UNA NANOPROBE INNOVADORA PARA INMUNOENSAYO

MAGNÉTICO: NANOPARTÍCULAS INDIVIDUALES DE Y-FE2O3; HACIA

LA DETECCIÓN DE ALTA SENSIBILIDAD Y MULTIPARAMÉTRICA
Nuevo marcador superparamagnético para ensayos inmunológicos: la nanopartícula
individual; hacia una detección más sensible y multiparamétrica
C. de Montferrand, I. Milosevic, H. Jouni, N. Lièvre, Y. Lalatonne, L. Motte,
Received 14 June 2011; received in revised form 21 September 2011; accepted 21 September
2011
Available online 8 noviembre 2011
Resumen
Se diseñó un nuevo tipo de nanoetiquetas para inmunoensayos magnéticos utilizando
nanopartículas superparamagnéticas y-Fe2O3 individuales. Este candidato innovador se enfrenta
aquí con perlas micrométricas de uso común. La innovadora tecnología MIAplex® permite
caracterizar y cuantificar ambos tipos de etiquetas con un límite competitivo de detección. En este
artículo, demostramos la viabilidad de los inmunotestos multiparamétricos con la tecnología
MIAplex®. Las funciones carboxílicas en la superficie de la partícula externa actúan como un
grupo precursor para el acoplamiento covalente de moléculas de reconocimiento biológico, tales
como anticuerpos, ácidos nucleicos.

1. Introducción con una dispersión uniforme de

Las partículas magnéticas (PM) se utilizan nanopartículas de óxido de hierro
comúnmente para mejorar el contraste en superparamagnéticas.
imágenes por resonancia magnética, para la
concentración celular en el banco [1,2], para
la administración de fármacos [3], reparación
de tejidos [4], células y tejidos dirigidos [5],
transfección [6] y terapia contra el cáncer por
hipertermia [7]. Más recientemente, se han
presentado PM como nuevas etiquetas en
inmunoensayos magnéticos [8,9] en lugar de
etiquetas enzimáticas, fluorescentes o
radioisotópicas de uso común.
Magnisense France ha desarrollado una
tecnología patentada totalmente nueva
llamada MIAplex® [10] que mide la
magnetización no lineal (firma d2B (H) / dH2)
de materiales superparamagnéticos o
ferromagnéticos. Los MP se usan como
sondas para el acoplamiento anticuerpo-
antígeno-anticuerpo; los antígenos probados
se cuantifican a través de la firma MIAplex®
(Fig. 1). Todo el trato con los inmunoensayos Fig. 1. Inmunoensayo magnético, principio y
magnéticos es su gran sensibilidad (el límite medida.
de detección alcanza 0.1 ng / ml), la rapidez
de la prueba (15 minutos) y la facilidad de El objetivo de este estudio es enfatizar la
uso. Los ensayos biológicos se realizan eficiencia de partículas
actualmente usando perlas micrométricas superparamagnéticas nanométricas
comerciales. Esas son perlas de polímero individuales para inmunoensayos
magnéticos. Tales aplicaciones de estas
nanopartículas individuales no han sido
exploradas y se han demostrado
previamente a través de las mediciones
MIAplex® para pruebas multiparamétricas
[11].
2. Material y métodos
Se usan dos tipos de MP: nanopartículas de
maghemita γ-Fe2O3 sintetizadas en el
laboratorio CSPBAT a través de micelas
directas (γ-Fe2O3 @ COOH) y perlas
comerciales Estapor @ COOH Merck M1020
/ 50. La síntesis y caracterización de
maghemita γ-Fe2O3 @ COOH
nanopartículas se describieron en trabajos
anteriores [8, 9, 12].
El tamaño y la forma de las partículas se
caracterizan por microscopía electrónica de
transmisión (TEM), Philips CM10. Su
comportamiento magnético a temperatura
ambiente se estudia con la medición
convencional del magnetómetro Quantum
Design Squid MPMS-5 T y la tecnología
MIAplex®.
3. Resultados
El tamaño promedio de las nanopartículas de
magneto-Fe2O3 @ COOH es de 10 nm de
diámetro, con una polidispersidad de tamaño
del 30% (Figura 2, inserte arriba a la
izquierda). Se obtiene un ferrofluido estable
a grandes concentraciones y rangos de pH.
Las perlas comerciales Estapor @ COOH
son nanopartículas de magnetita Fe3O4 de
10 nm (polidispersidad del 40%) integradas
en poliestireno (ferrita al 50%). El tamaño
promedio de las perlas es de 165 nm con una
polidispersidad de tamaño del 30% (Fig. 2,
inserto inferior derecho). Estas nanobeads
están recubiertas con grupos carboxílicos.
Independientemente de la fabricación, las
curvas de histéresis de calamar son
características del comportamiento
superparamagnético a temperatura
ambiente sin remanencia y coercitividad. La
saturación de magnetización corresponde a
un valor de 55 emu.g-1 y 27 emu.g-1 (peso
de óxido de hierro) para nanopartículas y-
Fe2O3 @ COOH y cuentas de Estapor @
COOH respectivamente (figura 2).
Fig. 2. Imágenes de magnetización de calamar a
temperatura ambiente de nanopartículas de y -
Fe2O3 @ COOH (curva negra) y cuentas de
Estapor @ COOH (curva gris). Insertar:
imágenes TEM de nanopartículas de y-Fe2O3 @
COOH (arriba a la izquierda, negro) y cuentas de
Estapor @ COOH (abajo a la derecha, gris).
El sensor MIAplex® mide una señal, que es
proporcional a la segunda derivada de una
curva de magnetización [11]. La Fig. 3
muestra las firmas MIAplex® de dos tipos de
nanopartículas superparamagnéticas
ajustadas en isointensidad. Se puede
observar que la detección magnética con
MIAplex® se mide en el origen de la
magnetización donde la pendiente de
magnetización es la más importante. Por lo
tanto, en comparación con la firma B (H)
habitual, se espera que la medición de d2B
(H) / dH2 sea más sensible a los cambios
ligeros del comportamiento magnético.
En un intento de bioensayos
multiparamétricos, las dos nano- (micro) -
plataformas biolabel, las partículas y-Fe2O3
@ COOH y las perlas de Estapor @ COOH,
se mezclan en diferentes proporciones. La
concentración de hierro de los dos
ferrofluidos se ajustó para obtener la firma
MIAplex® en isointensidad, como se muestra
en la Fig. 3.
Las firmas difieren solo por la amplitud del
campo magnético en los extremos de la
señal: ΔHmax = Hmax -Hmin. Los valores de
ΔHmax son iguales a 3.6 kA.m-1 y 8.9 kA.m-
1 para nanopartículas de y-Fe2O3 @ COOH
y cuentas de Estapor @ COOH
respectivamente.

Fig. 3. Firmas MIAplex® de partículas de y-
Fe2O3 @ COOH (curva negra) y cuentas de
Estapor @ COOH (curva gris), ajustadas en
isointensidad.
Fig. 4. Puntas experimentales (puntos negros) y
correspondientes calculadas (curvas grises)
MIAplex® de partículas de y-Fe2O3 @ COOH y
perlas de Estapor @ COOH mezcladas en
diversas proporciones; A: 75% de y-Fe2O3 @
COOH y 25% de Estapor @ COOH, B: 50% de y-
Fe2O3 @ COOH y 50% de Estapor @ COOH, C:
25% de y-Fe2O3 @ COOH y 75% de Estapor @
COOH.
En la Fig. 4 se informan las firmas MIAplex®
experimentales medidas mezclando los dos
tipos de partículas en diversas proporciones
superpuestas con las correspondientes
curvas calculadas usando las dos firmas de
partículas no mezcladas en la Fig. 3. Se
obtiene una buena concordancia entre
experimental y calculada curvas. Esto
confirma la alta sensibilidad de la medición
de d2B (H) / dH2 para fines de
caracterización y separación.
4. Discusión y conclusión
Estos primeros resultados son muy
prometedores para el uso de la tecnología
MIAplex® para inmunoensayos
multiparamétricos. Esto también muestra la
oportunidad de utilizar nanopartículas
superparamagnéticas individuales en lugar
de un conjunto de nanopartículas integradas
en una matriz de polímero como un
nanosensores magnético. Hoy en día, se
está trabajando para elaborar diferentes
nanoplataformas que difieren según su
tamaño, forma y / o composición y, por lo
tanto, presentan no linealidades más
grandes.
Fig. 5. Imágenes TEM (inserciones) y firmas
MIAplex® de nanocristales de 20 nm (A) y 40 nm
(B).
Estos nuevos candidatos deberían ser muy Referencias
prometedores para los inmunoensayos
magnéticos multiparamétricos. Un ejemplo 1. Olsvik O, Popovic T, Skjerve E, Cudjoe
se presenta en la Fig. 5. Pequeños cambios KISI, Hornes EI, Ugelstad J,Uhlen M.
en el procedimiento de síntesis química Magnetic separation techniques in
(aumento de la concentración de hierro) diagnostic microbiology. Clin Microbiol
inducen la formación de nanocristales con Rev 1994; 7:43–54.
tamaños promedio de 20 nm (Fig. 5 A) y 40 2. Gupta AK, Curtis ASG. Lactoferrin and
nm (Fig. 5 B). Las mediciones MIAplex® ceruloplasmin derivatized
correspondientes (Fig. 5) muestran superparamagnetic iron oxide
diferentes firmas magnéticas dependiendo nanoparticles for targeting cell surface
del tamaño de las partículas, con la aparición receptors. Biomaterials 2004; 25:3029–
de un ciclo de histéresis que aumenta con el 40.
tamaño. Tal cambio se correlaciona con el 3. Gai S, Yang P, Li C, Wang W, Dai Y, Niu
aumento de la interacción dipolar magnética N, et al. Synthesis of magnetic, up-
entre nanopartículas con tamaño [8]. conversion luminescent, and
Para el inmunoensayo magnético, las mesoporous core-shell-structured
nanopartículas superparamagnéticas deben nanocomposites as drug carriers. Adv
recubrirse con biomoléculas de Funct Mater 2010; 20:1166–72.
reconocimiento, como anticuerpos, ácidos 4. Gupta AK, Gupta M. Synthesis and
nucleicos. Esto se podría realizar surface engineering of iron oxide
aprovechando las funciones carboxílicas o nanoparticles for biomedical
amínicas en la superficie de la partícula applications. Biomaterials 2005;
exterior. El acoplamiento covalente de 26:3995–4021.
diferentes anticuerpos en tales 5. Tchikov V, Winoto-Morbach S, Kronke
nanoplataformas que usan la química de la M, Kabelitz D, Schutze S. Adhesion of
carbodiimida está bien establecido. Sin immunomagnetic particles targeted to
embargo, un control preciso del número y la antigens and cytokine receptors on
orientación de las moléculas inmovilizadas tumor cells determined by
sobre nanopartículas no siempre es fácil de magnetophoresis. J Magn Magn Mater
obtener y también debe mejorarse para 2001; 225:285–93.
aumentar el objetivo del antígeno. La 6. Krotz F, de Wit C, Sohn HY, Zahler S,
optimización del protocolo de acoplamiento Gloe T, Pohl U, Plank C.
en nanoplataformas está en progreso [13]. Magnetofection: a highly efficient tool for
antisense oligonucleotide delivery in
Divulgación de interés vitro and in vivo. Mol Ther 2003; 7:700–
Los autores declaran que no tienen conflictos 10.
de interés con respecto a este artículo. 7. Hadjipanayis CG, Bonder MJ,
Balakrishana S, Wang X, Mao H,
Expresiones de gratitud Hadjipanayis GC. Metallic iron
Este trabajo fue apoyado por ANR biotecs y nanoparticles for MRI contrast
Magnisense France, las mediciones de enhancement and local hyperthermia.
calamar fueron apoyadas por subvenciones Small 2008; 4:1925–9.
de la región de Ile-de-France. 8. Lalatonne Y, et al. Characterization of
Los autores agradecen a Dominique Bonnin magnetic labels for bioassays. J Magn
y Brigitte Leridon por las mediciones de Magn Mater 2009; 321:1653–7.
Squid y a Nicole Lièvre (UP13) por las 9. Alphandéry E, Lijeour L, Lalatonne Y,
imágenes TEM. Motte L. Different signatures between
chemically and biologically synthesized
nanoparticles in a magnetic sensor: a
new technology for multiparametric
 detection. Sens Actuators B 2010;
147:786–90.
10. Nikitin PI, Vetoshko PM. Patent of
Russian Fed RU 2166751, EP 1262766
publication, 2002.
11. Lenglet L. Multiparametric magnetic
immunoassays utilizing non-linear
signatures of magnetic labels. J Magn
Magn Mater 2009; 321:1639–43.
12. Lalatonne Y, Paris C, Serfaty
JM,Weinmann P, Lecouvey M, Motte L.
Bisphosphonates: ultra-small
superparamagnetic iron oxide
nanoparticles: aplatform towards
diagnosis and therapy. Chem Commun
2008:2553–5.
13. Benyettou F, Guenin E, LalatonneY,
Motte L. Microwave assisted
nanoparticle