UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

CURSO BIOQUIMICA, CICLO 2017-I

PRÁCTICA 4

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA:

TEMPERATURA y pH.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas por su carácter proteico, poseen una composición específica de cadenas
laterales determinadas por la secuencia de aminoácidos del polipéptido. La presencia de
grupos ionizables en esta estructura explica el hecho de que las enzimas sean sensibles al
pH tanto en su estabilidad, como en su capacidad catalítica.

La determinación de la actividad enzimática depende de la energía cinética de las moléculas

y de la estabilidad de la enzima presente en el medio. Cuando se aumenta la temperatura,
se observan dos respuestas diferentes, en una se produce un aumento de la velocidad de
reacción, intervalo en el cual la enzima permanece relativamente estable y en la otra hay
disminución de la velocidad e inestabilidad de la enzima, además es importante el tiempo,
por tanto la temperatura óptima será específica para cada enzima.

COMPETENCIAS

COGNITIVA:
- Conoce los factores que afectan la actividad de una enzima: pH y temperatura.

PROCEDIMENTAL:
- Demuestra experimentalmente el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad
enzimática.

ACTITUDINAL:
- Valora el trabajo en grupo y la interacción con el profesor.

MATERIALES

- Solución de HCl 1 N, Na2CO3 10%, sol. albúmina 100 mg%, sol. pepsina 1 g%, agua
destilada, materiales diversos.
- 03 hojas de papel milimetrado, 01 calculadora científica, 01 plumón rotulador (por mesa).

PROCEDIMIENTOS

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Preparar 2 dos series de tubos

SERIE A: Involucra al sustrato y el tubo B (Blanco), preparar según la sgte. tabla:

Tubo Nº 1A 2A 3A B
ml. Agua destilada 3.5 3.5 3.5 5.0
ml. HCl 0.5 N 0.5 0.5 0.5 -
ml. Albúmina 100 mg% 5.0 5.0 5.0 5.0
SERIE B: Involucra a la enzima, preparar según la sgte. tabla:

Tubo Nº 1B 2B 3B
ml. Pepsina 1 g% 1.0 1.0 1.0

 Preincubar los tubos por 5 min., según la sgte. tabla de temperaturas:

Tubos Nº 1A y 1 B 2A y 2B 3A 3B
Temperatura 0-4 ºC 37 ºC 37 ºC 100 ºC

 Cumplido el tiempo, verter el contenido de los tubos 1B, 2B y 3B a los tubos 1A, 2A y 3A
respectivamente y homogenizar.
 Incubar los 3 tubos por 5 min. exactos a las sgtes. temperaturas:
Tubo (1A+1B): Baño de hielo (0-4 ºC).
Tubo (2A+2B): Baño maría a 37 ºC.
Tubo (3A+3B): Baño maría a 37 ºC.

 Terminado el tiempo, detener la reacción en agua fría, homogenizar con cuidado y leer
las DO a 450 nm tanto del contenido de los 3 tubos (considerado como Lectura final) y
del contenido del tubo B (blanco).

 Cálculo de la Actividad enzimática (A.E): A la lectura del tubo B (Blanco), restarle la

lectura de c/u de los 3 tubos. La diferencia representará la actividad enzimática (A.E):
A.E. = Lectura blanco - Lectura final cada tubo

 Graficar en papel milimetrado:

a) Tº en el eje X versus A.E. en el eje Y.

 Determinar la temperatura óptima (Tº donde la A.E. es máxima)

EFECTO DEL pH

Preparar una batería de 6 tubos como se indica a continuación. También calcule el pH en

cada uno de los tubos.

Tubo Nº 1 2 3 4 5 B
ml H2O destilada - 1.5 2.0 1.5 - 5.0
ml HCl 0.5 N 2.0 0.5 - - - -
ml Na2CO3 10% - - - 0.5 - -
ml Albúmina 100 mg% 5.0 5.0 5.0 5.0 - 5.0
ml Pepsina 1 g% - - - - 20.0 -
pH

 Mezclar bien e incubar los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 a 37 °C por 5 min.

 Añadir del tubo 5, 3 ml. de pepsina a los tubos 1, 2, 3 y 4. Mezclar e incubar a 37 ºC por
5 min. Leer las absorbancias en los tubos 1, 2, 3, 4, y en el tubo B (Blanco) en el
espectrofotómetro a 450 nm.
 Cálculo de la Actividad enzimática (A.E): A la lectura del tubo B (Blanco), restarle la
lectura de c/u de los 4 tubos. La diferencia representará la actividad enzimática (A.E):
A.E. = Lectura blanco - Lectura cada tubo

 Graficar en papel milimetrado:

a) pH en el eje X versus A.E. en el eje Y.
 Determinar el pH óptimo (pH donde la A.E. es máxima)
Reforzar:

1. Compare el pH óptimo de la pepsina reportado en los textos y el obtenido en la práctica,

considerando las posibles diferencias.

2. Ejercicio. En una práctica se trabajó con HCl pero también con NaOH a diferentes
concentraciones. Se obtuvieron los sgtes. datos de pH y absorbancias:

pH
Blanco 0.5 1.0 1.5 4.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Absorb. 0.620 0.520 0.410 0.220 0.400 0.550 0.580 0.600 0.610

Determine la actividad enzimática, grafique pH vs A.E e interprete los resultados.

BIBLIOGRAFÍA:

 Bohinski, R.C. 1991. Bioquímica Addison- Wesley Iberoamericana S.A. Wilmington,

Delaware, USA.
 Biochemical Nomenclature Committes. Web:
www.chem.qmul.ac.uk/iupac/jcbn/index.html#6.
 Christensen H.N, Palmer G.A. 1980. Cinética Enzimática. Editorial Reverté S.A.
Barcelona. España.
 Villavicencio M. Texto de bioquímica; volúmenes 1 y 2. Concytec. 2010.

Mg Blgo. Oscar Acosta C.

Responsable
Bioquímica 2017-I
Ing. Ambiental