (valores menores a 50 de esta relación, indican actividad de inulinasa); y
posteriormente fue purificada por Grootwasink y colaboradores (tabla II), así como por
otros investigadores.
Workman y Day purificaron la inulinasa producida por Kluyveromices fiagilis,

encontrando que dicha enzima es una glicoproteina con un contenido de carbohidratos del
66% en peso, estable a 50 °C, con un pH óptimo de 4.5, cuya actividad disminuye a
temperaturas mayores de 55 °C, con un pI de aproximadamente 4.0. Estos autores
sugieren que además de los estudios de electroforesis, se debe considerar la
determinación del punto isoeléctrico (PI) como un parámetro para demostrar la pureza de
la enzima. También determinaron los valores de Km de la inulinasa sobre sacarosa (1 3.6
mM a pH 5.0) y sobre rafinosa (46.1 mM a pH 5.0), encontrando que la actividad
enzimática es lnhibida por la configuración de furanosa de la fructosa, pero no mencionan
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UNIDAD
III
el peso molecular de la enzima purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco

reportan datos acerca de la determinación de la Km sobre inulina.
5.2.1. HIDROLISIS ENZIMATICA DE LA INULINA: INULINASAS
La inulinasa o β-1,2-fructan-fructanohidrolasa es la enzima encargada de

hidrolizar los enlaces β-1,2 fructano de la inulina. La hidrólisis completa de la inulina
lleva a la formación de fructosa y glucosa, cuya concentración es proporcional al
grado de polimerización (DP) inicial de la inulina.
La inulinasa puede obtenerse de dos orígenes diferentes: origen vegetal (Diente de

león, achicoria, alcachofa de Jerusalén, etc.) y origen microbiano.
5.2.2. MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE INULINASAS
La inulinasa puede ejercer dos efectos sobre las moléculas de inulina, por lo que se
puede clasificar dos tipos de inulinasas: endo-inulinasas y exo-inulinasas. La exo-
inulinasa comienza con la fragmentación de la primera molécula de D-fructosa y
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UNIDAD
III
continúa hasta romper el último enlace dentro de la molécula de inulina y liberar una
molécula de D-glucosa; la endo-inulinasa hace cortes internos en la molécula de
inulina produciendo así inulo-oligosacáridos. La propiedad de ser endo- o exo- enzima
depende de la fuente microbiana de la cual se obtuvo la inulinasa. De las diferencias
en las propiedades moleculares entre los dos tipos de enzima destaca el peso
molecular.
5.2.3. PROPIEDADES CINETICAS
Estudios realizados sobre la bioquímica de las inulinasas producidas por diferentes

microorganismos demostraron que éstas tienen la misma especlficidad por el tipo de
sustrato, pero muestran diferencias en la estabilidad, pH y temperatura óptimos para
la actividad enzimática.
5.2.4. APLICACIONES:
Durante las últimas tres décadas se ha desarrollado un nuevo método de obtención de

jarabes de fructosa: la hidrólisis enzimática de la inulina empleando inulinasas. El uso
de inulinasas de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus inmovilizadas en gelatina
para la conversión de inulina en fructosa se ha utilizado para fabricar jarabes de alta
fructosa. La conversión de inulina en fructosa produce jarabes con un 95% de
fructosa.
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UNIDAD
III
5.3. INMOVILIZACION DE ENZIMAS:
La inmovilización de enzimas es una técnica que se viene estudiando desde hace mucho
tiempo. Si nos remontamos al año 1916, encontramos que, dos científicos, Nelson y Griffin
utilizaron preparaciones de invertasa inmovilizada por adsorción a carbón activo. Pero la
historia más reciente de la utilización de estas técnicas se remonta allá por los años 50,
cuando Grubhofer y Schleith inmovilizaron pepsina, carboxipeptidasa, ribonucleasa y
diastasa en poliaminoestireno diazotizado. En 1956, Mitz empleó la unión iónica de
catalasa a DEAE-Celulosa y más tarde, en 1963, se intentan inmovilizar los primeros
compuestos por atrapamiento, por Bernfeld y Wan que realizaron preparaciones de
tripsina, papaína, amilasa y ribonucleasa inmovilizadas en geles de poliacrilamida. En
1971, Gregoriadis inmovilizó amiloglucosidasa sobre liposomas (Battaner 1998.). Varios
científicos, han estudiado muy a fondo todo tipo de interacciones que se establecen entre
la enzima y el soporte, el tipo de grupos que se encuentran involucrados y las
características más importantes de las mismas (Guisan y col. 1993).
Las enzimas son biocatalizadores con excelentes propiedades para su utilización como
catalizadores industriales, pero presentan algunos problemas. Uno de estos problemas es
que son moléculas solubles, con lo que, su separación de los medios de reacción y su
posterior reutilización puede ser complicada.
Por ello se hace conveniente la inmovilización de la enzima previa a su utilización. La

inmovilización de las enzimas simplifica la recuperación y reutilización del soporte,
evitando la contaminación de los productos por la enzima (muy importante sobre todo en
tecnología de alimentos), permite simplificar el diseño y control de los reactores, etc.
5.3.1. REACTORES CON ENZIMAS INMOVILIZADAS:
Por ser este tipo de reactores únicos en cuanto a sus características y en virtud de que
la ingeniería de enzimas inmovilizadas aún se encuentra en sus inicios, es muy difícil
establecer generalizaciones, pues en el mejor de los casos la experiencia es limitada.
En cierta forma los problemas son parecidos a los de la catálisis heterogénea clásica,
pero como existen pocos casos prácticos, se toman éstos a manera de ejemplos
ilustrativos. El tipo de reactor, su comportamiento cinético y la transferencia de masa
son factores que afectan y determinan el proceso enzimático y su operación.
UNIDAD III 12
UNIDAD
III
5.3.2. COMPORTAMIENTO DE REACTORES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS:
Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética de

la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos tipos de
reactor; solo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales, generalmente
se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales.
Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se puede

obtener la ecuación integrada entre el tiempo cero al tiempo t:
𝑘𝑒𝑡 𝑆0 𝑋
= − ln(1 − 𝑋)
𝐾𝑚 𝐾𝑚
Donde t= tiempo para alcanzar la conversión X

Se pueden obtener ecuaciones similares para una cinética de tipo Michaelis-Menten
reversible, para casos de inhibición competitiva por producto e inhibición por
sustrato.
5.4. MÉTODO DE LOS INVERSOS O LINEWEAVER – BURKE
Emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético

simple.
El diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como herramienta gráfica para calcular los

parámetros cinéticos de una enzima.
Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente

representable y que de él emanan mucha información de interés.
UNIDAD III 13
UNIDAD
III
Cuyo recíproco es:
Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la

velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato.
La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de

corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas el valor
de -1/Km. Fuente: Lineweaver, H; and Burk, D. (1934). «The Determination of Enzyme
Dissociation Constants». Journal of the American Chemical Society 56: 658—666.
5.4.1. INCONVENIENTES DEL MÉTODO
 Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir

a grandes errores.
 A altas concentraciones los puntos se aglutinan al principio de la gráfica.
UNIDAD III 14
UNIDAD
III
VI. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS
6.1. Determinación de proteína: Método de Bradford

a) Materiales
 Tubo de ensayo
 Matraz
 Celdas para espectrofotómetro
 Micropipeta
b) Instrumentos y Equipos
 Balanza analítica
 Espectrofotómetro
c) Reactivos
 Agua destilada
 Azul de Coomassie G-250
 Etanol al 98%
 Ácido fosfórico al 85%
 Reactivo de Bradford
6.2. Determinación de azucares reductores mediante el método del

DNS
a) Materiales
 Pipetas
 Tubos de ensayo
 Celdas
 Hielo
b) Instrumentos e Equipos
 Equipo baño maría

c) Reactivos
 Agua destilada
 DNS
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UNIDAD
III
6.3. Metodología de la obtención del caldo crudo de Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y-7571
a) Materiales
 Vaso precipitado
 Probeta
 Tubo para centrifuga
 Centrifuga
 Refrigeradora
 pH metro
c) Reactivos
 Levadura desecada
 Fosfato de sodio
6.4. Determinación del rango de linealidad y actividad de la enzima

a) Materiales
 Tubos de ensayo
 Micropipeta
 Cubos de hielo
 Equipo de baño maría
 Agitador automatico
 pH metro
c) Reactivos
 Solución de sacarosa
UNIDAD III 16
UNIDAD
III
6.5. Método de inmovilización de Invertasa en Alginato de Sodio

a) Materiales
 Matraces
 Tubos de ensayo
 Jeringa
 Equipo de baño maría
c) Reactivos
 Alginato de sodio
 Invertasa
 Solución de CaCl2 0.1M y 0.05M
6.6. Diseño y montaje del sistema mini reactor con invertasa

inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la
enzima.
a) Materiales
 Matraces
 Tubos de ensayo
 Pipeta
 Micropipeta
 Viales
 Pinzas
 Shaker
 Olla
 Mechero bunsen
 Refrigeradora
c) Reactivos
 Buffer acetato 0.05 M, pH 4.7

 Preparad Enzimático
 Solución de Sacarosa
UNIDAD III 17
UNIDAD
III
VII. PROCEDIMIENTO:
7.1. Determinación de proteínas: Método de Bradford
Bradford, M. 1976, un método rápido y sensible para la cuantificación de las

cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión a
proteínas del tinte.
0.1 azul de coomassil G-250 DISOLVER
AÑADIR 100 ml de H3PO4 al 85%
AFORAR A 1 litro con agua destilada
AGITAR Por una hora
FILTRAR Con algodón
GUARDAR En un frasco
ETIQUETAR
REPOSAR
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UNIDAD
III
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UNIDAD
III
7.2. Determinación de azucares reductores mediante el método de

DNS
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de

agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador
magnético y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se
agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar
hasta 50 mL.
AÑADIR 1 ml de DNS
CALENTAR Por 5 minutos
ENFRIAR Agua helada
AÑADIR 10 ml de agua destilada
AGITAR
LEER Absorbancia
La concentración se obtiene interceptando la medida de

absorbancia en la curva de calibrado.
UNIDAD III 20
UNIDAD
III
La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de

concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
UNIDAD III 21
UNIDAD
III
7.3. Metodología de la obtención del caldo crudo de Kluyveromyces

Marxianus NRRL Y-7571
Tomamos con
una jeringa 50
ml del caldo de
kluveromyces
marxianus que
se encontraba
en el
biorreactor
Centrifugamos el caldo para

poder eliminar las celulas de
kluveromyces marxianus y
quedarnos solamente con el
sobrenadante, es decir un caldo
crudo de inulinasa libre de celulas
kluveromyces marxianus NRRL-
7571
Obtenemos el
caldo crudo
de inulinasa
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UNIDAD
III
Mantenemos el
caldo bajo
refrigeracion
Guardamos 3 ml del
caldo en viales para
los demas grupos
El caldo crudo contiene sustancias

químicas, subproductos o residuos que
pueden inhibir la actividad catalítica de
la enzima inulinasa, por ello hay que
concentrar para que la actividad
enzimática aumente, es decir aumentar
el poder catalítico de la enzima.
UNIDAD III 23
UNIDAD
III
7.4. Determinación del rango de linealidad y actividad enzimática

(actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.
La experiencia se realizará a diferentes diluciones del extracto bruto enzimático,

1:1, 1:2, 1:3………, se graficará la concentración de Sustrato o Producto contra
Tiempo de reacción y se expresará correctamente los valores de las actividades
volumétrica (UI/ml) y específica (UI/mg).
5 Tubos de ensayo PREPARAR
AGREGAR 2,9 ml de solución sacarosa
COLOCAR A baño maría (40ªC – 3 min)
AGREGAR 0.1 ml caldo crudo
CALENTAR Por 3 min a 100ªC
LLEVARLOS Refrigeración
DETERMINAR Azúcares reductores
UNIDAD III 24
UNIDAD
III
UNIDAD III 25
UNIDAD
III
7.5. Método de inmovilización de invertasa en alginato de sodio
El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que

la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la
inhibición, amplia el intervalo de pH óptimo y reduce las posibles
contaminaciones microbianas.
Solución de alginato de sodio 2% PREPARAR
CALENTAR 15 min a 80ªC
1 ml de invertasa y cargar en
MEZCLAR
una jeringa
La mezcla en 30 ml de
GOTEAR
solución CaCl2
REPOSAR En refrigeración por 30 min
LAVARLOS Con solución CaCl2 al 0.5 M
EMPACAR Dentro de un mini reactor
TOMAR 1020 ml por cada 4 horas
PONER A hervir por 3 min y enfriar
Curva de DNS
REALIZAR
UNIDAD III 26
UNIDAD
III
UNIDAD III 27
UNIDAD
III
En la práctica de inmovilización de
inulinasa, se utilizó un mini-reactor.
Este está comprendido por un
recipiente rígido de vidrio, el cual
desempeña la función de un reactor por
lotes. Este está empacado por otro
recipiente más grande el cual cumple la
función de chaqueta térmica, que va
permitir mantener la temperatura ideal
de reacción enzimática
En la figura también se puede notar unas mangueras, las cuales permiten el

transporte del oxígeno, ya que la baja solubilidad del oxígeno en el medio acuoso
significa que éste debe suministrarse de manera continua mientras se elimina el
dióxido de carbono y otros gases producidos en el proceso. El agitador magnético
cumple la función de homogenizar, ya que si el reactor está bien mezclado, el
producto posee la misma composición que el líquido presente en el reactor.
Ingreso de Baño María a

oxigeno 45°C
Agitador
magnético
Salida de CO2
y otros gases
UNIDAD III 28
UNIDAD
III
INMOVILIZACION DE ENZIMAS
METODO (ATRAPAMIENTO EN GEL)
FUNDAMENTO TEORICO:
El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplia el intervalo de pH
óptimo y reduce las posibles contaminaciones microbianas.
MATERIALES:
Alginato de sódio al 2%
Solución de CaCl2 0,1M y 0,5M.
Jeringa
Matraces
Mechero
Mini-reactor
UNIDAD III 29
UNIDAD
III
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PRIMERA ETAPA:
25ml agua destilada Una disolución de 25ml de Alginato de Sodio al

PREPARAR
5%
0.5g alginato
CALENTAR En baño María a 80ºC por algunos minutos
AGITAR Con la varilla, hasta que se diluya toda la

solucion
COLOCAR En la estufa durante 15 minutos
ENFRIAR A baño María a 45ºC por 5 minutos
DIVIDIR Lo obtenido en 3 vasos pequeños para cada

grupo(A, B y C)
5ml de solución
OBTENER
Del vasito correspondiente para nuestro grupo.
5ml de solución
AGREGAR Vaso precipitado
1ml caldo crudo
COLOCAR A 45ºC en baño María
AGITAR Con la varilla hasta obtener una solución

uniforme
UNIDAD III 30
UNIDAD
III
SEGUNDA ETAPA:
COLOCAR En el agitador magnético un vaso a baño con

hielo
35ml CaCl2
COLOCAR A una bureta completando con 15ml de agua
(0.1M) destilada
AGREGAR Al vaso a baño con hielo en el agitador

magnetico
TERCERA ETAPA:
EXTRAER 5ml con la jeringa de lo obtenido en la primera

etapa
AGREGAR Al vaso de la segunda etapa que se encuentra

en el agitador GOTA A GOTA
DEJAR Reposar en refrigeración por 2 horas
LAVAR Con CaCl2 los beats
ELIMINAR El sobrenadante
COLOCAR Los beats en el vaso en el agitador
UNIDAD III 31
UNIDAD
III
CUARTA ETAPA (En el mini-reactor):
45ml Sacarosa
AGREGAR Al mini-reactor que se encuentra a 55ºC
Beats, 20ml tampon
TOMAR Muestras cada 30 minutos durante 4 horas
HERVIR Cada muestra por 3 minutos
ENFRIAR
En agua helada
GUARDAR Cada muestra en cada vial
LEER Absorbancias tras haber realizado DNS con las

8 muestras tomadas.
UNIDAD III 32
UNIDAD
III
PROCEDIMIENTO Y GRAFICOS
MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE
INVERTASA EN ALGINATO DE SODIO
1 •Prepara una disolución de alginato de sodio

al 2% y calentar a 80ºC por 15 minutos y
luego enfriar a 45ºC.
•De la disolución anterior tomar 5 mL,
2 mezclar con 1 mL del preparado

invertasa y cargar toda una jeringa
provista de aguja.
3
•Con la jeringa gotear la mezcla
dentro de 30 mL de solución
agitada de CaCl20.1 M.
UNIDAD III 33
UNIDAD
III
4 •Empacar los “beads” dentro del mini-

reactor a 40°C, que tiene 20ml de tampon y
25ml std.
5 • Luego tomar 1000ul de muestra

cada 30min por 4 horas.
6
• Cada muestra se pone a hervir por
3min, luego se enfría en agua helada y
guardar en cada vial.
Finalmente realizar DNS a las 8

muestras obtenidas
UNIDAD III 34
UNIDAD
III
RESULTADOS
1. DETERMINACION DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMATICA
Cuando se efectúa una reacción enzimática, se observa, un aumento en la concentración

del producto y una disminución en la concentración del sustrato hasta que la reacción
termina o alcanza su punto de equilibrio.
Se trabajó a diferentes concentraciones de enzima. Donde obtuvimos absorbancias de

las muestras, a diferentes concentraciones de enzima para diferentes tiempos donde a
cada uno se le restó el error de los blancos de enzima y sustrato, y obtuvimos nuevos
datos los cuales son mostrados a continuación:
TABLA A.1-GRUPO A: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL

RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
A-3 A-2 A-1

Tiempo Tiempo Tubo Lectura Lectura Lectura (540
(h) (Min) (540 nm) (540 nm) nm)
0 0 1 0.787 0.383 0.575
0.08 5 2 0.395 0.696 0.635
0.17 10 3 0.79 1.234 0.977
0.25 15 4 0.506 0.794 1.135
0.33 20 5 0.495 0.976 1.203
Blanco sustrato 0.037 0.002 0.043
Blanco enzima 0.003 0.036 0.055
TABLA A.1-GRUPO B: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL

B-3 B-2 B-1

Tiempo Tiempo Tubo Lectura Lectura Lectura (540
(h) (Min) (540 nm) (540 nm) nm)
0 0 1 0.151 0.079 0.065
0.08 5 2 0.314 0.562 0.655
0.17 10 3 0.675 0.9 0.416
0.25 15 4 0.462 0.693 0.739
0.33 20 5 0.479 0.785 0.864
Blanco sustrato 0.071 0.053 0.039
Blanco enzima 0.018 -0.006 0.002
UNIDAD III 35
UNIDAD
III
TABLA A.1-GRUPO C: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL

C-3 B-2
Tiempo Tiempo Tubo Lectura Lectura

(h) (Min) (540 nm) (540 nm)
0.155 0.221
0 0 1
0.389 0.398
0.08 5 2
0.599 0.749
0.17 10 3
0.411 0.375
0.25 15 4
0.45 0.618
0.33 20 5
0.011 0.042
Blanco sustrato
0.075 -0.008
Blanco enzima
DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD DE LA ENZIMA
Para determinar la actividad de la enzima, tenemos que obtener la cantidad de

producto (azucares reductores) que estas degradando a partir del sustrato Sacarosa.
Así tenemos que:
∆𝑃 𝑔𝑟
𝑎= ( )
∆𝑡 𝐿 ∗ 𝑚𝑖𝑛
 Tenemos que: CURVA DE CALIBRADO DE AZUCARES REDUCTORES

ABS= A(AZUCARES REDUCTORES) + B
ABS=0.6012 (Azucares reductores)+0.0037
Donde:
A: PENDIENTE=0.6012
B: INTERCEPTO=0.0037
Así tendremos:
𝐴𝐵𝑆. – 0.0037
𝐴𝑍𝑈𝐶𝐴𝑅𝐸𝑆 𝑅𝐸𝐷𝑈𝐶𝑇𝑂𝑅𝐸𝑆 =
0.6012
UNIDAD III 36
UNIDAD
III
TABLA A.1-GRUPO A: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE

LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD.
SACAROSA 20 G/L)
A-3 1:4 A-2 1:2 A-1 1:1

TIEMPO Tubo ABS (540 P P' P'' ABS (540 P P' P'' ABS (540 P P' P'' (g/L)
(Min) nm) (g/L) (g/L) (g/L) nm) (g/L) (g/L) (g/L) nm) (g/L) (g/L)
0 1 0.787 1.315 1.315 1.236 0.383 0.643 0.643 0.568 0.575 0.963 0.963 0.787
5 2 0.395 0.663 2.653 2.574 0.696 1.164 5.819 5.744 0.635 1.062 10.624 10.448
10 3 0.79 1.320 5.281 5.202 1.234 2.059 10.294 10.218 0.977 1.631 16.312 16.137
15 4 0.506 0.848 6.782 6.704 0.794 1.327 13.268 13.193 1.135 1.894 18.940 18.765
20 5 0.495 0.830 6.636 6.557 0.976 1.630 16.296 16.220 1.203 2.007 20.072 19.896
Blanco 0.037 0.068 0.068 0.002 0.009 0.009 0.043 0.078 0.078
sustrato
Blanco enzima 0.003 0.011 0.011 0.036 0.066 0.066 0.055 0.098 0.098
UNIDAD III 37
UNIDAD
III
TABLA A.1-GRUPO B: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE

SACAROSA 20 G/L)
B-3 1:4 B-2 1:2 B-1 1:1

TIEMPO Tubo ABS (540 P P' P'' ABS (540 P P' P'' ABS (540 P P' P'' (g/L)
(Min) nm) (g/L) (g/L) (g/L) nm) (g/L) (g/L) (g/L) nm) (g/L) (g/L)
0 1 0.151 0.257 0.257 0.097 0.079 0.138 0.138 0.047 0.065 0.114 0.114 0.034
5 2 0.314 0.528 2.114 1.953 0.562 0.941 9.410 9.319 0.655 1.096 5.478 5.398
10 3 0.675 1.129 4.516 4.355 0.900 1.503 15.032 14.941 0.416 0.698 6.981 6.901
15 4 0.462 0.775 6.197 6.037 0.693 1.159 17.383 17.292 0.739 1.235 12.354 12.273
20 5 0.479 0.803 6.423 6.263 0.785 1.312 19.678 19.588 0.864 1.443 14.433 14.352
Blanco 0.0710 0.1243 0.1243 0.053 0.094 0.094 0.039 0.071 0.071
sustrato
Blanco enzima 0.0180 0.0361 0.0361 -0.006 -0.004 -0.004 0.002 0.009 0.009
UNIDAD III 38
UNIDAD
III
TABLA A.1-GRUPO B: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE

SACAROSA 20 G/L)
C-3 1:5 C-2 1:3

TIEMPO Tubo ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L)
(Min)
0 1 0.155 0.264 0.264 0.109 0.221 0.374 0.374 0.218
5 2 0.389 0.653 2.613 2.457 0.398 0.668 3.341 3.185
10 3 0.599 1.002 4.010 3.855 0.749 1.252 6.260 6.105
15 4 0.411 0.690 5.518 5.363 0.375 0.630 6.299 6.144
20 5 0.450 0.755 6.037 5.882 0.618 1.034 10.341 10.186
Blanco sustrato 0.011 0.024 0.024 0.042 0.076 0.076
Blanco enzima 0.075 0.131 0.131 -0.008 -0.007 -0.007
UNIDAD III 39
UNIDAD
III
FIGURA A.2 - GRUPO A: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y

ATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
25.000
20.000
15.000
P (g/L)
10.000
5.000
0.000
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
(1:4) "(1:2)" "(1:1)"
FIGURA A.2 – GRUPO B: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y

20
18
16
14
12
P (g/L)
10
8
6
4
2
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
B-3 1:4 B-2 1:1 B-1 1:2 C-2 1:3
UNIDAD III 40
UNIDAD
III
FIGURA A.2 – GRUPO C: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y

7.000
6.000
5.000
4.000
P (g/L)
3.000
2.000
1.000
0.000
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
C-3 1:5
La Gráfica nos indica el rango de linealidad de la enzima; la curva obtenida se basa en la

reacción enzimática y su dependencia con el tiempo. La forma de la curva representa la
velocidad de formación de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de
enzima, los cuales demuestran que a una mayor concentración de enzimas el rango de
linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante
más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima
disminuye, entonces diríamos si se trabajara con diluciones menores, como lo realizó el
grupo A-3 (1:4), A-2 (1:2) y A-1 (1:1) demostraríamos que a una mayor concentración
de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su
capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad
catalítica de la enzima disminuye.
Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de

esta recta como velocidad inicial .A(1:1) y B(1:1) tiempos mas largos, el progreso de la
reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reaccion se debe a la
disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque tambien puede influir
otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH,
UNIDAD III 41
UNIDAD
III
inactivación de enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de

un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial
de progreso lineal de la reacción.
La actividad catalítica de la enzima depende tanto de su capacidad de adsorción sobre el

sustrato, como de la formación del complejo activo enzima-sustrato. Este último aspecto
estará controlado por aquellos factores que afectan a la accesibilidad del sustrato
(configuración física, morfología, cristalinidad y estructura química), a las
características de la proteína enzimática a las concentraciones relativas de sustrato y
enzima, así como de los parámetros físicos de reacción como temperatura y
transferencia de masa.
La literatura para explicar la hidrólisis de la sacarosa, mediante la Inulinasa nos dice:
El proceso de extracción de la inulinasa, además de determinar el rendimiento y si la

enzima es extracelular o intracelular, determina otras características como su peso
molecular (MW), su modo de acción sobre la molécula de inulina, su actividad hidrolítica
sobre la sacarosa, respuesta a los cambios de pH y temperatura, propiedades cinéticas y
efecto de la concentración de sustrato (Chi et al., 2009).
Se ha determinado que las inulinasas pueden ejercer dos modos de acción diferentes
sobre la molécula de inulina, una acción extrema y una acción interna, correspondiendo
dos clases de inulinasas llamadas exo-inulinasas y endo-inulinasas respectivamente. Las
exo-inulinasas (74 KDa, pH 5.1 – 7.0) empiezan con la separación de la primera
molécula de D-fructosa y va hasta el último enlace para liberar glucosa de la unidad de
sacarosa y la endo-inulinasa (64 KDa) actúa sobre enlaces internos y rinde un conjunto
de inulo-oligosacáridos (inulotriosa, inulotetrosa y inulopentosa) pero sin actividad
invertasa. Estas propiedades dependen del origen microbiano de la enzima. De este
punto de vista la mejor cepa sería la que tenga ambas propiedades, como el caso del A.
ficuum (Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de endo y exo inulinasa puede
resultar en una mejor conversión de inulina a fructosa que solo utilizar enzimas puras
aisladas, dado que las endo-inulinasas romperían las moléculas de inulina en muchos
oligosacáridos, aumentando así los puntos de ataque para las exo-inulinasas, con el
consecuente incremento de la velocidad de reacción de inulina a fructosa.
UNIDAD III 42
UNIDAD
III
Por tanto queda probado que las exo-inulinasas también ejercen actividad catalítica
sobre la sacarosa, desdoblándola en glucosa y fructosa, es decir tienen actividad de
invertasa. Se afirma que la actividad invertasa es mayor en enzimas producidas por
levaduras que en aquellas obtenidas a partir de mohos (Ricca et al., 2007).
Notoriamente una actividad invertasa de inulinasa es deseable. Laloux et al. (1991)
sostienen que las inulinasas poseen sitios catalíticos comunes, pero diferentes sitios de
enlace para la hidrólisis de inulina y sacarosa.
La actividad y estabilidad depende de la respuesta de la enzima a los cambios de

temperatura y pH. Los valores de temperatura y pH dependen del tipo de
microorganismo usado como fuente, generalmente se da valores más altos para
bacterias y levaduras que mohos. Así se tienen los rango de valores de pH, para mohos
4.5 – 7.0, para levaduras 4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 – 7.0 (Ricca et al., 2007). Singh
et al. (2007b), determinaron que la exo-inulinasa de Kluyveromyces marxianus YS-1
exhibió considerable actividad a un valor de pH óptimo de 5.5 en que mantuvo estable
su actividad catalítica al 100% durante 3 h a la temperatura óptima de 50 ºC. Se observa
que todavía existe la necesidad de investigar la actividad y estabilidad de la inulinasa
contra la temperatura, así como los modelamientos y simulación de procesos o cinética
de desactivación de la enzima.
Efecto de la temperatura:
La temperatura es un factor que puede influir considerablemente en la velocidad de la

reacción. Los pequeños cambios tienen una influencia considerable. La temperatura
óptima para la mayoría de las reacciones está entre los 30 a 40º C.
Cuando la temperatura llega a cierto valor variable, según la enzima de que se trate,
esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de las reacciones comienza a disminuir.
La temperatura óptima es la resultante de dos procesos: el incremento de la velocidad
de reacción con la temperatura y el incremento de la desnaturalización térmica de la
enzima por encima de la temperatura crítica. La mayor parte de las enzimas se inactivan
a temperaturas superiores a 55 – 60º C. es por ello que en la presenta práctica se trabajó
a una temperatura de 55 ºC.
UNIDAD III 43
UNIDAD
III
Efecto del pH:
La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad es

máxima. Ese pH se llama pH óptimo. Por encima y por debajo de este pH la actividad
declina.
La curva de actividad de la Enzimas con el pH tiene generalmente una forma

acampanada.
Cuando los valores de pH son muy ácidos o muy alcalinos, no solo se modifica el sitio
activo, sino que se altera la estructura terciaria de toda molécula, pudiendo llegar a la
desnaturalización y no habrá actividad enzimática. Mientras que en la práctica
utilizamos una solución tampón citrato-fosfato 0.05M a un pH de 5.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (ACTIVIDADES

VOLUMÉTRICA Y ESPECÍFICA) DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO.
Cinética enzimática:
Se entiende por cinética enzimática, el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los
factores que intervienen en la expresión de la actividad enzimática, evaluada a través de
la velocidad de la reacción catalizada.
Las variables más importantes en cinética enzimática son el tiempo de hidrólisis, la

concentración de enzima, de sustrato y la temperatura Ahora, calculamos la actividad
enzimática, a partir de:
𝒈 𝟏𝟎𝟔 𝝁𝒎𝒐𝒍 𝑳 𝟏𝝁𝑰

𝒂𝒗 = 𝑷𝒆𝒏𝒅𝒊𝒆𝒏𝒕𝒆 ∗ 𝑽(𝒎𝒍) ∗ ∗ ∗ ∗
𝑳 ∗ 𝒎𝒊𝒏 𝟏𝟖𝟎𝒈 𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝒍 𝝁𝒎𝒐𝒍
𝒎𝒊𝒏
UNIDAD III 44
UNIDAD
III
18 18
y = 1.535x + 1.4494 y = 1.4894x + 0.6554 y = 0.7102x + 0.689
16 R² = 0.9782 16 R² = 0.9804 R² = 0.9713
14 14
12 12
y = 0.965x + 0.6846
10
P (g/L)
10
P (g/L)
R² = 0.9982
y = 0.5886x + 0.3129
8 8
R² = 1
6 6
4 4 y = 0.4044x + 0.0775
y = 0.3806x + 1.0745 R² = 0.9957
2 2
R² = 0.9838
0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25
Tiempo (min) Tiempo (min)
A-3 1:4 A-2 1:2 A-1 1:1 B-3 1:4 B-2 1:1 B-1 1:2 C-2 1:3
TABLA A.4-GRUPO A: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA TABLA A.5-GRUPO B: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA
(SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) GRÁFICA (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
PENDIENTE PENDIENTE t (min) PENDIENTE PENDIENTE e t (min)

DILUCION DILUCION
RL (g/l.hr.) e (g/l) linealidad RL (g/l.hr.) (g/l) linealidad
A-1 E 1:1 1.5350 0.2169 10 B-2 E 1:1 1.4894 0.3797 10
A-2 E 1:2 0.9650 0.2169 10 B-1 E 1:2 0.7102 0.3797 20
A-3 E 1:4 0.3806 0.2169 15 C-2 E 1:3 0.5886 0.3797 10

B-3 E 1:4 0.4044 0.3797 15
UNIDAD III 45
UNIDAD
III
6.000
5.000
4.000
y = 0.3432x + 0.3719
P (g/L)
R² = 0.9844
3.000
2.000
1.000
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)
Series2 Linear (Series2)
TABLA A.6-GRUPO C: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA
(SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
PENDIENTE RL t (min)
DILUCION PENDIENTE e (g/l)
(g/l.hr.) linealidad
C-3 E 1:5 0.3432 0.0545 15
La actividad volumétrica se determina para los rangos de linealidad, indicando la

cantidad de enzima que es capaz de transformar 1 micromol de sustrato en un
minuto.
La actividad específica se determina para los rangos de linealidad, indicando que

para cada miligramo de proteína hay una cantidad de enzimas que transforman 1
micromol de sustrato en un minuto
Ahora, si queremos determinar la actividad específica, tendremos que determinar
la concentración de enzima en mg/ml, a partir de:
UNIDAD III 46
UNIDAD
III
CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO A)
ABS= A(PROTEINA) + B
y = 0.4187x - 0.0068
Donde:
A: PENDIENTE=8.0803
B: INTERCEPTO=0.1062
Así tendremos:
𝐴𝐵𝑆 + 0.0068
𝑃𝑅𝑂𝑇𝐸𝐼𝑁𝐴(𝑔/𝐿) =
0.4187
Tiempo (hr) mg Proteina/L caldo CONCENT PROTEINA ABS(595nm)

(g/L)
0 154.765 0.155 0.058
2 133.270 0.133 0.049
4 116.551 0.117 0.042
6 83.114 0.083 0.028
8 319.561 0.320 0.127
10 142.823 0.143 0.053
12 321.949 0.322 0.128
24 209.697 0.210 0.081
26 114.163 0.114 0.041
28 221.638 0.222 0.086
30 216.862 0.217(PROMEDIO) 0.084
 Entonces, tendremos que:
DILUCION PENDIENTE PENDIENTE ACVTIVIDAD A.E

RL (g/l.min.) E (g/l) (UI/ml) (UI/mg)
A-1 E 1:1 1.5350 0.2169 25.583 25.583
A-2 E 1:2 0.9650 0.2169 16.084 32.168
A-3 E 1:4 0.3806 0.2169 6.343 25.373
UNIDAD III 47
UNIDAD
III
CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO B)

y = 0.4187x - 0.0068
Donde:
A: PENDIENTE= 0.4187
B: INTERCEPTO= -0.0068
Así tendremos:
𝑔 𝐴𝐵𝑆 + 0.0068
𝑃𝑅𝑂𝑇𝐸𝐼𝑁𝐴 ( ) =
𝐿 0.4187
Dilucion Tiempo mg Proteina/L caldo CONCENT ABS(595nm)

(hr) PROTEINA (g/L)
1:1 0 147.600 0.148 0.055
1:3 2 306.663 0.307 0.036
1:5 4 379.747 0.380(PROMEDIO) 0.025

B-2 E 1:1 1.4894 0.3797 24.8234 24.8234
B-1 E 1:2 0.7102 0.3797 11.8375 23.6750
C-2 E 1:3 0.5886 0.3797 9.8104 29.4311
B-3 E 1:4 0.4044 0.3797 6.7402 26.9610
UNIDAD III 48
UNIDAD
III
CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO C)

y = 0.4187x - 0.0068
Donde:
A: PENDIENTE= 0.4187
B: INTERCEPTO= -0.0068
Así tendremos:
𝑔 𝐴𝐵𝑆 − 0.0068
𝑃𝑅𝑂𝑇𝐸𝐼𝑁𝐴 ( ) = −
𝐿 0.4187
Dilucion Tiempo mg Proteina/L caldo CONCENT ABS(595nm)

(hr) PROTEINA (g/L)
"1:1" 0 95.056 0.095 0.033
"1:2" 2 95.056 0.095 0.033
"1:3" 4 133.270 0.133 0.049
"1:4" 6 54.454 0.054(PROMEDIO) 0.016

C-3 E 1:5 0.3432 0.0545 5.720 28.600
FIGURA A.3 – GRUPO A,B y C: PERFIL Que muestra la actividad específica versus
concentración de enzima de la SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L.
UNIDAD III 49
UNIDAD
III
30.000
25.000
Actividad (UI/mg)
20.000
15.000
10.000
5.000
0.000
E 1:1 E 1:1 E 1:2 E 1:2 E 1:3 E 1:4 E 1:4 E 1:5
CONCENTRACION DE ENZIMA
[ ] de Enzima av (UI/ml) ae (UI/mg)

A-1 E 1:1 25,583 25,583
B-2 E 1:1 24,8234 24,8234
A-2 E 1:2 16,084 32,168
B-1 E 1:2 11,8375 23,6750
C-2 E 1:3 9,8104 29,4311
B-3 E 1:4 6,7402 26,9610
A-3 E 1:4 6,343 25,373
C-3 E 1:5 5,720 28,600
La Gráfica anterior nos indica que la actividad catalítica de la enzima no sólo se ve

afectada por el tiempo, sino también va disminuyendo conforme la concentración
de la misma disminuya en el medio, ya que mientras más diluida se encuentre
menor será el poder catalítico. Por otro lado, si la concentración de la enzima
aumenta la actividad aumenta.
Es decir la actividad se hace mayor cuando el extracto enzimático no está diluido,
pero cuando se hace diluciones, la actividad disminuye. Esto se hace
principalmente con el fin de poder obtener mayor linealidad a cualquier
concentración de enzima, empleando menores tiempos.
UNIDAD III 50
UNIDAD
III
2. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFOR

1. GRUPO A
La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentración
conocida de una solución estándar de albumina suero de bovino y
analizadas según este procedimiento
sol. Std TAMPON CONCENT Absorbancia Absorbancia

Nº
(µl) (µl) PROTEINA (g/L) leída 595 nm corregida
1 100 0 0.5 0.796 0.219
2 80 20 0.4 0.729 0.152
3 60 40 0.3 0.683 0.106
4 50 50 0.25 0.667 0.090
5 40 60 0.2 0.657 0.080
6 20 80 0.1 0.617 0.040
7 10 90 0.05 0.589 0.012
8 0 100 0 0.577 0.000
0.250
y = 0.4187x - 0.0068
0.200 R² = 0.9825
0.150
Absorbancia
CURVA DE CALIBRADO DE
0.100 BRADFORD
Linear (CURVA DE
CALIBRADO DE BRADFORD)
0.050
0.000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-0.050
[] g/L
Representación lineal de absorbancia, con respecto a la concentración de

albúmina en cada tubo.
UNIDAD III 51
UNIDAD
III
PARA DETERMINAR:
mg (enzima )
e ሾ ሿ𝐠/𝐋 =
𝐀𝐁𝐒 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟔𝟖
ml(enzima ) 𝟎. 𝟒𝟏𝟖𝟕
Conc. Proteína a 30h 0.216861715
Nº Tiempo mg Proteína/L caldo CONCENT ABS(595nm)

(hr) PROTEINA
(g/L)
1 0 154.765 0.155 0.058
2 2 133.270 0.133 0.049
3 4 116.551 0.117 0.042
4 6 83.114 0.083 0.028
5 8 319.561 0.320 0.127
6 10 142.823 0.143 0.053
7 12 321.949 0.322 0.128
8 24 209.697 0.210 0.081
9 26 114.163 0.114 0.041
10 28 221.638 0.222 0.086
11 30 216.862 0.217 0.084
0.14
0.12 y = 0.4187x - 0.0068

R² = 1
0.1
0.08
ABS
0.06
0.04
0.02
0
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350
[ ]P
UNIDAD III 52
UNIDAD
III
2. GRUPO B
Absorbancia
Nº sol. Std (µl) TAMPON (µl) CONCENT PROTEINA (g/L) Absorbancia leida
corregida
1 100 0 0.5 0.796 0.219
2 80 20 0.4 0.729 0.152
3 60 40 0.3 0.683 0.106
4 50 50 0.25 0.667 0.090
5 40 60 0.2 0.657 0.080
6 20 80 0.1 0.617 0.040
7 10 90 0.05 0.589 0.012
8 0 100 0 0.577 0.000
0.250
y = 0.4187x - 0.0068
0.200 R² = 0.9825
0.150
Absorbancia
0.100 BRADFORD
Linear (CURVA DE
CALIBRADO DE BRADFORD)
0.050
0.000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-0.050
[] g/L
PARA DETERMINAR:
𝐀𝐁𝐒 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟔𝟖
ሾ ሿ𝐠/𝐋 =
𝟎. 𝟒𝟏𝟖𝟕
UNIDAD III 53
UNIDAD
III
Conc. Proteina a 30h 0.379746835
Tiempo CONCENT
Nº mg Proteina/L caldo ABS(595nm)
(hr) PROTEINA (g/L)
1 0 147.600 0.148 0.055
2 2 306.663 0.307 0.036
3 4 379.747 0.380 0.025
a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia
0.06
0.05
0.04
ABS
0.03
0.02 y = -0.0001x + 0.0742

R² = 0.9967
0.01
0
0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000
P (Mg proteina/Lcaldo)
b) Mg de proteínas vs. Absorbancia
0.06
0.05
0.04
ABS
0.03
y = -0.1276x + 0.0742
0.02 R² = 0.9967
0.01
0
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400
[ ]P
UNIDAD III 54
UNIDAD
III
3. GRUPO C
Absorbancia
Nº sol. Std (µl) TAMPON (µl) CONCENT PROTEINA (g/L) Absorbancia leida
corregida
1 100 0 0.5 0.796 0.219
2 80 20 0.4 0.729 0.152
3 60 40 0.3 0.683 0.106
4 50 50 0.25 0.667 0.090
5 40 60 0.2 0.657 0.080
6 20 80 0.1 0.617 0.040
7 10 90 0.05 0.589 0.012
8 0 100 0 0.577 0.000
0.250
y = 0.4187x - 0.0068
0.200 R² = 0.9825
0.150
Absorbancia
0.100 BRADFORD
Linear (CURVA DE
0.050 CALIBRADO DE BRADFORD)
0.000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-0.050
[] g/L
PARA DETERMINAR:
𝐀𝐁𝐒 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟔𝟖
ሾ ሿ𝐠/𝐋 =
𝟎. 𝟒𝟏𝟖𝟕
UNIDAD III 55
UNIDAD
III
Conc. Proteina a 30h 0.054454263
Nº Tiempo (hr) mg Proteina/L caldo CONCENT PROTEINA (g/L) ABS(595nm)

1 0 95.056 0.095 0.033
2 2 95.056 0.095 0.033
3 4 133.270 0.133 0.049
4 6 54.454 0.054 0.016
a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia
0.06
0.05 y = 0.4187x - 0.0068

R² = 1
0.04
ABS
0.03
0.02
0.01
0
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140
[ ]P
b) Mg de proteínas vs. Absorbancia
0.06
0.05
0.04 y = 0.0004x - 0.0068

R² = 1
ABS
0.03
0.02
0.01
0
0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000
P (Mg proteina/Lcaldo)
UNIDAD III 56
UNIDAD
III
# Muestra Sol. A (ml) Sol. B (ml) Sol. C (ml) Conc. Sacarosa (g/L)
1 26 1 3 2,00
2-A 23 1 6 4,00
3-B 20 1 9 6,00
4-C 18 1 11 7,33
5-A 15 1 14 9,33
6-B 12 1 17 11,33
7-C 9 1 20 13,33
8-A 6 1 23 15,33
9-B 3 1 26 17,33
10 - C 0 1 29 19,33
ABSORBANCIAS
min
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0,079 0,098 0,146 0,149 0,092 0,141 0,109 0,369 0,201
2 0,136 0,141 0,103 0,148 0,102 0,050 0,05 0,058 0,087
6 0,291 0,352 0,278 0,326 0,204 0,125 0,181 0,161 0,235
10 0,407 0,503 0,450 0,508 0,292 0,185 0,282 0,259 0,410
15 0,557 0,708 0,670 0,782 0,439 0,260 0,408 0,404 0,598
Reemplazando en: Concentraciones de sustrato (g/l):
𝑨𝑩𝑺 = 𝟎. 𝟔𝟎𝟏𝟐(𝑨𝒁𝑼𝑪𝑨𝑹𝑬𝑺 𝑹𝑬𝑫𝑼𝑪𝑻𝑶𝑹𝑬𝑺 (𝒈/𝒍)) + 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟕
𝑨𝑩𝑺 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟕
𝒂𝒛𝒖𝒄𝒂𝒓𝒆𝒔 𝒓𝒆𝒅𝒖𝒄𝒕𝒐𝒓𝒆𝒔 = × 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏
𝟎. 𝟔𝟎𝟏𝟐
Para obtener la concentración de productos, así tendremos
PRODUCTOS
min
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0,014 0,146 0,112 0,130 0,126 0,104 0,064 0,565 0,203
2 0,806 0,870 0,750 1,138 1,142 0,578 0,769 0,972 1,372
6 1,837 2,273 2,206 2,618 2,499 1,576 2,948 2,685 3,833
10 2,609 3,278 3,636 4,132 3,670 2,374 4,628 4,315 6,744
15 3,607 4,642 5,466 6,411 5,626 3,372 6,724 6,727 9,871
UNIDAD III 57
UNIDAD
III
A
8.000
7.000
Products (g/L) 6.000
5.000 y = 0.4092x + 0.1851
y = 0.4517x + 0.0456
4.000 A1
3.000 A2
2.000 A3
y = 0.2328x + 0.238
1.000
0.000
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
B
8.000
7.000
6.000 y = 0.4169x + 0.3014 y = 0.3543x + 0.2742
Products (g/L)
5.000
4.000 B1
3.000 B2
y = 0.2976x + 0.2774
2.000 B3
1.000
0.000
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
C
12.000
10.000
Products (g/L)
8.000
y = 0.6515x + 0.105 y = 0.3584x + 0.0683
6.000 C1
4.000 C2
C3
2.000
y = 0.2181x + 0.1608
0.000
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
UNIDAD III 58
UNIDAD
III
# Muestra S(gr/L) V (g/l*min)

1 2,00000
2 –A1 4,00000 0,23279
3-B1 6,00000 0,29763
4-C1 7,33333 0,35844
5.A2 9,33333 0,40919
6-B2 11,33333 0,35430
7-C2 13,33333 0,21814
8-A3 15,33333 0,45171
9-B3 17,33333 0,41688
10-C3 19,33333 0,65147
Determinacion de V
12.000
10.000 A1
B1
8.000
Producto (g/L)
C1
A2
6.000
B2
4.000 C2
A3
2.000
B3
0.000 C3
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo(min)
Si la concentracion de la Enzima aumenta, la actividad aumenta. Asimismo si se

tiene una mayor concentracion de sustrato, la velocidad de reaccion aumenta, esto
debido a que la enzima tendra un mayor poder catalítico, esto se debe a que existira
un mayor numero de sitios activos mientras mas sustrato se tenga. En el caso de una
concentracion de sacarosa 4 g/l tiene mas velocidad de reaccion.
La forma de la curva representa la velocidad de formacion de productos en el
tiempo a diferentes concentraciones de enzima, los cuales demuestran que a una
mayor concentracion de enzimas el rango de linealidad de reaccion es mayor y por
lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante mas tiempo.
UNIDAD III 59
UNIDAD
III
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de

catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la
concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una
determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la
reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S],
como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima
se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará
en ningún caso, independientemente de la [S].
Otros muchos factores ambientales pueden afectar la actividad enzimática; éstos
incluyen la fuerza iónica del medio, la presión (especialmente si uno de los
reactivos es gaseoso), los buffers empleados, la pureza de los reactivos y de la
enzima, etc. Todos ellos deben determinarse experimentalmente, o por lo menos
escogerse arbitrariamente y mantenerlos constantes durante cualquier estudio
enzimático
PARAMETROS CINETICOS Vmax Y Kmax
Las velocidades intrínsecas de reacción dependen de los parámetros cinéticos de

las células o enzimas. Por ejemplo, la velocidad de reacción para una enzima
inmovilizada que obedezca la cinética de Michelis – Menten depende de los valores
de Vmax y Kmax para la enzima para su estado inmovilizado.
Estos parámetros son los que a veces se denomina parámetros cinéticos
verdaderos o parámetros cinéticos intrínsecos. Debido a que los parámetros
cinéticos pueden alterarse durante la inmovilización como resultado del daño
producido a la célula o enzima, así como los debidos al cambio de configuración o
al impedimento esférico, los valores medidos antes de la inmovilización pueden no
aplicarse.
Desafortunadamente, los parámetros cinéticos intrínsecos para biocatalizadores
inmovilizados son difíciles de determinar porque las velocidades de reacción
medidas incluyen los efectos de la transferencia de materia.
El modelo cinético se ajusta a la ecuación:
v = Vmax [S] / (Km + [S])
Dónde:
Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad del enzima por su sustrato, y
Vmax es la velocidad máxima e indica la capacidad catalítica.
La determinación de los anteriores parámetros cinéticos (Vmax y km) se puede

realizar utilizando las representaciones de Lineweaver-Burk (1/v : 1/[S])
Los valores de Km de las enzimas varían ampliamente. Para la mayoría de las

enzimas Km varía entre 10-1 y 10-6 M. El valor de Km para una enzima depende de
cada sustrato particular y también de las condiciones ambientales como la
UNIDAD III 60
UNIDAD
III
temperatura y la fuerza iónica. Km es la concentración de sustrato a la cual la

mitad de los centros activos están ocupados, Km se relaciona con la constante de
velocidad de las etapas individuales. Un km alto indica una unión débil, un Km bajo
indica una unión fuerte. Km indica la afinidad del complejo ES. La Vmax revela
además el número de recambio de una enzima, si se conoce la concentración de los
centros activos. Los números de recambio de la mayoría de las enzimas para
sustratos fisiológicos oscilan entre 1 y 104 por segundo.
A continuación se harán el análisis de los parámetros Kmax y Vmax trabajados en
los diferentes grupos.
Así tenemos:
# Muestra S(gr/L) V (g/l*min) 1/S 1/V

1 2,00000 0,50000
2 - A1 4,00000 0,23279 0,25000 4,29565
3 - B1 6,00000 0,29763 0,16667 3,35982
4 - C1 7,33333 0,35844 0,13636 2,78984
5 - A2 9,33333 0,40919 0,10714 2,44383
6 - B2 11,33333 0,35430 0,08824 2,82243
7 - C2 13,33333 0,21814 0,07500 4,58429
8 - A3 15,33333 0,45171 0,06522 2,21383
9 - B3 17,33333 0,41688 0,05769 2,39878
10 - C3 19,33333 0,65147 0,05172 1,53498
DIAGRAMA DE LINEWEAVER-BURK
5.00000
y = 8.9604x + 1.9445
4.50000
R² = 0.3435
4.00000
3.50000
3.00000
1/V
2.50000
2.00000 Series1
1.50000
1.00000
0.50000
0.00000
0.00000 0.05000 0.10000 0.15000 0.20000 0.25000 0.30000
1/S
UNIDAD III 61
UNIDAD
III
Se tomaron valores que no arrojen error, fueron los siguientes:
Muestra 1/S 1/V

2 –A1 0,2500 4,2956
3-B1 0,1667 3,3598
4-C1 0,1364 2,7898
5.A2 0,1071 2,4438
10-C3 0,0517 1,5350
Diagrama de Lineweaver-Burk
6.00000
4.00000 y = 13.931x + 0.9014

R² = 0.9914
2.00000
0.00000
-1.00000 -0.80000 -0.60000 -0.40000 -0.20000 0.00000 0.20000 0.40000
-2.00000
1/S
Series1
-4.00000
Linear (Series1)
-6.00000
-8.00000
-10.00000
-12.00000 1/v
X Y
0,0500 1,5349
0 0,9014
0,0647 0
𝟏
= 𝟎, 𝟗𝟎𝟏𝟒 Vmax = 1,10939
𝑽𝒎
−𝟏 Kmax = 15,4548
= 𝟎, 𝟎𝟔𝟒𝟕
𝑲𝒎
UNIDAD III 62
UNIDAD
III
Los valores de Kap y/o Vap están en función de la concentración de otros

efectores, por ello el diseño experimental realizado, debe considerar mediciones de
velocidad de reacción a distintas combinaciones de concentraciones de éstos.
Determinamos los parámetros cinéticos de la enzima, dando como resultado Kap =
15,4548 gr/L, el valor del Vap que fue de 1,109339 gr/*min.
Estos mismos pueden ser afectados por las temperatura y pH, además de
inhibidores que puede contener el propio caldo.
UNIDAD III 63
UNIDAD
III
3. MONTAJE DEL SISTEMA MINI-REACTOR CON ENZIMA INULINASA

INMOVILIZADA
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la

enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que
retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se
restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de
enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte.
La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En

primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima
inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que
intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores,
cofactores, activadores, etc.) se encuentran en internase: en el medio de reacción y
en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad
enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusiones, esférico y del
microentorno.
Cinética:
Un gran número de investigadores han tratado de encontrar medios para utilizar
una cinética tipo Michaelis-menten y explicar la acción de las enzimas
inmovilizadas. Estos estudios han concluido que existen diversos factores que
afectan directamente a la cinética de este tipo de enzimas.
La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte,
la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y
muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de
agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la
cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.
Comportamiento del reactor enzimático por lotes:

Reactor Enzimático:
El reactor enzimático es la unidad de proceso en la que se efectúa la conversión de

sustratos a productos, bajo condiciones ambientales controladas. La operación de
un reactor enzimático puede ser por lotes o continua. La modalidad por lotes,
tradicional emplea generalmente enzimas libres en solución y utiliza equipos del
tipo tanque agitado.
Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética

de la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos
tipos de reactor; sólo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales,
generalmente se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales.
UNIDAD III 64
UNIDAD
III
Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se

puede obtener la ecuación integrada entre el tiempo cero al tiempo t:
Donde t = tiempo para alcanzar la conversión X
Se pueden obtener ecuaciones similares para una cinética de tipo Michaelis-

Menten reversible, para casos de inhibición competitiva por producto e inhibición
por sustrato.
Como:
Vmáx = ke
Kmáx = k
Curva de calibrado DNS
Concentracion ABS 540 nm

(g/L)
2 1.063
1.6 0.842
1.2 0.627
0.8 0.393
0.4 0.212
0.2 0.095
0 0
UNIDAD III 65
UNIDAD
III
CURVA CALIBRADO DNS

1.2
y = 0.5319x - 0.0094
Absorbancias a 540 nm 1 R² = 0.9992
0.8
0.6
Series1
0.4
Linear (Series1)
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-0.2
concentracion (g/L)
Obtenemos la ecuación de la curva de calibrado de DNS:
Y = 0.5319 X – 0.0094
Del seguimiento de inmovilización de inulinasa en geles, obtenemos las sgtes

absorbancias por el método DNS, para determinar azucares reductores:
GRUPO A
tiempo (h) ABS 540 Factor P (g/L) P' (g/L)

nm Dilucion
0 0.168 01:01 0.33352 0
0.5 0.724 01:10 1.37883 8.785485
1 0.688 01:15 1.31115 14.6644
1.5 0.808 01:15 1.53676 18.04850
2 0.837 01:15 1.59128 18.86632
2.5 0.839 01:15 1.59504 18.92272
3 0.843 01:15 1.60256 19.03553
3.5 0.845 01:15 1.60632 19.09193
4 0.878 01:15 1.66836 20.02256
UNIDAD III 66
UNIDAD
III
35
30 y = 4.6434x + 10.468
R² = 0.6185
25
20
P (g/L)
15
10
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
t (h)
En la figura se puede notar que durante las primeras 2 horas la formación

de producto (glucosa+fructosa) va en aumento, y a partir de las siguiente
horas, pasado las 2 horas la producción va disminuyendo esto debido la
inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas.
En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la
enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los
componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos,
productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en
interface: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con
la enzima. El tiempo también puede afectar ya que la enzima actua por
tiempos cortos, luego de esto pierde su poder catalítico.
GRUPO B
tiempo (h) ABS Factor P (g/L)

540 nm Dilucion
0 0.153 01:01 0.30532 0
0.5 0.272 01:10 0.52905 4.985147
1 0.279 01:15 0.54221 7.827787
1.5 0.429 01:15 0.82422 12.05790
2 0.454 01:15 0.87122 12.76292
2.5 0.474 01:15 0.90882 13.32694
3 0.494 01:15 0.94642 13.89095
3.5 0.542 01:15 1.03666 15.24459
UNIDAD III 67
UNIDAD
III
4 0.591 01:15 1.12878 16.62643
20
18 y = 3.6893x + 3.6737
tiempo (h) ABS 540 Factor P (g/L)
16 R² = 0.8712
nm Dilucion
14 0 0.064 01:01 0.138 0
120.5 0.27 01:05 0.52529 5.25287
P (g/L)
10 1 0.254 01:10 0.49521 7.42809

8
1.5 0.258 01:10 0.50273 7.54089
6
2 0.34 01:10 0.65689 9.85336
4
2.5 0.344 01:10 0.66441 9.96616
2
3 0.416 01:10 0.79977 11.9966
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
tiempo (hr)
En la figura se puede notar que durante el transcurso de las horas la

producción de azucares reductores es casi líneal. Además, la cinética de
todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte, la del
sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y
muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las
velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel
importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.
GRUPO C
UNIDAD III 68
UNIDAD
III
3.5 0.417 01:10 0.80165 12.0248

4 0.486 01:10 0.93138 13.9707
16
14 y = 2.907x + 2.8718
R² = 0.9004
12
10
p (g/L)
8
6
4
2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
t (hr)
En la figura se puede notar que durante el transcurso de las horas la

producción de azucares reductores es lineal, sin embargo se genera menos
producto ya que se trabaja con menos concentración de sustrato. La
inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la
estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y
separarla fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos.
Comportamiento y diseño de reactor enzimático por lotes agitado
UNIDAD III 69
UNIDAD
III
Ecuación de comportamiento de reactor por lotes o discontinuo:
Si/K (x) - Ln(1-x) = (k.e.t)/K
GRUPO A
De la ecuación de la curva de DNS, hallamos la concentración de producto, y con

ellos el valor de la conversión a cada concentración de sustrato inicial.
Si= 20 g/L
DILUCIÓN Tiempo Abs (540 P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) X

(min) nm)
01:01 0 0.168 0.333521339 5.002820079 0 0
01:10 0.5 0.724 1.378830607 13.78830607 8.785485994 0.4392743
01:15 1 0.688 1.311148712 19.66723068 14.6644106 0.73322053
01:15 1.5 0.808 1.536755029 23.05132544 18.04850536 0.902425268
01:15 2 0.837 1.591276556 23.86914834 18.86632826 0.943316413
01:15 2.5 0.839 1.595036661 23.92554992 18.92272984 0.946136492
01:15 3 0.843 1.602556872 24.03835307 19.03553299 0.95177665
01:15 3.5 0.845 1.606316977 24.09475465 19.09193457 0.954596729
01:15 4 0.878 1.668358714 25.02538071 20.02256063 1.001128032
GRUPO B
Si= 30 g/L

(h) nm)
01:01 0 0.153 0.305320549 0.305320549 0 0
01:10 0.5 0.272 0.529046813 5.290468133 4.985147584 0.249257379
01:15 1 0.279 0.542207182 8.133107727 7.827787178 0.391389359
01:15 1.5 0.429 0.824215078 12.36322617 12.05790562 0.602895281
01:15 2 0.454 0.871216394 13.06824591 12.76292536 0.638146268
01:15 2.5 0.474 0.908817447 13.6322617 13.32694115 0.666347058
01:15 3 0.494 0.9464185 14.1962775 13.89095695 0.694547847
01:15 3.5 0.542 1.036661027 15.5499154 15.24459485 0.762229742
01:15 4 0.591 1.128783606 16.93175409 16.62643354 0.831321677
UNIDAD III 70
UNIDAD
III
GRUPO C
Si= 20 g/L

(h) nm)
01:01 0 0.064 0.137995864 0.137995864 0 0
01:10 0.5 0.27 0.525286708 5.25286708 5.114871216 0.118497032
01:15 1 0.254 0.495205866 7.428087986 7.290092123 0.229241085
01:15 1.5 0.258 0.502726076 7.540891145 7.402895281 0.232822138
01:15 2 0.34 0.656890393 9.853355894 9.71536003 0.306233717
01:15 2.5 0.344 0.664410603 9.966159052 9.828163189 0.30981477
01:15 3 0.416 0.799774394 11.99661591 11.85862004 0.374273718
01:15 3.5 0.417 0.801654446 12.02481669 11.88682083 0.375168981
01:15 4 0.486 0.931378079 13.97067118 13.83267531 0.436942139
Valores para hallar ket/K
PARAMETROS VALOR UNIDADES

k 186.187459 h-1
e 35.0667667 g/L
Kmax 16.09 g/L
Vmax 34.74432 g/L.h
UNIDAD III 71
UNIDAD
III
CURVA DE COMPORTAMIENTO DE REACTOR POR LOTES AGITADO
0.9 Si/K= 1.1187

0.8
Si/K = 1.2430
0.7
0.6
0.5
X
Si/K = 1.3052
0.4
0.3
0.2
0.1 Si= 18 g/L Si= 20 g/L Si= 21 g/L
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ket/K
En el grafico se puede observar que cuando el sustrato es mas alto, la conversión

de sustrato en producto es menor. Podemos obervar que cuando el valor de si/k
= 1.1187, entonces hay menor cantidad de sustrato .conforme va aumentando la
carga enzimatica al transcurso del tiempo en el reactor. pero llega hasta un nivel
en donde el producto generado por la conversion de sustrato es casi constante.
con el valor de si/k =1.243, se aumento el sustrato, por ende se podria trabajar
con una cantidad de enzima mayor a la anterior. ahora cuando el valor de si/k =
1.3052 , la grafica que se muestra es casi lineal, por ende, jamas se llegaria a un
punto de saturacion.
Obtener el perfil de ket/K vs X es importante para determinar la conversión de

sustrato en productos en función de la velocidad máxima de reacción, el tiempo y
la constante de saturación; la gráfica X vs (ket/K) presenta un comportamiento
casi ideal en comparación a los curvas características de un reactor enzimático
por lote.
Esto nos permite elaborar un esquema que prefiere el comportamiento real de

un reactor agitado a diferentes concentraciones de sustrato inicial.
UNIDAD III 72
UNIDAD
III
Un sistema con reactor enzimático por lotes que utiliza la isomerización de

la sacarosa (conversión en glucosa y fructosa), importante en la industria,
con inulinasa como catalizador. El propósito de la unidad es la demostración
de la cinética de las reacciones enzimáticas por lotes, y las características
de las enzimas. La reacción tiene lugar dentro de un recipiente agitado en el
que el agitador es una cesta porosa dentro de la cual la enzima queda
inmovilizada.
Los reactores discontinuos tienen la forma tradicional de reactor, como por

ejemplo los usados en cervecería, y son muy adecuados para el uso de enzimas
solubles, o cuando se requiere un volumen de producción pequeño o la producción
es infrecuente. En general consisten en un tanque donde se mezcla el substrato o el
enzima y una vez alcanzado el grado de reacción deseado el contenido del reactor
se descarga. Las desventajas de estos reactores discontinuos se deben a los
cambios en las condiciones de operación durante la reacción, por lo que requieren
un control más complejo de proceso. Otra dificultad es también el mantenimiento
de un buen grado de mezcla en reactores con mayor escala de producción, debido a
la imposibilidad de asegurar una entrada de potencia proporcional al aumento de
tamaño de reactor. Otros problemas que se presentan en los procesos discontinuos
son las variaciones en la calidad del producto, el tiempo de paso entre las
reacciones discontinuas, la demanda discontinua de servicios y equipo auxiliar y
trabajo, y también la imposibilidad de reutilizar el enzima o la tendencia a perderlo
durante su recuperación entre dos lotes (aunque también se puede usar de forma
semicontinua). Estas desventajas pueden ser secundarias especialmente cuando se
necesita una buena transferencia de masa o de gases.
Por ejemplo, le producción de acido 6-aminopenicilánico se hace en un reactor

discontinuo con agitación que contiene penicilina acilasa inmovilizada,
neutralizándose el ácido formado durante la reacción mediante la adición
continua de álcalis (Carleysmith y Lilly, 1979). En la industria el reactor que se
utiliza más frecuentemente es el de columna con flujo pistón. En varias
aplicaciones en sistemas discontinuos de los enzimas, como por ejemplo en la
producción de extracto de malta o en la industria cervecera, es necesario que
exista una actividad enzimática elevada durante la reacción y que no quede
enzima activo residual en el producto, lo que generalmente se consigue
incrementando la temperatura del reactor de forma que la ultimas moléculas de
substrato se consuman justo antes de que se desnaturalicen la ultimas moléculas
Los procesos discontinuos operan en sistemas cerrados de manera que el sustrato
sedeañade
enzima.
al comienzo del proceso y los productos son retirados sólo al finalizar el
UNIDAD III 73
UNIDAD
III
mismo. Las reacciones aerobias no son operaciones discontinuas en el sentido

estricto de la palabra.
La baja solubilidad del oxígeno en el medio acuoso significa que éste debe
suministrarse de manera continuada mientras se elimina el dióxido de carbono y
otros gases producidos en el proceso. Sin embargo, los reactores en los que no
existe ni entrada ni salida de líquidos se consideran como discontinuos. Si no
existen fugas o evaporación en el reactor, el volumen de líquido en los reactores
discontinuos puede considerarse constante.
Figura. Esquema de un reactor enzimático por lotes discontinuo agitado.
UNIDAD III 74
UNIDAD
III
7.6. Diseño y montaje del sistema mini reactor con invertasa

inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la
enzima.
La forma usual de usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de

mediciones de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de
sacarosa en un reactor por lote. La manera más adecuada de obtenerlos es por
linealización de la ecuación cinética. Para ello emplearemos el método de los
inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple
𝐄 + 𝐒 ⇆ 𝐄 𝐒 → 𝐄 + 𝐏
Union del sustrato Etapa catalítica
Ks
V 
Ks
Métodos de linealización para determinar parámetros cinéticos
Método Eje Y Eje X Intercepto Intercepto Pendiente

Eje Y Eje X
Lineweaver – Burke 1/v 1/s 1/v -1/k k/V
Hames s/v S k/V -k 1/v
Eadie – Hofstee V v/s V v/k -k
1/v
KAP/VAP
1/VAP
-1/KAP 1/s
Figura 01: Determinación de parámetros cinéticos mediante método de inversos de

Lineweaver – Burke
UNIDAD III 75
UNIDAD
III
TÉCNICA EXPERIMENTAL
Sol. A: Buffer Citrato-fosfato 0,05 M, pH 5
Sol. B: Concentración enzimático inulinasa.
Sol. C: Solución sustrato sacarosa 20 g/L
Tabla 01: Técnica experimental para determinación de parâmetros cinéticos:

Concentración
Solución A Solución B Solución C
Nº muestra de sacarosa
(ml) (ml) (ml)
g/l
1 26 1 3
2 23 1 6
3 20 1 9
4 18 1 11
5 15 1 14
6 12 1 17
7 9 1 20
8 6 1 23
9 3 1 26
10 0 1 29
Tabla 02: Datos experimentales azucares DNS
DNS
min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
2
6
10
15
UNIDAD III 76
UNIDAD
III
VIII. BIBLIOGRAFIA
 GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial Acribia S.A;
ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.
 Guisan, J.M.; Bastida, A.; Balnco, R.M.; and Fernández-Lafuente, R. 1997 A.
Immobilization of enzymes on gíioxil-agarose: Strategies for enzyme stabilization
by multipoint attachment. En: immobilization of Enzymes and cells. 1, 277-287.
(Ed: Gordon, F.) Editorial: Bickerstaff. Humana Press Inc
 Guisan J.M; Polo, E.; Agudo, J.; Romero, M.D.; Alvaro, G. and Guerra, M.J. 1997 B.
Immobilization-stabiiization of termolysin onto activated agarose gels. Biocatal.
Biotransf. 15, 159-173.
 Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición. México,
edit. Alhomba, 1981
 SCRIBAN RENE; Biotecnologia Segunda Edicion 1985; Editorial El Manual
Moderno, S.A., de C.V. ; Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.
 Zhenming Chi & Zhe Chi & Tong Zhang & Guanglei Liu & Lixi Yue. Inulinase-
expressing microorganism and applications of inulinases. Appl Microbiol
Biotechnol, 82:211–220, enero 2009.
 https://davidbq3.wordpress.com/2013/04/15/ingenieria-de-enzimas-y-sus-
diversas-aplicaciones/
 http://digital.csic.es/bitstream/10261/2715/1/05200202.pdf
UNIDAD III 77
UNIDAD
III
MESES
ACTIVIDAD JUNIO JULIO
Martes 16 Jueves 25 Martes 30 Miércoles 1 Martes 7 Martes 14 Viernes 17 Jueves 23 Viernes 24
Recoleccion de materiales: (instrumentos,

reactivos esterilización)
X
Preparación de reactivos X
Obtención de curva de calibrado de
proteínas y de azúcares reductores DNS
X
Recolección de Guía e Información X

Presentación del pre-informe X
Obtención de un caldo crudo de
Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571
X X
Rango de Linealidad y Actividad Enzimática X

Determinación de los parámetros cinéticos
de la Enzima Soluble
X
Inmovilizar Inulinasa en Geles X
Diseñar y montar el sistema mini-reactor
con Enzima inmovilizada, para determinar X
los parámetros cinéticos de la enzima.
Presentación final del informe X

Sustentación de informes X
UNIDAD III 78
UNIDAD
III
ANEXOS
MÉTODO BRADFORD.
Un procedimiento simple para la determinación de la concentración de la proteína en
soluciones es el análisis de la proteína de Bradford que fue descrito primero por Bradford
(Bradford et el al., 1976).
Este método se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie blue G-250) cuyas
disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar
en contacto con la parte hidrofóbico del interior de una proteína se fija. Las proteínas se
unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de
extinción mayor que el colorante libre. La determinación del contenido proteico de una
muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos
a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de
calibración: a mayor cantidad de proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor
absorbancia, es por ello que se considera un cromóforo exógeno. Es un método que
depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las
proteínas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de
detergentes y líquidos orgánicos, ya que las proteínas pueden perder su estabilidad y
perder su forma nativa, lo que provocaría la perdida de la unión entre el cromóforo y la
zona hidrofóbica de las proteínas. Para determinar la concentración total de proteína se
realiza una curva de calibración empleando una proteína patrón que generalmente es la
seroalbumina bovina. Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de proteína y
otra disolución llamada “blanco” que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos
testigos se les mantiene constante el reactivo Bradford siendo los volúmenes de todos los
tubos iguales. Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a
una longitud de onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene
proteína) de esta manera se construye la gráfica de absorbancia vs concentración. GACESA
P. y HUBBLE J. Tecnología de Enzimas 1990
Preparación del reactivo:
- Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas

preparadas.
- Dejar a temperatura ambiente.
- Leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco.
- El color es estable 1 hora.
- Representa la curva estándar.
- Calcula el coeficiente de extinción.
Procedimiento:
- Se agrega 10 ml de agua destilada a cada uno de los tubos falcon que contienen las
muestras tras las diferentes centrifugaciones, y se remueve con una espátula para
poder diluir.2.
UNIDAD III 79
UNIDAD
III
- Se tomó 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se depositó en diferentes

alícuotas, a cada una de ellas se le adicionó 990 microlitros de agua destilada.3.
- Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10,
25,40, 50 y 60 microlitros, añadir agua destilada hasta tener un volumen de
200microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de Bradford.
- Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las diferentes
alícuotas, 2 muestras de cada alícuota, 190 microlitros de agua destilada y
800microlitros de reactivo de Bradford.
- Posteriormente se medirá la absorbancia a cada una de las soluciones que
contienen los tubos. Estas soluciones deberán ser depositadas en las celdas para
que puedan ser leídos por el espectrofotómetro. El tubo uno se tomará como
muestra blanco ya que no contiene albumina.
SCRIBAN RENE; Biotecnología Segunda Edición 1985
Comparación con otros métodos:
Este método de BRADFORD (con un rango de linealidad entre 1 y 1.5 ug) es derivado de
los colorímetros al igual que método de lowry, una de las ventajas de este método es que
es muy sensible pero al trabajar con detergentes muestra cierta interferencia. A
comparación del método de LOWRY que es o tiene bastante sensibilidad pero en el trabajo
muestra inconvenientes por que no todas las proteínas reaccionan igual, muestra muchas
interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc. Se forma un complejo
coloreado de cobre con el enlace peptídico, también se forma un derivado de las tirosinas
que contribuye a la absorbancia total. Emilio Fernández (Departamento de Bioquímica
y Biología Molecular). Suelter CH (1985).
MÉTODO DEL DNS
Los azúcares reductores son monosacáridos que poseen grupos carbonilos libres, que se
obtienen de la hidrólisis ácida y térmica de los polisacáridos. Además de ser la inulinasa
una enzima nativa de la levadura lechera Kluyveromyces marxianus, es especialmente
adecuada para la aplicación industrial, por tener la mejor velocidad de crecimiento que
cualquier otro microbio eucariote, termo tolerante, con habilidad para crecer sobre los 52
ºC, capacidad de asimilar un amplio rango de azúcares claves, como la lactosa e inulina y
una alta capacidad secretoria de enzimas líticas, hacen de éste microorganismo líder de
todas las levaduras para muchos procesos biotecnológicos. Kluyveromyces marxianus es
una especie que incorpora muchos sinónimos, se describe como una levadura homotálica,
hemiascomyceto, es filogenéticamente relacionada a Saccharomyces cerevisiae y es una
especie hermana de la mejor conocida Kluyveromyces lactis. (Lane y Morrissey, 2010).
Preparación del reactivo:
- Se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua.

- Paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un
agitador magnético y calentando.
UNIDAD III 80
UNIDAD
III
- Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL.

- Se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para
posteriormente aforar hasta 50 mL.
Procedimiento:
- Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

- Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a analizar.
- Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego
enfriar con agua helada.
- Añadir 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego agitar.
- Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
- La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de
calibrado.
- La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de
concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
Seminario, J.; Valderrama, M.; Manrique, I. 2003
 SEGÚN INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND

APPLICATIONS.PDF:
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a

numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido
para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la
información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones
sobre cada método de inmovilización (Tabla 2) y así, podremos seleccionar el
más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tener en
cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se
vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.
Tabla 2. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización
Inclusión en Adsorción Unión

Método Atrapamiento Reticulado
membranas química covalente
Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil
UNIDAD III 81
UNIDAD
III
Fuerza de Débil-
Débil Media Media Fuerte
Unión Media
Actividad
Media-Alta Baja Baja Media Alta
Enzimática
Regeneración
Posible Imposible Imposible Posible Difícil
Soporte
Coste Proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto
Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta
Validez General General Limitada General Limitada
Resistencia
SI SI SI NO NO
Microbiana
En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan

biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más
sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con
el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de
actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método
más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados
según las indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized
Biocatalysts (16):
Descripción general
1. Esquema de reacción
2. Enzimas a insolubilizar
3. Tipo de soporte empleado
4. Método de inmovilización
Preparación:
1. Condiciones de reacción
2. Rendimiento en peso seco
UNIDAD III 82
UNIDAD
III
3. Actividad residual del sobrenadante

CARACTERIZACIÓN DE
Caracterización físico-química:
UN DERIVADO
INMOVILIZADO
1. Configuración del biocatalizador
2. Grado de hinchamiento
3. Grado de compresibilidad en
columna
4. Abrasión en sistemas de agitación
5. Velocidad mínima de fluidización
Cinética:
1. Estabilidad de la enzima
almacenada
2. Estabilidad operacional
3. Posibilidad de reutilización
4. Grado de conversión
5. Limitaciones difusionales
 SEGÚN (LEE Y HUANG, 2000).
La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del

soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de
difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como
las velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un
papel importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.
A manera de ejemplo se presenta la tabla 1.1, en que se muestran los

cambios de KM al inmovilizar la enzima; Weetall informa de un caso muy
claro en que el valor de KM depende directamente del flujo del sustrato;
encontró que KM disminuye cuando el flujo aumenta, lo que explica que a
medida que se incrementa el flujo, la turbulencia también aumenta y
disminuye la capa estática del liquido alrededor de cada partícula, lo que
lógicamente reduce el efecto de transferencia de masa.
UNIDAD III 83
UNIDAD
III
Tabla 1.1 Comparación de valores de KM de algunas enzimas en solución e

inmovilizadas
KM (milimolar)
ENZIMA SUSTRATO SOLUCIÓN INMOVILIZADA
Invertasa Sacarosa 0.448 0.448
Arilsulfatasa p- 1.85 1.57
nitrofenilfosfato
Glucoamilasa Almidón 1.22 0.30
Ureasa urea 10.0 7.60
Glucosa oxidasa glucosa 7.70 6.80
L-amioacido L-leucina 1.00 4.00
oxidasa
Alcalino fosfatasa p- 0.10 2.90
nitrofenilfosfato
* Las enzimas están inmovilizadas en partículas de vidrio poroso (96% sílice)
SEGÚN (NGUYEN ET AL., 1999).
El reactor enzimático es la unidad de proceso en la que se efectúa la conversión

de sustratos a productos, bajo condiciones ambientales controladas. La
operación de un reactor enzimático puede ser por lotes o continua. La
modalidad por lotes, tradicional emplea generalmente enzimas libres en
solución y utiliza equipos del tipo tanque agitado.
Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la
cinética de la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido
considerados dos tipos de reactor; sólo resta por analizar el batch. Los otros
reactores, no ideales, generalmente se comportan en regiones delimitadas por
los casos ideales.
UNIDAD III 84
UNIDAD
III
SEGÚN LIBROS (Belcarz et al., 2002, Mátrai et al., 2000, Luxhoi et al.,
2002, Huang et al., 2003).
El proceso de inmovilización, especialmente cuando el enzima está atrapado en

un gel, copolimerizado o adsorbido o unido covalentemente dentro de los
poros de una matriz, puede ocasionar problemas difusionales que han de ser
considerados. Para que el sustrato pueda actuar, debe difundir desde la
disolución externa hasta la capa de líquido más bien estático que rodea la
partícula, y luego dentro del poro donde se localiza el enzima, y donde la
disolución es casi estancada. El producto debe difundir en el sentido inverso.
Estos efectos de transferencia de masa pueden crear problemas en el ensayo y
en el uso del sistema de enzima inmovilizado: las velocidades de difusión de
sustratos y productos suelen ser menores que la velocidad de reacción, y
constituyen el factor limitante de estos procesos, alterando en muchos casos
las expresiones cinéticas.
SEGÚN GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial

Acribia S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.
La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la

estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla
fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos. Dichas
ventajas pueden aplicarse a la producción de jarabes fructosados a partir de
sacarosa si se cuenta con un método para inmovilizar y un soporte barato,
que no afecte la especificidad de sustrato y la velocidad de reacción de la
invertasa (β-fructofuranosidasa EC: 3.2.1.26).
SEGÚN REACTORES ENZIMÁTICOS. PROFESOR AGUSTÍN LÓPEZ

MUNGUIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. UNIVERSIDAD
NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
La difusión externa es el transporte de sustratos hasta la superficie del

catalizador, y la liberación de los productos desde éste, y tiene lugar en los
procesos con poca o ninguna agitación. La constante de velocidad de difusión
UNIDAD III 85
UNIDAD
III
depende de la naturaleza del componente que se difunde, de las condiciones

de turbulencia en la vecindad de la partícula del catalizador y de las
propiedades de toda la mezcla.
La difusión interna es el transporte de los sustratos desde la superficie de la
partícula del catalizador a través de los poros del soporte hasta el centro activo
del enzima, y el recorrido contrario de los productos.
SEGÚN CINÉTICA ENZIMÁTICA. PROFESOR ANDRÉS ILLANES

FRONTAURA. ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA. UNIVERSIDAD
CATÓLICA DE VALPARAÍSO.
Gelificación ionotrópica; cuyo fundamento es la formación de redes con

reacción química (intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de
cadenas poliónicas con contraiones multivalentes.
El extracto enzimático se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un
polisacárido producido por algas soluble en agua, en una solución con iones
divalentes como el Ca2+ polimeriza ya que los iones producen
entrecruzamiento de los polisacáridos. Al polimerizar una solución de
alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas
que se generan
 Los resultados entre los grupos con las variaciones de diluciones difieren
debido a muchos factores entre ellos la preparación enzimática no es
homogénea lo que dificultó la interpretación de los datos.
 Workman y Day6 purificaron la inulinasa prabducida por Kluyveromices
fiagilis, encontrando que dicha enzima es una &coproteha con un contenido
de carbohldratos del 66% en peso, estable a 5OoC, con un pH óptimo de 4.5,
cuya actividad disminuye a temperaturas mayores de 55OC, con un PI de
aproximadamente 4.0. Estos autores sugieren que además de los estudios
de electroforesis, se debe considerar la determinación del punto
isoeléctrico (PI) como un parámetro para demostrar la pureza de. la
enzima. También determinaron los valores de Km de la inulinasa sobre
sacarosa (13.6 mM a pH 5.0) y sobre rafiiosa (46.1 mM a pH 5.0),
encontrando que la actividad enzimática es lntvbida por la configuración de
UNIDAD III 86
UNIDAD
III
furanosa de la fructosa, pero no mencionan el peso molecular de la enzima

purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco reportan datos
acerca de la determinación de la Km sobre inulina.
 En la presente práctica de laboratorio se realizaron los procedimientos para

un caso de biocatalisis enzimática utilizando inulinasa inmovilizada con
alginato de sodio al 2% y actuando con sacarosa como sustrato. Los
procedimientos incluyeron la determinación del rango de linealidad de la
enzima, los parámetros cinéticos de la enzima libre y el análisis del
comportamiento de un sistema minireactor por lotes.
 En la determinación del rango de linealidad, se observa que a partir de 10

minutos de reacción enzimática, la formación de producto decae
invariablemente en todos los casos analizados, alcanzándose un mayor
concentración de producto cuando el extracto enzimático esta menos
diluido
 La variación en la actividad enzimática de la invertasa puede deberse a su
condición de inmovilizada.
La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del

soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de
difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las
velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel
importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.
Weetall informa de un caso muy claro en que el valor de KM depende

directamente del flujo del sustrato; encontró que KM disminuye cuando el flujo
aumenta, lo que explica que a medida que se incrementa el flujo, la
turbulencia también aumenta y disminuye la capa estática del liquido
alrededor de cada partícula, lo que lógicamente reduce el efecto de
transferencia de masa.
Tabla 1.1 Comparación de valores de KM de algunas enzimas en solución e

inmovilizadas
UNIDAD III 87
UNIDAD
III
KM (milimolar)
ENZIMA SUSTRATO SOLUCIÓN INMOVILIZADA
Invertasa Sacarosa 0.448 0.448
Arilsulfatasa p- 1.85 1.57
nitrofenilfosfato
Glucoamilasa Almidón 1.22 0.30
Ureasa urea 10.0 7.60
Glucosa oxidasa glucosa 7.70 6.80
L-amioacido L-leucina 1.00 4.00
oxidasa
Alcalino fosfatasa p- 0.10 2.90
nitrofenilfosfato
* Las enzimas están inmovilizadas en partículas de vidrio poroso (96% sílice)
 Según “HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INULINASA INMOVILIZADA

EN NYLON-6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF”:
La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la
estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla
fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos. Dichas
ventajas pueden aplicarse a la producción de jarabes fructosados a partir de
sacarosa si se cuenta con un método para inmovilizar y un soporte barato,
que no afecte la especificidad de sustrato y la velocidad de reacción de la
inulinasa.
 Según INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND
APPLICATIONS.PDF: A menudo, la inmovilización altera significativamente
el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en
su estabilidad, además de que la enzima inmovilizada es un sistema
heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el
proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores,
activadores, etc.) el cual se encuentran en interface: en el medio de reacción
y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la
actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y
del microentorno
UNIDAD III 88
UNIDAD
III
 Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos

industriales para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o
alimentarios se ha recurrido al uso de enzimas. Éstas presentan grandes
ventajas sobre catalizadores no biológicos, entre ellas gran actividad
catalítica, a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran
especificidad de sustrato. La inestabilidad que presentan en los procesos
químicos industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y
productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan
reutilizar. Como alternativa se ideó el método de inmovilizarlas a un
soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea
rentable.
 Se denomina una “enzima inmovilizada” aquella que está físicamente

localizada en una región definida del espacio, manteniendo su actividad
catalítica y pudiendo ser usada repetida y continuamente.
Las ventajas del proceso:

a) aumento de la estabilidad
b) reutilización de los componentes
c) la enzima no permanece en la solución al finalizar el tratamiento y
d) diseño de reactores adaptables para cada enzima inmovilizada,
permitiendo un reciclado de producto que aumente su pureza.
Las desventajas:
a) alteración de la enzima respecto de su estado nativo
b) heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas proteínas inmovilizadas
c) pérdida de actividad
d) el sistema puede ser más caro que la enzima nativa.
 Los métodos de inmovilización se pueden clasificar en 2 grandes categorías:

1. Retención física.
UNIDAD III 89
UNIDAD
III
2. Unión química.
Retención física:
Atrapamiento: es la retención de la enzima en cavidades interiores de una
matriz sólida porosa constituida por prepolímeros entrecruzables o
polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno, carraginato o resinas de
poliuretano. Una suspensión de la enzima a inmovilizar se la incluye en una
solución del monómero. Se inicia la polimerización con cambio de
temperatura o adición de reactivo químico. El atrapamiento pueden ser
en geles o en fibras, más resistentes éstas últimas. No hay alteración
estructural de la enzima pero hay que vigilar el proceso de polimerización.
En la práctica de laboratorio se utilizó como soporte alginato de sodio al 2 %,

con ello se obtuvieron los “beads” luego de 2 horas. El alginato de sodio
absorbe el agua del medio, se gelatiniza y forman puentes de hidrogeno (H+).
También se utilizó CaCl2 (0.1 M) para gelificar los beads y hacerlos resistentes
a la fuerza de agitación. En los “beads” las enzimas quedan atrapadas,
algunos beads quedan en la superficie entonces hay que lavar con CaCl2 al
0.05 M. Los beads dejan salir los productos, la sacarosa se funde a traves de
los poros y se obtiene fructosa + glucosa, estos son cuantificados por el
método DNS para azucares reductores.
 La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente

se incrementa la estabilidad conformacional de las mismas (métodos de
uniones de tipo covalente y aún más, con la adición de grupos
bifuncionales), se aumenta la protección frente a proteasas y se evita la
agregación intermolecular. Se produce una alteración del microentorno de
la enzima debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que
enzimas sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean
favorecida su actividad cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza
iónica que tiene el entorno disminuye la concentración efectiva de oxígeno
en el medio. Pueden perder total o parcialmente la actividad por
interacciones con el soporte, por impedimento del paso del sustrato al sitio
UNIDAD III 90
UNIDAD
III
activo, por interacción con grupos cargados del soporte o por cambios
conformacionales que den formas inactivas. Otros cambios que afectan la
actividad enzimática, aumentándola o disminuyéndola, son producidos por
efectos de difusión del sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte
en el medio de reacción, por impedimentos estéricos o por efectos
electrostáticos entre el sustrato y el soporte) y por efectos en el
microentorno enzima-soporte.
 Cuando S/Km es bajo, es decir, cuando se ha tenido un grado de conversión
alto (o se ha usado una concentración de substrato baja) la velocidad de
reacción es de primer orden, y el tiempo de reacción requerido para
obtener un grado de conversión particular es directamente proporcional
de S/Km, la reacción es esencialmente de orden cero, y en este caso el
tiempo necesario para conseguir un grado de conversión dado que es
virtualmente independiente de S/Km. para que un proceso resulte útil a
nivel industrial se requiere usualmente un alto grado de conversión de
substrato en producto. Un enzima inmovilizado opera generalmente en
condiciones cinéticas de primer orden, en especial si se consideran las
altas densidades de enzima que con frecuencia se utilizan en las
preparaciones comerciales de enzimas inmovilizados. En estos casos el
tiempo requerido para conseguir un incremento relativamente pequeño
del grado de conversión depende claramente del valor de S/Km logrado en
la operación, de forma que este parámetro tiene gran importancia
experimental.
 Si se tienen en cuenta las ecuaciones que describen los reactores de flujo

pistón y los reactores continuos con agitación, las prestaciones de ambos
tipos de reactores son prácticamente idénticas cuando se usan
concentraciones elevadas de substrato y S>Km, mientras que a
concentraciones bajas de substrato S<Km, el reactor de fuljo pistón es de
20 a 30 veces más eficaz que el reactor continuo tipo tanque con agitación
se el grado de conversión necesario es alto, con la ventaja adicional de que
tiene una densidad mucho mayor de moléculas de enzima.
UNIDAD III 91
UNIDAD
III
 En los reactores en columna de relleno con flujo continuo, o e reactores

con agitación, se ha observado una importante relación entre la velocidad
de flujo a través del reactor (q) y el grado de conversión. La forma exacta de
estas curvas varia en función de factores como la extensión de inhibición
por el producto, aunque debería ser constante con el tamaño del reactor
siempre que las propiedades hidrodinámicas permanezcan inalteradas.
Cuando se usan valores altos de S/Km y grados de conversión bajos el
comportamiento de ambos reactores es casi siempre idéntico. Sin embargo,
con valores bajos de S/Km, cuando el orden de reacción es mayor que cero,
las prestaciones de los reactores tubulares son mas favorables, incluso en
gran proporción, comparadas con las de los reactores de mezcla completa.
En este caso, se pueden obtener grados de conversión altos a velocidades de
flujo mucho más altas en los reactores de flujo pistón que en los de mezcla
completa, en tanto que en otras formas de trabajo se obtienen valores
comparables.
UNIDAD III 92
UNIDAD
III
CONCLUSIONES
El Rango de Linealidad obtenido para la invertasa de levadura de panadería

(β-D-fructofuranosidasanos permitió conocer la actividad catalítica que tiene
la enzima a diferentes concentraciones, así como la afinidad que esta tiene
por el sustrato.
Las variables más importantes en la ingeniería de cinética enzimática son la
concentración de enzimas, de sustratos y productos (inhibidores,
activadores), el pH y la temperatura.
Se comprobó que la actividad o poder catalítico de la enzima disminuye con el
paso del tiempo de la enzima sometida al medio de reacción.
A mayor concentración de enzima hay mayor hidrólisis, y a mayor tiempo de
hidrólisis, hay más conversión de sacarosa en azúcares reductores.
Se determinó la actividad volumétrica para los rangos de linealidad,
indicando la cantidad de enzima que es capaz de transformar 1 micromol de
sustrato en un minuto.
En este estudio, se han determinado a la actualidad, un conjunto cepas de
Kluyveromyces marxianus con gran potencial biotecnológico para producir
inulinasa, pero la investigación para una fuente de inulina económicamente
interesante todavía está en curso. Desde un punto de vista industrial, el uso
de inulina como materia prima para la producción de inulinasa por
fermentación, se vislumbra como promisorio, sobre todo para el extracto de
yacon. Para propósitos de escalamiento del bioproceso será necesario tener
en cuenta que, la aireación y agitación son factores críticos para la
fermentación de Kluyveromyces maxianus, los que son responsables de la
viabilidad y producción enzimática. Se ha visto que hay necesidad de
investigar la actividad y estabilidad de la inulinasa frente a la temperatura,
modelando y simulando la cinética de desactivación. Los parámetros cinéticos
de la inulinasa están en función al tipo de microorganismo, las condiciones
ambientales de la fermentación y del modo de acción de la enzima.
En la primera etapa, la mezcla gelatinosa obtenida mostraba turbidez, el
CaCl2 se encargaba de dar las propiedades para gelificar, es por eso que se
obtuvo una mezcla gelatinosa..
UNIDAD III 93
UNIDAD
III
En la segunda etapa, cuando completamos con 10ml de agua destilada, la

concentración de CaCl2 bajo, debido a que se agregó agua más de lo debido,
para completar los 50ml requeridos. Pero trabajamos como si la
concentración fuera de 1.5M.
Los beats (esféricos de enzima inmovilizada) obtenidos, no tuvieron la forma

esférica mencionada, eso debido a que al realizar el goteo, no se mantuvo una
velocidad constante de caída ni tamaño de cada gota. Obtuvimos unos beats
ovalados, teniendo en cuenta además que la temperatura desestabilizo a la
enzima.
En la tercera etapa, los beats en el agitador, deben notarse y estar en

suspensión.
El sistema de mini-reactor que se utilizó para la inmovilización de inulinasa

fue un sistema simple por lotes, trabajándose el sistema por un tiempo de 5
horas, dejando actuar la enzima y así determinar las conversiones de sustrato
a producto.
La solución de alginato de sodio ayuda a inmovilizar a la enzima inulinasa,

adhiriéndose y reteniéndolo, y la solución de cloruro de calcio ayuda a formar
los pelets, y su refrigeración a mantenerlos aún más estables. Cuando se
refrigera permitirá la saturación de todos los poros del gel.
La inmovilización de enzimas reduce la carga enzimática inicial y aumenta las

restricciones difusionales internas, mientras que a concentraciones de
sustrato elevadas permite bajar la concentración de las restricciones
difusionales externas ofrecida por el medio.
Se diseñó y realizaron experiencias de estudios cinéticos con un preparado

enzimático de inulinasa de un caldo crudo libre de células de Kluyveromyces
marxianus NRRL Y-7571 en su forma soluble e inmovilizada.
La actividad de la enzima inulinasa diluida 1:1, 1:2 y 1:3 en tampón, mantiene

su rango de linealidad hasta por 10 minutos de reacción con el sustrato.
Las velocidades iniciales de reacción o actividades iniciales obtenidas no

tienen relación con la concentración de sustrato inicial.
UNIDAD III 94
UNIDAD
III
Para la experiencia A-1 los parámetros cinéticos obtenidos con la ecuación de

Lineawer-Burk fueron de Vmax y Km de 34.74 g/L.h y 16.09 g/L
respectivamente.
La relación Si/K para nuestra experiencia fue de 1.1187 (G-A)
Se logró inmovilizar la inulinasa en geles usando el alginato de sodio, el cual

se llegó a manipular en la experiencia a una temperatura de 45º C; formando
esferas (beads) mediante el uso de una jeringa en contacto con CaCl2
(solución endurecedora).
Se llegó a realizar la catálisis enzimática de la inulinasa en fase homogénea

(enzimas en solución) así como heterogénea (inulinasa en forma
inmovilizada)
Las variables mas importantes en la cinética enzimática son la concentración

de enzimas, de sustratos y productos (inhibidores, activadores), el pH y la
temperatura.
La inmovilización de la enzima provoca cambios en sus propiedades cinéticas

derivados de su modificación estructural y derivados del efecto del
micronutrientes que rodea a la enzima (efectos de partición y restricciones
disfuncionales de especies reactantes).
La inmovilización de enzimas es importante por su estabilidad operacional

en las condiciones de trabajo (temperaturas y pH relativamente altas).
UNIDAD III 95
UNIDAD
III
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Manual Moderno, S.A., de C.V. ;Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.
 GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial Acribia
S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.
 Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición.
México, edit. Alhomba, 1981.
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Ingeniería Bioquímica. Universidad Católica de Valparaíso.
 Reactores Enzimáticos. Profesor Agustín López Munguia. Departamento
de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.
 FUSIÓN TRADUCCIONAL DE LA INVERTASA ZMINVB DE
Zymomonasmobilis A UN DOMÍNIO DE UNIÓN A CELULASA.PDF
 HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INVERTASA INMOVILIZADA EN
NYLON-6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF
 ENZIMAS: QUÉ SON Y PARA QUE SIRVE.PDF
 Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications.pdf
 http://www.bio.mtu.edu/campbell/401lec11p6.html
 https://sites.google.com/a/unitru.edu.pe/sci-
agropecu/publicacion/scagropv1n3-4/scagrop01_235-245
 http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/5983/mod_resou
rce/content/0/INMOVILIZACION_DE_ENZIMAS.pdf
 Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications.pdf.
 http://www.bio.mtu.edu/campbell/401lec11p6.html.
 SCRIBAN RENE; Biotecnologia Segunda Edicion 1985; Editorial El
Manual Moderno, S.A., de C.V.; Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.
UNIDAD III 96
UNIDAD
III
 GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial Acribia

S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.
 Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición.
México, edit. Alhomba, 1981.
 Cinética enzimática. Profesor Andrés Illanes Frontaura. Escuela de
Ingeniería Bioquímica. Universidad Católica de Valparaíso.
 Reactores Enzimáticos. Profesor Agustín López Munguia. Departamento
de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

UNIDAD III 97

Ingeniería de enzimas

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G-A2

PRE- INFORME DEL EXPERIMENTO

2.1. Objetivos Generales:

 Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima

2.2. Objetivos Específicos:

 Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucares

En esta practica de III unidad trataremos y enfocaremos nuestra atención en la

5.1.1. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS:

sistemático de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema funcional son

Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la

A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las

5.1.2. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS:

Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de

E+S [ES] E+P

Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis, v, varía con la concentración de

Figura 1: representación de v en función de [S], para Figura2: representación de dobles

Los parámetros cinéticos de una enzima, Vmáx. y KM pueden calcularse utilizando

Figura 3: Gráfico V vs S

Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de

En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será:

El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión

Si reordenamos la ecuación tendremos que: [S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]

5.1.3. EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

- Efecto del pH:

 La unión del sustrato es mejor o peor que antes.

La velocidad enzimática se mide en M/t y la actividad enzimática en mol/t, y la

La obtención de estas enzimas a partir de plantas presenta el inconveniente de que es muy

Fusarium oxysporum; las bacterias: Bacillus subtilis; y levaduras: Candida salmenticend,

Estudios realizados sobre la producción de inulinasa por Kluyveromices marxianus,

En diferentes especies de Kluyveromices se ha demostrado que a diferencia de la

Se han desarrollado y reportado diferentes procedimientos para la purificación y

Workman y Day purificaron la inulinasa producida por Kluyveromices fiagilis,

el peso molecular de la enzima purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco

5.2.1. HIDROLISIS ENZIMATICA DE LA INULINA: INULINASAS

La inulinasa o β-1,2-fructan-fructanohidrolasa es la enzima encargada de

La inulinasa puede obtenerse de dos orígenes diferentes: origen vegetal (Diente de

5.2.2. MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE INULINASAS

5.2.3. PROPIEDADES CINETICAS

Estudios realizados sobre la bioquímica de las inulinasas producidas por diferentes

Durante las últimas tres décadas se ha desarrollado un nuevo método de obtención de

5.3. INMOVILIZACION DE ENZIMAS:

Por ello se hace conveniente la inmovilización de la enzima previa a su utilización. La

5.3.1. REACTORES CON ENZIMAS INMOVILIZADAS:

5.3.2. COMPORTAMIENTO DE REACTORES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS:

Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética de

Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se puede

Donde t= tiempo para alcanzar la conversión X

5.4. MÉTODO DE LOS INVERSOS O LINEWEAVER – BURKE

Emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético

El diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como herramienta gráfica para calcular los

Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente

Cuyo recíproco es:

Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de

5.4.1. INCONVENIENTES DEL MÉTODO

 Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir

VI. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

6.1. Determinación de proteína: Método de Bradford

6.2. Determinación de azucares reductores mediante el método del

 Equipo baño maría

6.3. Metodología de la obtención del caldo crudo de Kluyveromyces

6.4. Determinación del rango de linealidad y actividad de la enzima