DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

Jairo Antonio Guirales León 1, Carola Quiroga Urrego2

Universidad de Antioquia, Facultad de Ingeniería, Ingeniería Bioquímica, Biotecnología

Industrial y Ambiental, Carepa, Colombia.

Resumen

La cuantificación de proteínas de forma precisa es fundamental para todos los experimentos

relacionados a proteínas y aplicados en un gran número de temas de investigación afines.
Se han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en
particular en un ensayo dado. En el presente informe se calcularon los datos de absorbancia
a partir de una solución de albumina sérica con buffer PBS y reactivo de Bradford, para
graficar la curva estándar; además se determinó la cantidad de proteína presente en: leche,
gelatina, haría de cebada, peptona y yogurt; para cual se obtuvieron los valores: 1,899;
0.147; 0,102; 0,013 y 1,112 respectivamente, la muestra con mayor cantidad proteica fue la
leche.

Palabras clave: Proteínas, Reactivo Bradford, Absorbancia, Curva Estándar.

INTRODUCCIÓN
El ensayo de Bradford, originalmente
descripto por la Dr. Marion Bradford en
1976, es una de los métodos más
populares para la determinación de la
concentración de proteínas. Se basa en la
formación de un complejo entre el
colorante azul brillante de Coomassie G-
250 y las proteínas en solución (Kruger,
1994). El colorante libre existe en cuatro
formas iónicas. La forma azul más
aniónica se une a proteínas y absorbe a
590 nm. La concentración de proteínas
puede ser evaluada determinando la
cantidad de colorante en su forma iónica
azul y midiendo la absorbancia de la
solución a 592 nm utilizando un
espectrofotómetro (Kruger, 1994). El
colorante se une principalmente a
residuos de arginina, triptófano, tirosina,
histidina y fenilalanina (Olson &
Markwell, 2007).
La principal limitación del ensayo de
Bradford es su incompatibilidad con
detergentes, los cuales se utilizan de
rutina para solubilizar proteínas de
membrana. Solo un nivel de detergente no
iónico muy bajo, tal como Triton X-100 a
una concentración final de 0,008 % (v/v),
puede mejorar la sensibilidad y
variabilidad del ensayo de Bradford
(Friedenauer & Berlet, 1989) . Los
detergentes pueden ser removidos por
cromatografía de exclusión molecular o
por diálisis, lo que lleva a la dilución de
la muestra; o por precipitación con
fosfato de calcio (Kruger, 1994) o
acetona, ambos métodos que permiten
recuperar como mucho el 70 % de la
cantidad inicial de proteína.
En una publicación reciente (Cheng, Wei,
Sun, Tian, & Zheng, 2016) describen un
método basado en el ensayo de Bradford
que permite la cuantificación de proteínas
de manera rápida incluso cuando la
solución de proteínas contiene
substancias que interfieren. El método
demuestra una tasa de recuperación de
proteínas mejorada luego de tan solo 1
hora de precipitación en acetona posterior
a la adición de sacarosa, un componente
que no interfiere con el ensayo de
Bradford.
El objetivo principal de esta práctica fue
desarrollar una curva estándar de base
para la cuantificación de proteínas
utilizando el método de Bradford y
Cuantificar el contenido proteico de
diferentes fuentes alimenticias.
MATERIALES Y METODOS
Materiales y Reactivos
 Albumina sérica bovina (BSA)
 Azul brillante de Coomasie G-250
 Metanol
 Ácido fosfórico H3PO4
 Agua desionizada
 Peptona
 Harina de Cebada
 Leche
 Gelatina
 Yogurt
 Buffer fosfato salino PH 7.4
 Tubos de centrifuga de 2 ml
 Puntas de micropipeta
 Celdas de espectrofotómetro
Equipos
 Espectrofotómetro
 Papel filtro Whatman
 Micropipetas
Metodología
Preparación del reactivo de Bradford.
Disolver 50 mg de Azul brillante de
Coomasie G-250 en 50 mL de
metanol y añadir 100 mL de ácido
ortofosforico al 85 %. Añada la
mezcla de la solución lentamente en
850 ml de agua y deje el colorante
disolver completamente, no añada el
agua en la solución acida. Filtre
usando papel whatman para remover
los precipitados antes de su uso.
Almacene en una botella oscura a 4
grados.
Fabricacion de una curva estandar
para celda de 1 mL
1. Preparar soluciones estandar de
albumina serica 1 mL cada una, con 0,
125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000
µg/ml con el buffer PBS.
2. Pipetear 20 µl de solucion o de
estandar en tubos, haciendo duplicados.
3. Adicionar 1 mL del reactivo de
Bradford concentrado a cada tubo
4. Dejar incubar minimo por 5 minutos y
no mas de una hora.
5. Ajuste el espectrofotometro a 595 nm.
El instrumento se blanquea con
agua+reactivo de bradford.
6. Mida la absorbancia de los estandares.
7. Cree una curva estandar graficando los
valores de la absorbancia de 595 nm en el
eje X vs su concentración en µg/ml.
Cuantificacion de Muestras Problema RESULTADOS Y DISCUSIONES

1. Para peptona y gelatina pese 100 mg y

disuelva en 1 ml de agua.
Tabla 1. Promedio Cruva estandar.
2. Tome 20 ul de cada muestra y
PROMEDIO CURVA ESTÁNDAR
dispongalos en los tubos, haciendo
duplicados. Concentración (ug/ml) Abs R1

3. Adicionar 1 mL del reactivo de 0

0
Bradford concentrado a cada tubo 25
0,118
4. Dejar incubar minimo por 5 minutos y
125
no mas de una hora. 0,142
250
5. Mida la absorbancia de las muestras a 0,172
595 nm 500
0,289
6. Determine la concentracion de las 750
0,448
muestras a evaluar usando la curva 1000
estandar. Si las muestras estan 0,502
1500
diluidas, ajuste la concentracion final, 0,795
multiplicandolas por el factor de 2000
0,973
dilucion usado.
Fig.1 Gráfica ABS 595 vs Concentración BSA

En la Fig.1 se aprecia visiblemente la BSA(ug/ml) esta analogía indica una

relación lineal que se existe entre la proporcionalidad directa respecto a estos
absorbancia a 595nm y la concentración dos parámetros

Tabla 2. Absorbancia 595nm muestras.

ABSORBANCIA 595nm MUESTRAS

MUESTRA R1

Leche
1,899
Gelatina
0,147
Harina de cebana
0,102
Peptona
0,013
Yogurt
1,112

La Tabla 2 muestra la absorbancia para muestras problemas, donde la leche obtuvo la

mayor absorbancia.
CONCLUSIONES

La concentración BSA y la absorbancia presenta una relación lineal directamente

proporcional.

la absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la

solución; de las muestras abordadas en la práctica, la leche contiene el mayor contenido de
proteína, ya que presenta una absorbancia mayor respecto a las demás.

REFERENCIAS

Cheng, Y., Wei, H., Sun, R., Tian, Z., & Zheng, X. (2016). Rapid method for protein
quantitation by Bradford assay after elimination of the interference of polysorbate 80.
Analytical Biochemistry. https://doi.org/10.1016/j.ab.2015.10.013

Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Sensitivity and variability of the Bradford protein
assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry.
https://doi.org/10.1016/0003-2697(89)90636-2

Kruger, N. J. (1994). The Bradford method for protein quantitation. Methods in Molecular
Biology (Clifton, N.J.), 32, 9–15. https://doi.org/10.1385/0-89603-268-X:9

Olson, B. J. S. C., & Markwell, J. (2007). Assays for determination of protein

concentration. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E.
Coligan ... [et Al.], Chapter 3, Unit 3.4.
https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0304s48