21/12

Digestión de c2 y pklac1 con notI (la de kpnI estaba hecha). 1h 37°C.

C2 (µl) PKLAC1 (µl)

BUFFER 5 5
DNA 22 22
NOTI 2,5 2,5
H2O 20,5 20,5

Siembra en gel de agarosa. Se cortaron las bandas correspondientes al pklac1 y al fragmento de

1500pb de C2 para purificarlas.

Se purificaron las bandas.

Peso de banda de pklac1= 1,2430g – 0,7963g = 0,4467g

Peso de banda de C2= 1,2542g – 0,8146g = 0,4396g

Chequeo de purificación por electroforesis con Ladder de masa para cuantificar el fragmento de
1500pb de C2 (dio una concentración de 1ng/ µl). No se observó banda de pklac1.

22/12

Se sembró lo que quedaba de la purificación de la banda de pKLAC1 pero tampoco se vio nada
(probablemente falló la purificación de la banda).

26/2

Se repitió la digestión de pKLAC1 con kpnI. 4hs 37°C

Dna 15 µl
Buffer 5 µl
kpnI 2,5 µl
H2o 27,5 µl

27/2

Chequeo y purificación de banda:

Peso banda = 1,1929g – 0,9998g = 0,1931g

Se eluyó en 50 µl. Se usaron 10 µl para verificar purificación (dio bien).

Los 40 µl restantes se usaron para la digestión con notI (37°c 1h):

 DNA 40 µl
Buffer 5 µl
notI 2,5 µl
H2o 2,5 µl

Chequo y purificacion de las bandas ( se sembraron 3 calles dividiendo los 50 µl totales entre
ellas).

Peso bandas = 1,1561g – 1,0285g = 0,1276g

Chequeo de purificacion dio bien.

28/12

Ligación.

Concentraciones de C1 y pKLAC1 obtenidas por espectrofotometría fueron:

C2 = 0,23 µg/ µl

Pklac = 0,26 µg/ µl

Se realizo la ligacion:

Buffer 1 µl
Pklac 0,2 µl
C2 3,6 µl
Ligase 1 µl
H20 4,2 µl

29/1

Transformación

30/1

Se sacaron las placas, no hubo colonias.

3/1

Se repitió la ligación con cantidades que me dio laura de una ligación anterior
 H20 1,25 µl
Buffer 0,5 µl
Pklac 0,5 µl
C2 2,5 µl
Ligasa 0,25 µl

4/1

Transformación (con la ligación nueva y la del 28/12 tambien por las dudas).

5/1

Se sacaron las placas. Había colonias en las dos. (la ligacion del 28 habia funcionado, había fallado
la transformación del 29).

Se mandaron a secuenciar colonias (a la otra semana, no anoté el día).