SEMINARIO DE EXTRACCIÓN EN DOS FASES ACUOSAS

1) Para realizar la construcción de la curva binodial para el sistema PEG 8000/fosfatos pH 7,0 se pesaron las
soluciones según el cuadro:
1 2 3 4 5
PEG 8000 40% P/P (g) 4,00 3,00 1,00 0,50 0,05
FOSFATOS pH 7,0; 40% p/p (g) 0,50 1,50 3,50 4,50 5,00
AGUA DESTILADA (g) 0,50 0,50 0,50 --- ---
Posteriormente se agregó a cada sistema agua destilada empleando una bureta, con agitación permanente hasta
obtener una solución límpida.
El volumen de agua empleado (considerar 1g = 1 ml) fue:
1 2 3 4 5
AGUA DESTILADA agregada
(ml) 0,30 1,90 5,90 7,60 8,50

Calcular % PEG y % fosfatos para cada sistema y graficar la curva binodial para el sistema PEG/fosfatos

2) Indique en el siguiente esquema de partición de dos fases acuosas:

a) la composición global de todos los sistemas
b) la composición relativa de las fases de todos los sistemas
c) el tamaño relativo de la FI y FS en los sistemas
d) cual será la composición de la FS y la FI del sistema D

40
35
B
30
PEG %p/p

25 C
20
15
10 D
A
5
0
0 10 20 30
Fosfatos %p/p

3) Conociendo los siguientes datos ubique el sistema de 2FA en el gráfico

anterior. Composición de la fase superior = 25% PEG+ 7% fosfato
Relación de fases FS/FI = 2
i) ¿Cuál es la composición global del sistema?
ii) ¿Cuál es la composición de la FI?

4) Para mejorar el sistema de partición de dos fases acuosas PEG/Dextran se armó un sistema de afinidad
inmovilizando un ligando sobre el PEG (Yellow HE-3G). En el siguiente gráfico se muestran las K de partición
para diferentes proteínas a diferentes % de PEG en un sistema PEG/Dextran donde la concentración global de
Dextran se mantuvo constante en 3 % p/p.
a) ¿Qué proteínas de las indicadas purificaría por este sistema?
1
Recuperación y purificación de proteínas

b) ¿Qué sistema elegiría para purificar Glucosa-6-P-dehidrogenasa utilizando un sistema de relación de

volúmenes 1/1? Concentración de G-6-P-D: 1 mg/ml; proteínas totales: 10 mg/ml. volumen de muestra: 1 L.
Volumen total del sistema: 2 L.

5) En un proceso por fases acuosas en dos etapas, se extrae la proteína de interés en la fase superior utilizando
un sistema PEG600/fosfatos, pH7 NaCl 1.5M (log K = 1.5). Se realiza otra extracción de la proteína y esta se
encuentra ahora en la fase inferior ¿Cuál de los dos sistemas siguientes debo usar? ¿por qué?
A) PEG10000 B) PEG 600
DEXTRAN T500 Fosfatos
pH5 pH7
log K= -0.19 log K =-0.10

6) Calcule los rendimientos y factores de purificación en la fase superior para una muestra de taumatina
recombinante (8g Tau en 30g de proteínas totales). Se utilizó un sistema de dos fases con PEG 6000/fosfato
como lo indica la tabla 4 del trabajo "Partitioning and purification of thaumatin in ATPS". Las relaciones de
fases usadas fueron de 1 a 1, y 10 y 20 veces menor la fase superior a la inferior.

8) El señor Malcom desea purificar la enzima X de una mezcla de proteínas por partición en 2 fases acuosas.
Tiene una muestra con 50 ml de volumen con la siguiente composición: act. enzimática = 200 U/ml y
proteínas totales (método de Bradford)= 2,0 g/l. El sistema que eligió tiene una relación de volúmenes de
Vs/Vi igual a 0,5 y una constante de partición de 8,0 para la enzima X y 0,25 para el pool de las proteínas
contaminantes. ¿Qué % de recuperación y factor de purificación obtuvo el señor Malcom?