Proyecto Microbiología Super Mega Final 2

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental

Microbiología Ambiental
INTEGRANTES:
 AYALA BRAVO, Ana.
 CULQUI GARCÍA, Jonatán.
 GALICIA TORALVA, Víctor
 HUACCHILLO TELLO, Edwin.
 MEJÍA SAYABE, Wendy.
 MINHUEY ESPINOZA, Yesenia
PROFESOR:
 Mg. MENDOZA ROJAS, Gilberto Alejandro
CURSO:
 Microbiología Ambiental
2016 - II
Este proyecto va dedicado a a nuestras familias que son
nuestra inspiración para ampliar nuestros
conocimientos y brindar soluciones a la sociedad y
medio ambiente
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA 1|P á g i n a

La Universidad Nacional de Ingeniería nos ha brindado
esta oportunidad de realizar este proyecto. Y entre sus
docentes agradecemos muy profundamente al profesor
Alejandro Mendoza y al Ing. Victor Pretel de la facultad de
Petroleo.Tambien a nuestro compañeros por el interés y la
inspiración por el proyecto que nos brindaron durante
el transcurso del mismo.

ÍNDICE
1 Título ..................................................................................................................................... 4
2 Antecedentes ........................................................................................................................ 4
3 Justificación ........................................................................................................................... 5
4 Marco Teórico ........................................................................................................................ 6
5 Variables ............................................................................................................................... 11
6 Objetivos .............................................................................................................................. 12
7 Métodología ......................................................................................................................... 12
8 Resultados ............................................................................................................................ 15
9 Discusión ..............................................................................................................................16
10 Conclusiones......................................................................................................................... 18
11 Recomendaciones ................................................................................................................19
12 Bibliografía ...........................................................................................................................19
13 Anexos ................................................................................................................................. 20

1 TÍTULO
Análisis de la capacidad degradadora de petróleo de la

bacteria “Bacillus Cereus”.
2 ANTECEDENTES
Melissa Vivas Jiménez en su publicación “Identificación y caracterización de una bacteria
degradadora de parafinas “señala la importancia de la industria petrolera en el mercado mexicano
y ante la contaminación que genera este es necesario conocer mecanismos que contribuyan a la
solución de este problema , y uno de estos mecanismos es la biorremediación y biorestauración
mediante microorganismos degradadores de petróleo .Teniendo esto presente forjan el objetivo
de identificar y caracterizar microorganismos degradadores de parafinas (que se encuentran en el
petróleo).Para esto aíslan una bacteria ,de un cultivo cuya única fuente de energía es una mezcla
de parafinas , mediante la técnica de aislamiento cuantitativo por dilución y sembrado en placas de
agar soya y tripticaseina a partir de un cultivo de Pseudomonas aeruginosa en medio M9 cuya única
fuente de carbono fue una mezcla de parafinas denominada PI, posteriormente se realizaron una
serie de pruebas para identificar a la bacteria tales como evaluación del creciente en diferentes
medios (entre estos tenemos el agar soya y tripticaseina, agar cuenta Estándar, Agar gelosa sangre
al 5% agar sal y manitol y agar maConkey), también se evaluó su crecimiento en caldos de cultivo
para evaluar sus requerimientos nutricionales (entre estos tenemos Rojo de Fenol con glucosa,
Nutritivo y soya tripticaseina) y pruebas adicionales como tinción gran, forma(se determinó que
era bacilo), resistencia al acido, esporas, movilidad, crecimiento en medio aerobico y anaeróbico,
catalasa ,oxidasa, entre otras. Con tdas estas pruebas se determinó que la bacteria aislada era
Bacillus Licheniformis.
María del Carmen Rivera Cruz en su estudio sobre “La adaptación y selección de microorganismos
autóctonos en medios de cultivo enriquecidos con petróleo crudo” nos menciona sobre los
problemas ocasionados por el derramamiento del crudo en su país (Colombia), y para contrarrestar
los efectos causados, ha seleccionado microorganismos degradadores de petróleo como el

Rhodococcus que es uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos ya que
presentan una gran diversidad metabólica, capaz de transformar, biodegradar y utilizar como única
fuente de carbono compuestos hidrófobos, otro microorganismo es la Pseudomonas aeruginosa
que es una degradadora de gran cantidad de sustratos como el n-hexadecano, mineralización de
compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y degradadora de hidrocarburos arom·ticos y poli
arom·ticos, asÌ como del pireno en estudios in vitro (37,38). Otro género estudiado dentro de las
técnicas de biorremediacion es Sphingomonas, bacilos no fermentadores y dentro de estos la
Sphingomona wittichi es un microorganismo capaz de degradar en condiciones anaerobias el
2.7diclorobenceno, produciendo el metabolito 4 clorocatenol y el 1,2,3,4 tetraclorodibenceno, y
cepas como Sphingomonas yanoikuyae, y Sphingomonas paucimobilis como degradadoras de
PAHës utilizandolos como unica fuente de energía, tienen actividad Catecol 2,3-dioxigenasa,
fenantreno y antraceno.
Elizabet Samanez Gibaja elabora su tesis titulada “Biodegradación bacteriana por bioestimulación
en suelos contaminados con petróleo crudo”, para el presente estudio se ha evaluado la capacidad
degradadora de bacterias, frente a los hidrocarburos componentes del petróleo de manera
cuantitativa y cualitativa, mediante el uso de la bioestimulación con nitrógeno, fósforo y potasio y
la bioaumentación. Se compararon 5 terrarios (plantas pequeñas) conformados de la siguiente
manera: el primero por bacteriasbioaumentadas reintroducidas con fertilizantes inorgánicos (B+F),
el segundo por bacterias bioaumentadas reintroducidas sin fertilizante (BF), el tercero por bacterias
nativas con fertilizantes inorgánicos (N+F), el cuarto por bacterias nativas sin fertilizantes
inorgánicos (N-F) y el quinto el control abiótico (CA).
Dos o más poblaciones microbianas Para el proceso de biodegradación bacteriana, se
seleccionaron consorcios bacterianos (dos o más poblaciones microbianas) de acuerdo a su
capacidad degradativa y emulsificante por otro lado, para el proceso de bioestimulación se
seleccionó una mezcla de componentes inorgánicos y se formuló la concentración de estos
fertilizantes inorgánicos.
3 JUSTIFICACIÓN
La contaminación generada por el derrame de petróleo es uno de los problemas más frecuentes en
la contaminación ambiental. Estos derrames afectan todo el ecosistema donde se produce el
evento a lo cual perjudica catastróficamente la fauna y la pesca, así como a las costas con efectos
que pueden llegar a ser muy persistentes en el tiempo. En el Perú, las zonas más afectadas son
actualmente en el distrito de Urarinas (Loreto) donde está el Oleoducto Norperuano y en el
Amazonas, afectando directamente la salud de los pobladores, así mismo los ríos. Por esto es
necesario el estudio de microorganismos que ayuden a la restauración del medio ambiente por
medio de la biorremediación. Es así que recurrimos a la bacteria Bacillus Cereus para evaluar su
eficiencia degradadora.

4 MARCO TEÓRICO
4.1 PETRÓLEO
El petróleo (del griego: “aceite de roca”), es una mezcla homogénea de compuestos
orgánicos, principalmente hidrocarburos insolubles en agua. También es conocido como
petróleo crudo o simplemente crudo. Se produce en el interior de la Tierra, por
transformación de la materia orgánica acumulada en sedimentos del pasado geológico y
puede acumularse en trampas geológicas naturales, de donde se extrae mediante la
perforación de pozos.
El consumo energético de petróleo se ha triplicado en los últimos 60 años. El ser humano

está acabando con los recursos que posee, que en su mayoría son muy contaminantes y no
renovables; el petróleo contiene energía solar, que las plantas atraparon hace miles de
años, y el hombre quema cada día lo que se tardó en generar un millón de años.
Las propiedades del petróleo que lo hacen muy dañino para el medioambiente son:
 Es tóxico: perjudica animales y plantas que entran en contacto

 Es soluble: se disuelve con facilidad en el agua
 Es carcinógeno: la combustión de combustibles fósiles como el carbón y el petróleo
producen una variedad de hidrocarburo aromático catalogado como uno de los más
potentes contaminantes químicos.
Actualmente constituye un problema debido a que han y siguen ocurriendo una gran
cantidad de derrames (aprox. de 1,7 a 8,8 millones de toneladas métricas por año) un gran
número de contaminaciones por petróleo provienen de fugas en buques o tanques de
trasporte, de los equipos de perforación submarina y de accidentes en tierra firme.; lo cual
elimina muchas formas de vida e imposibilita la reforestación.
Existen pocas alternativas para la limpieza de suelos y aguas, que además resultan
ineficaces y muy costosas. Asimismo diversos ecosistemas reciben petróleo e
hidrocarburos, en cantidades diversas, de forma natural desde hace millones de años. Por
ello, muchos microorganismos han desarrollado la capacidad de metabolizar el petróleo y
eliminarlo de la cadena alimenticia ya que utilizan los hidrocarburos como fuente de
carbono; la mayoría de las bacterias conocidas hoy en día con esta capacidad fueron
aisladas de zonas contaminadas como por ej. Suelos cercanos a refinerías o donde se
conozcan derrames de hidrocarburos.
Entre las bacterias más importantes encontramos: Bacillus sphaericus,pseudomonas

aeruginosa, Serratia rubidae, Micrococcus sp., Brevibacterium sp., Spirillum sp.,
Xanthomonas., Alcaligenes sp.,

Y esto es una posible alternativa para la limpieza de suelos y aguas contaminadas por
hidrocarburos.
4.1.1 Tipos de las Bacterias Degradadoras De Hidrocarburos

Las bacterias degradadoras de petróleo pueden actúar en ambientes Aerobios o
Anaerobios, y que cada caso lo hacen vía diferentes rutas metabólicas.
En el caso de los ambientes anaerobios aún no se conoce con gran exactitud que vías
metabólicas utilizan; sin embargo en ambientes aerobios las rutas están bien
documentadas:
 Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxigeno: Se trata de

reacciones de oxidación e hidrólisis y da como producto ácido carboxílico.
 Degradación de hidrocarburos aromaticos en presencia de oxigeno: La vía
metabólica se centra en la transformación del catecol; y produce como
resultado succinil CoA.
4.2 BACILLUS CEREUS

Taxonomía
Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Bacillaceae
Género: Bacillus
Especie: B. cereus
Bacillus cereus es un microorganismo Gram-positivo, con forma de bastón alargado,

aerobio facultativo y formador de esporas, las cuales no son liberadas del esporangio. Estas
al igual que otras características, incluyendo las bioquímicas, son usadas para diferenciar y
confirmar su presencia; a pesar de que estas características también son observadas en las
bacterias B. cereus var. m ycoides , B. thuringiensis y B. anthracis. Es por ello que la
diferenciación de estos microorganismos depende de la determinación de su movilidad (la
mayoría de B. cereus son móviles), de la presencia de cristales tóxicos, de la actividad
hemólítica (mientras que B. cereus y otros son beta ) y del crecimiento tipo rizoide.

4.3 MEDIOS DE CULTIVO

4.3.1 BACILLUS CEREUS AGAR S ELECTIVO (SEGÚN MOSSEL )
Bacillus cereus es un microorganismo Gram-positivo, con forma de bastón alargado,
aerobio facultativo y formador de esporas, las cuales no son liberadas del esporangio.
Estas al igual que otras características, incluyendo las bioquímicas, son usadas para
diferenciar y confirmar su presencia; a pesar de que estas características también son
observadas en las bacterias B. cereus var. m ycoides , B. thuringiensis y B. anthracis.
Es por ello que la diferenciación de estos microorganismos depende de la
determinación de su movilidad (la mayoría de B. cereus son móviles), de la presencia
de cristales tóxicos, de la actividad hemólítica (mientras que B. cereus y otros son
beta ) y del crecimiento tipo rizoide.
4.3.2 Medio Mineral Mínimo.

Un medio mínimo en microbiología es un medio de cultivo que contiene los nutrientes
mínimos indispensables para el crecimiento de una colonia, por lo general sin la
presencia de aminoácidos, y son a menudo utilizados por los microbiólogos y
genetistas para cultivar microorganismos de tipo salvaje. Los medios mínimos
también se pueden utilizar para seleccionar las bacterias que pueden ser utilizadas
como recombinantes o como conjugantes.
Un medio mínimo por lo general contiene:
Una fuente de carbono para el crecimiento bacteriano, que puede ser un azúcar como
la glucosa, o una fuente menos rica en energía como el succinato
Distintas sales, que pueden variar entre las especies de bacterias y las condiciones de
cultivo, que generalmente proporcionan elementos esenciales como el magnesio,
nitrógeno, fósforo y azufre para permitir a las bacterias sintetizar proteínas y ácidos
nucleicos
Agua H2O
Los medios complementarios mínimos son un tipo de medios mínimos que también
contienen un agente único seleccionado, por lo general un aminoácido o un azúcar.
Este suplemento permite el cultivo de líneas específicas de recombinantes
auxotróficos.
4.4 TÉCNICA
LANDFARMING
Es una técnica de saneamiento de suelos donde el suelo contaminado se trata con
microorganismos mediante la aplicación de una capa de tierra de aproximadamente 50 cm
de espesor que se ara varias veces con el objeto de crear unas condiciones óptimas para un
correcto desarrollo bacteriano, acelerando de este modo el proceso de degradación. Este

método está especialmente indicado para la descontaminación de suelos contaminados
con aceites, utilizándose fundamentalmente para tratar los fangos residuales de las
refinerías de petróleo.
4.5 ESPECTROSCOPIA
La espectroscopia surgió con el estudio de la interacción entre la radiación y la materia
como función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la luz visible
dispersada según su longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Más tarde el concepto
se amplió enormemente para comprender cualquier medida en función de la longitud de
onda o de la frecuencia. Por tanto, la espectroscopia puede referirse a interacciones con
partículas de radiación o a una respuesta a un campo alternante o frecuencia variante (ν).
Una extensión adicional del alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al
establecerse la relación E=hν para los fotones. Un gráfico de la respuesta como función de
la longitud de onda (o más comúnmente la frecuencia) se conoce como espectro.
La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad

de especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es
un espectrómetro o espectrógrafo.
4.6 ESPECTROFOTOMETRÍA
La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más
usado en las investigaciones bioquímicas y síntesis químicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que cuantifica la cantidad de energía absorbida o transmitida por una solución
que contiene una cantidad desconocida de soluto.
4.6.1 Transmitancia
La transmitancia se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en
determinada cantidad de tiempo.
Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qué tipo de energía

consideremos.
La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una

determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo
traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz
de luz atraversará el cuerpo, según su transmitancia. El valor de la transmitancia óptica
de un objeto se puede determinar según la siguiente expresión:

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz

incidente.
Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la

fórmula:
4.6.2 Absorbancia
Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es
absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor
cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de
luz será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia
son dos aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud
de onda lambda, se define como:
Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la

intensidad de la luz incidente.
La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentración.

Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad
y longitud de onda, sobre la solución, y se mide la luz transmitida al otro lado de la
cubeta que contiene dicha solución. Estas técnicas están comprendidas en el área de
la espectrofotometría.
4.6.3 Ley de Lambert-Beer

Al realizar una medición de absorción espectral típica por medio de luz
monocromática, la muestra que se desea analizar se introduce dentro de un
contenedor adecuado llamado cubeta de muestra, de tal manera que una parte de la
radiación es reflejada, una parte es absorbida, y una parte se transmite. Por lo tanto,
la intensidad de la radiación original (Po) es igual a la suma de las intensidades de
radiación reflejada (Pr), absorbida (Pa) y transmitida (Pt), como se expresa en la
siguiente ecuación:
Po = Pr + Pa + Pt
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En este proceso el fenómeno de reflexión es despreciable con respecto al fenómeno

de absorción y transmitancia, por lo cual la Ecuación 1.18 la podemos expresar de la
siguiente forma:
Po =Pa + Pt
La intensidad de la luz transmitida medida (Pt) depende del espesor del medio
absorbente y la concentración de la sustancia cromófora (que absorbe), además de la
intensidad de la radiación incidente (Po) (ver Figura 10). Esta dependencia constituye
la base de determinaciones por espectrometría y se da en términos de dos leyes
fundamentales. Una es la ley de Lambert, que expresa la relación entre la capacidad
de absorción de la luz de la muestra y el espesor del medio absorbente y la otra es la
ley de Beer, que expresa la relación entre la capacidad de absorción de la luz de la
muestra y su concentración. Las dos leyes se combinan para darla ley de Beer-
Lambert.
5 VARIABLES
5.1 VARIABLE DEPENDIENTE

 Degradación de petroleo
5.2 VARIABLE INDEPENDIENTE

 Colonia de bacterias de Bacilus Cereus.
5.3 VARIABLES INTERVINIENTE

 Temperatura
 Ph.
 Tiempo de Incubación.
 Oxigenación.
 Humedad relativa.
6 OBJETIVOS
6.1 OBJETIVO GENERAL:

 Analizar la efectividad de la bacteria Bacillus Cereus como ente degradador de
petróleo.
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Aislar la bacteria usando el Agar Selectivo Bacillus Cereus según Mossel.
 Identificar la bacteria mediante pruebas bioquímicas.
 Mediante la técnica espectroscópica, llamada espectrofotometría calcular la
transmitancia y absorbencia de la muestra del medio y la bacteria.
7 MÉTODOLOGÍA
7.1 AISLAMIENTO
7.1.1 Toma de la muestra
La bacteria “Bacillus Cereus” se encuentra ampliamente distribuidas en la
naturaleza, se pueden aislar normalmente del suelo, aguas contaminadas, así como
de plantas y animales.
Se seleccionó 3 muestras:
 Tierra húmeda del parque de la Facultad de Ingeniería Ambiental de la UNI.

 Tierra residual de una mecánica.
 Tierra contaminada con petróleo.
Con un equipo estéril y asépticamente, se procedió con la toma de 100 g

aproximadamente de la muestra y se transportó al laboratorio en un contenedor
estéril.
7.1.2 Preparación del Agar

Preparación de Agar para 250 ml de solución:
AGAR MASA
Peptona de Carne 2.5 g
Extracto de Carne 0.25 g
Cloruro sodico 2.5 g

D Manitol 2.5 g
Agar agar 3g
Agua destilada 22.5 ml
 Esta mezcla se calentó con agitación frecuente e hirvió durante 1 minuto hasta
disolución completa.
 Se llevó a la autoclave 121°C durante 15 minutos.
 Se dejó enfriar a 50°C y asépticamente se distribuyó en placas de Petri estériles.
(Se guardó el medio de cultivo a -8,-2 °C)
7.1.3 Siembra de la muestra

 En un recipiente, se mezcló agua destilada y la muestra extraída previamente,
agitando moderadamente.
 Aplicando el método del estriado, se inocula la superficie del medio de cultivo.
7.1.4 Incubación
 Aeróbica.
 35-37 °C durante 24-48 horas.
7.1.5 Resembrado de la bacteria.

Teniendo la bacteria aislada, se procedió a resembrarla en un medio nutritivo, a fin
de aumentar la población de bacterias para proseguir con los siguientes análisis.
7.2 IDENTIFICACIÓN
Se utilizó el método de las pruebas bioquímicas para la correcta identificación de la
bacteria Bacillus Cereus:
7.2.1 Tinción Gram.

Se virtió una gota de agua destilada en portaobjeto, tomando muestra de colonia
con el aza de Kolle y frotar en la gota. Se fijó la muestra flameando el portaobjeto.
Se virtió los solventes y lavar después de 1 minuto en el siguiente orden: Cristal de
violeta, Lugol, Acetona y Safranina, secar por flameo. Observar
7.2.2 Catalasa.
Se colocó una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una
pipeta Pasteur dejando suspender la bacteria. Detectar la formación de bacterias.

7.2.3 Oxidasa.
Se puso un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa Petri.
Añadiendo una gota del reactivo Oxidasa. Se depositó sobre la reactiva masa
bacteriana (actuar de forma rápida y con un asa de Kohle). Observar:
7.2.4 Citrato de Simons.

A la mezcla de polvo con agua destilada, se calentó hasta disolución total.
Posteriormente se autoclavó a 121°C durante 15 minutos. Se dejó enfriar y solidificar
en posición inclinada. Se siembra la bacteria estriando la superficie inclinada e
incubar por 24-48 horas. Observar:
7.2.5 Manitol Salado.

A la mezcla de polvo con agua destilada, se calentó hasta disolución total.
Posteriormente se autoclavó a 121°C durante 15 minutos. Se dejó enfriar y se
distribuyó en placas Petri. Se siembra la bacteria estriando la superficie e incubar por
24-48 horas. Observar
Se procederá con la identificación de la Bacillus Cereus siguiendo los siguientes

parámetros:
Prueba Bioquímica Resultado
Tinción Gram Positivo
Catalasa Positivo
Oxidasa Positivo
Manitol Positivo
Citrato Negativo
7.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO MÍNIMO MINERAL

Preparación del medio mínimo mineral para 500 ml:
Reactivo y/o Agares Masa
Cloruro de Sodio 2.4 g
Cloruro de Potasio 0.07 g
Sulfato de Magnesio heptahidratado 0.1 g
Nitrato de Amonio 0.1 g

Agua destilada 100 ml
Petroleo crudo 1 ml
 Las muestras se vertieron en una pera de decantación.
 Se agregó 10 ml de agua destilada.
 Se destilo las muestras en una cubeta de muestra.
 Se colocó la cubeta de muestra en el espectrómetro.
 Visualización de resultando (transmitancia y absorbancia).
8 RESULTADOS
8.1 IDENTIFICACIÓN DE LA BACTERIA

8.1.1 Macroscopía
Se observó colonias grandes, blancas grisáceas con bordes ondulados. Creció a lo
largo de lo raspado en el agar.

Gram Positiva.
8.1.3 Microscopía
Gram Positivo
Bacillus, forman cadenas largas
8.1.4 Catalasa.
Positivo
8.1.5 Oxidasa.
Positvo.

Negativo.

Negativo.

TRANSMITANCIA
LONGITUD DE ONDA CONDICION ABSORBANCIA
(%)
Inicial A 28.3 0.548
Inicial B 30.8 0.511

12 horas 6.1 1.224
48 horas A 22.4 0.651

532 nm
48 horas B 22.2 0.653
72 horas A 24.1 0.620
72 horas B 23.2 0.630
9 DISCUSIÓN
9.1 AISLAMIENTO
9.1.1 Toma de la muestra
Se tomaron 3 tipos de muestra de tierra, tierra húmeda, tierra seca y tierra con
petróleo de un taller mecánico; debido que en estos tipos de tierra existian mayor
posibilidad de encontrar la bacteria bacillus cereus.
9.1.2 Preparación del Agar

Debido a la falta de algunos agares y reactivos, estos tuvieron que ser preparados
por nuestra cuenta o simplemente no fueron utilizadas.
En la preparación del agar selectivo según Mossel solo fueron utilizadas la Peptona
de carne, extracto de carne, manitol, cloruro de sodio, agar agar, debido a la carencia
del rojo de fenol no fue utilizado, pero no genero ningún inconvenientes ya que esta
solo servía en la coloración para observar la degradación, y el objetivo del sembrado
era el aislamiento de la bacteria. La emulsión yema de huevo, tampoco fue utilizada
ya está malogró la consistencia y homogeneidad del agar. Por ello se volvió a
preparar el agar pero sin la emulsión yema de huevo. El Bacillus Cereus Suplemento
no fue utilizado por la limitación financiera, este agar servía para la selección de esta
bacteria, debido a esto se tuvo que proceder al análisis macroscópico, microscópico
y a las pruebas bioquímicas para la identificación de la bacteria para luego ser aislada.
9.1.3 Siembra de la muestra

Para la siembra de la tierra con petróleo se tuvo que humedecer con agua, para las
demás muestras de tierras si se procedió con la siembra de manera normal; como
también se tuvo el máximo cuidado posible para evitar la contaminación.
9.1.4 Incubación
Al no saber cómo era el color del tipo de bacteria que buscábamos, se dejó las placas
Petri más tiempo de lo estipulado, con ello se corrió el riesgo que las bacterias
pudieran morir.
9.1.5 Resembrado de la bacteria.

En el resembrado no hubo ningún inconveniente.
9.2 IDENTIFICACIÓN
Debido a la limitación en la variedad de agares del laboratorio de la Fia, para las pruebas
bioquímicas de la bacteria obtenida por ello solo se hicieron las siguientes pruebas
bioquímicas:

Se observó que el cristal violeta no estaba muy concentrado, por ello al momento de
observar la bacteria en la microscopía, esta presentaba un color rojo-violeta.
En la microscopía a pesar de la coloración obtenida en la tinción gram se pudo
confirmo que era Gram Positivo. Además, se confirmó que era del género Bacillus,
por su forma alargada.
9.2.2 Catalasa.
No hubo problema.
9.2.3 Oxidasa.
No hubo problema.

No hubo problema.

No hubo problema.
Si bien es cierto, todas las pruebas bioquímicas realizadas resultaron positivas de acuerdo
a la tabla de identificación, no se puede afirmar veraz y contundentemente que la bacteria
aislada sea Bacillus Cereus por la poca información recogida debido a la poca capacidad

del laboratorio. Queda para otra investigación, hacer un análisis más exhaustivo de
reconocimiento de bacteria.
9.3 MEDIO MINERAL MÍNIMO

En la preparación del medio mineral mínimo surgieron los mismos inconvenientes que en
la preparación del agar por la falta de materiales. Por ello en esta preparación solo se
utilizó cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio heptahidratado, nitrato
de amonio y agua destilada.
Debido a la mucha concentración de petróleo en el medio mineral no se pudo realizar la
prueba de TPH que se iba a realizar en un inicio, ya que al realizar esta prueba la variación
de la cantidad de petróleo presente en el medio mineral mínimo sería muy mínima.
Por ello se realizó la técnica espectrofotometría en la cual se analizó el crecimiento
bacteriano. A un tiempo de 24 hrs la transmitancia, es decir la transmisión de luz, era
menor con ello afirmando el crecimiento bacteriano, pero a 72 hrs la transmitancia fue
mayor lo cual genero discordancia, ello pudo suceder debido a la muerte bacteriana del
bacillus cereus.
10 CONCLUSIONES
 Se pudo cultivar y aislar con éxito una bacteria, el cual, posiblemente sea “Bacillus Cereus”.
 Las pruebas bioquímicas de identificación resultaron positivas, pero debido a la falta de
agares y reactivos, no se pudo hacer una identificación plena de la bacteria, por lo que
posiblemente se obtuvo Bacillus Cereus.
 A menor transmitancia, la muestra presenta una mayor concentración debido al
crecimiento bacteriano, ello pudo suceder debido a su alimentación de petróleo ya que era
la única fuente de carbono.
 En el intervalo de tiempo de 48 horas a 72 horas la cantidad de bacteria disminuyo ya que
la tranmitancia aumento.
 A pesar de los inconvenientes y errores cometidos se pudo aprender de la importancia de
las bacterias microbiológicas en la bioremedicacion.

11 RECOMENDACIONES
 Contar con todos los agares para la preparación del Agar Manitol según Mossel y la
realización todas las pruebas bioquímicas en la identificación del bacillus Cereus de manera
óptima; como también con todos los reactivos en la preparación de medio mínimo mineral.
 Disminuir la concentración de petróleo en el medio mínimo mineral, asi poder realizar la
prueba del TPH.
 Se recomienda tener el mayor cuidado posible en la elaboración del proyecto para así evitar
errores que puedan afectar el resultado.
12 BIBLIOGRAFÍA
Gustavo Echeverri Ganiveth Manjarrez Paba. (2010). Aislamiento de bacterias potencialmente
degradadoras de petróleo en hábitats de ecosistemas costeros en la bahía de cartagena,
colombia. Cartagena, colombia.
Helguero., E. T. (Elizabeth Torrico Helguero.). Bacilos Gram negativos no fermentadores:.
Joaquín Benavides Lopez de Mesa, Gladys Quintero. (2006). Biorremediación de suelos

contaminados con hidrocarburos derivado de petroleo. Colombia.
Joaquin Benavides Lopez de Mesa, Liliana Palacios. (2006). Biorremediacion. Bogota, Colombia:
Nova.
Milusca, E. G. (2007). BIODEGRADACIÓN DE CRUDO DE PETROLEO EN TERRARIOS. Lima, Perú.
(Gustavo Echeverri Ganiveth Manjarrez Paba, 2010) (Helguero., Elizabeth Torrico Helguero.)

13 ANEXOS





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el transcurso del mismo.

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Análisis de la capacidad degradadora de petróleo de la

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El consumo energético de petróleo se ha triplicado en los últimos 60 años. El ser humano

 Es tóxico: perjudica animales y plantas que entran en contacto

Entre las bacterias más importantes encontramos: Bacillus sphaericus,pseudomonas

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4.1.1 Tipos de las Bacterias Degradadoras De Hidrocarburos

 Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxigeno: Se trata de

4.2 BACILLUS CEREUS

Bacillus cereus es un microorganismo Gram-positivo, con forma de bastón alargado,

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4.3 MEDIOS DE CULTIVO

4.3.2 Medio Mineral Mínimo.

Un medio mínimo por lo general contiene:

correcto desarrollo bacteriano, acelerando de este modo el proceso de degradación. Este

La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad

Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qué tipo de energía

La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una

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I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz

Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la

Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la

La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentración.

4.6.3 Ley de Lambert-Beer

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En este proceso el fenómeno de reflexión es despreciable con respecto al fenómeno

5.1 VARIABLE DEPENDIENTE

5.2 VARIABLE INDEPENDIENTE

5.3 VARIABLES INTERVINIENTE

6.1 OBJETIVO GENERAL:

6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Tierra húmeda del parque de la Facultad de Ingeniería Ambiental de la UNI.

Con un equipo estéril y asépticamente, se procedió con la toma de 100 g

7.1.2 Preparación del Agar

Peptona de Carne 2.5 g

Extracto de Carne 0.25 g

Cloruro sodico 2.5 g

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Agua destilada 22.5 ml

(Se guardó el medio de cultivo a -8,-2 °C)

7.1.3 Siembra de la muestra

7.1.5 Resembrado de la bacteria.

7.2.1 Tinción Gram.