3B-2

GUIA DE PRACTICAS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

EAP DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

MICROBIOLOGIA GENERAL
Blga. Mónica Velarde Vílchez

INTRODUCCION:

La Microbiología es una ciencia que estudia a los organismos microscópicos denominados

microorganismos los cuales se definen como aquellos seres vivos unicelulares o
pluricelulares carentes de organización tisular y que no pueden ser visualizados al ojo
humano necesitando para ello el microscopio
Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesita el conocimiento de técnicas únicas
denominadas Técnicas microbiológicas
Estas Técnicas han permitido el conocimiento de las diferentes estructuras y composición
bacteriana pudiendo comprenderse como muchas bacterias se relacionan con el hombre ya
sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo
El estudio de la composición bioquímica de la estructura bacteriana junto al conocimiento
de su metabolismo permite hoy la comprensión del mecanismo de acción de los diferentes
antibióticos
Hoy en día los avances de la genética bacteriana hacen posible el desarrollo de técnicas de
Biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y el diagnóstico
donde los microorganismos cumplen un rol protagónico
El conocimiento, ,manejo y utilización de los principales equipos, instrumentos y
materiales utilizados en el laboratorio de microbiología es indispensable para la ejecución y
desarrollo de las prácticas durante el curso de microbiología general que permitirán al
alumno, futuro profesional de la salud aplicar estos conocimientos en el estudio de
diferentes especialidades en el campo de la microbiología

F-CV3-3B-2 1 Rev. Junio 2007

I- PRACTICA Nº 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Manejo de los principales equipos e instrumentos, preparación de material de vidrio,

material auxiliar y su forma de esterilización
1.1 Marco teórico
En el laboratorio de Microbiología es necesario utilizar material limpio, sin trazas de detergente y estériles
para el aislamiento y posterior identificación de los gérmenes que se está investigando, se entiende por
Limpieza al proceso físico utilizado en los objetos en uso del laboratorio para eliminar materia orgánica y
residuos, mediante el lavado con agua con o sin detergente.
Desinfección Es un proceso en el que se utilizan principalmente agentes químicos y
Esterilización que viene a ser la destrucción de toda forma de vida, ésta puede ser por vapor saturado
(autoclave) o por calor seco (horno)

1.2 Competencias
Maneja y usa equipos y materiales en el Laboratorio.
Estudia in Vitro a los microorganismos.
Prepara e identifica el material de vidrio y su forma de esterilización

1. 3 Materiales y equipos
 Equipos e instrumentos tales como: Autoclave, horno, incubadora, baño María, refrigeradora,, equipo
para luz ultravioleta , equipo de esterilización por filtración, cámara de flujo laminar, centrifuga y
microscopio compuesto,
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Papel para lente
 Aceite de inmersión
 Torundas de algodón
 Gasa
 Asa de Kolle
 Cultivo bacteriano
 Papel kraft
 Tubos de prueba
 Placas Petri
 Balones, vaso de precipitados, pipetas y matraces de vidrio
 Cinta indicadora de esterilización (para autoclave)

1. 4 Procedimiento
1. Examina cada uno de los siguientes equipos e instrumentos del laboratorio: autoclave, horno, incubadora,
cámara de flujo laminar , baño maría, equipo de esterilización por filtración, centrifuga y microscopio e
identifica sus componentes , su aplicación y utilización en el laboratorio.
2. Observa al microscopio las muestras que a continuación se indican:
Cultivo bacteriano:
 Coloca sobre la lámina portaobjeto una gota de cultivo bacteriano y deja caer la lámina cubreobjeto.

F-CV3-3B-2 2 REV. JUNIO 2007

3. .Preparación de material de vidrio y material auxiliar
Confecciona tapones de algodón para el material de vidrio proporcionado, estos deben ser consistentes y de
un tamaño apropiado que permita su manipulación.
 Empaqueta este material con papel kraft, en igual forma también se procede con todo el
material auxiliar que se use en el laboratorio para someterlo a un proceso de esterilización y luego
conservar su esterilidad .un tiempo adecuado
 Las placas Petri y los tubos de prueba (previamente taponados) se envuelven formando paquetes de
tres y seis unidades respectivamente. Debe tenerse especial cuidado en que el papel utilizado se
encuentre íntegro y sin orificios. Para las torundas e hisopos se procede de igual forma.
 En el caso de las pipetas, se cortan bandas largas (tiras) de papel kraft y se las envuelve en forma
diagonal y empezando por la punta, colocando un refuerzo de papel en esta sección, de esta forma la
pipeta quedará íntegramente cubierta por el papel. Al final de la envoltura se dejará una porción en la
que se escribirá en números la capacidad de volumen de la pipeta.

1. 5 Resultados
Se registra detalladamente cada una de las observaciones hechas Y se realiza los esquemas
y dibujos necesarios: Equipo de laboratorio (indicando sus componentes). Procede de igual
forma con el material de laboratorio empleado

1. 6 Cuestionario.

1 .-¿Con qué propósito se envuelve totalmente el material a esterilizar?

2. En un cuadro comparativo explicar las diferentes formas y condiciones del proceso de esterilización que
…..se emplea según el tipo de material a esterilizar.

1. 7 Fuentes de información
 Tortora,Berdell, Funke Christine.L.Case Introducción a la Microbiología 9° Edicion. Editorial Médical
Panamericana España , 2007
 Tortora G. J.; Funke, B. R.; Case, C. L.: Introducción a la Microbiología, Buenos Aires, 9ª éd. Editorial
Acribia. 2000

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II .- PRACTICA Nº 2

Preparación de medios de cultivo y su forma de esterilización Medios de cultivo

,sólidos, semisólidos y líquidos

2.1 Marco teórico

Es importante aislar y observar el crecimiento de un microorganismo para su identificación, por lo que se

utilizan materiales alimenticios artificiales preparados en el laboratorio llamados medios de cultivo y su
desarrollo es el cultivo
Sus requerimientos varían considerablemente algunos sólo requieren sustancias simples ( bacterias no
exigentes ) y otros requieren de sustancias complejas ( bacterias exigentes )
Medios de Cultivo
Son sustancias o compuestos nutritivos estériles que permiten el crecimiento y multiplicación de los
microorganismos en el laboratorio, este medio debe cumplir una serie de condiciones como son
temperatura, grado de humedad, y presión de oxígeno adecuados, además de nutrientes y factores de
crecimiento y estar exento de todo microorganismo contaminante con el objeto de aislar las diferentes
especies bacterianas y proceder a su identificación mediante estudios complementarios.

Clasificación de los medios de cultivo:

Segùn su composición;
-Medios empíricos.- Extraìdos de alimentos naturales
-Medios semi-sintèticos.- Son medios de cultivo empíricos enriquecidos de ciertos compuestos químicos
-Medios sintéticos.- Medios químicamente definidos
Según su estado físico: Medios líquidos, medios semisólidos (con 0,3 a 0,5% de agar), medios sólidos (con 1
a 2% de agar).
Según su aplicación:
- Medios comunes o simples: permiten el desarrollo de la mayoría de bacterias, sobre todo las no
exigentes.
- Medios especiales: Medios de enriquecimiento, medios enriquecidos, medios de conservación y
transporte medios selectivos y medios diferenciales.

Preparación de medios de cultivo:

Es preciso ejercer un cuidado meticuloso en su preparación los que deberán ser esterilizados
inmediatamente. una vez preparados
- Los tubos de ensayo que contienen los medios se tapan con tapones de algodón o tapas metálicas o
plásticas con el fin de evitar la penetración de microorganismos extraños, luego se esterilizan Las placas
Petri se esterilizan por separado y luego los medios se vierten asépticamente en ellas.

2.2 Competencias
2.3 Realiza un listado de los principales medios de cultivo y su aplicación, así como los indicadores mas
usados
Prepara y esteriliza diversos medios de cultivo

2.3 Materiales y equipos:

- Probetas de 1000 mL y frascos de 250, 500, 1000 mL
- Solución de: NaOH 1N y HCl 1N
- Trípodes con rejilla metálica
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 - Tubos estériles y placas Petri estériles ,baguetas ,beakers
- Papel indicador de pH
- Agar: Tripticase de Soya (TSA), SIM (Azufre – Indol – Motilidad).EMB,gelatina
- Caldo: Tripticase de Soya (TSB). peptona
- Cloruro de sodio

2.4 Procedimiento
- Disuelve en agua destilada los medios comerciales proporcionados, según la indicación del envase, a
los que contengan agar será necesario someterlos a la acción del calor hasta su completa disolución.
- Enfria este preparado hasta aproximadamente 50ºC.
- Mide el pH del medio, con la cinta indicadora.
- Si es necesario, ajusta el pH empleando NaOH 1N o HCL 1N.
- Envasa, rotula, señalando el tipo de medio y la fecha de preparación.
- Esteriliza por autoclave a 15 lb de presión por 15 a 20 minutos.
- Controla la esterilidad del medio, por incubación del mismo a 37ºC por 24 horas.
- Para el caso del caldo peptonado, se procederá a la disolución de los siguientes componentes:
peptona 10 g y cloruro de sodio 10 g, luego se completa con agua destilada hasta 1000 mL; y se
llevará a pH de 8.8 +/- 0,1.

2. 5 Resultados
Se describirá su composición y el fundamento de las diferentes clases de medios de cultivo utilizados

2.6 Cuestionario:.
1. ¿Que importancia tiene el uso de los medios sólidos?
2. ¿ Qué sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo sólido? ¿De dónde se extrae?

2.7 Fuentes de informacion

- Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biología de los Microorganismos, 10ed. Madrid,
Prentice Hall Iberia. Madrid, 2000.
- Levinson,W.E Jawetz,E Microbiología e Inmunología, 2ºed. Editorial El Manual Moderno. México,2000

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III.- PRACTICA Nº 3 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y DESARROLLO
MICROBIANO

3.1 Marco teórico

1. Técnicas de siembra:
Las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razón se utilizan diversas
técnicas para separar un microorganismo de otro y obtener así un cultivo puro que permita
identificar al microorganismo aislado.
El diagnóstico bacteriológico se basa en el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra, por lo
que es indispensable tener en cuenta las máximas condiciones de asepsia, desde la toma de muestra hasta la
siembra, la cual debe efectuarse lo más rápido posible.
Términos importantes:
 Siembra
 Inóculo
 Cultivo puro
 Cepa
Se denomina “técnica de siembra” al procedimiento mediante el cual se pone en contacto a los
microorganismos con un medio de cultivo y después de un período de incubación se produce el desarrollo de
colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra , entre los cuales están los siguientes:
-Siembra por dispersión y agotamiento
-Siembra por puntura
-Siembra por estría
-Siembra por inoculación
-Siembra por incorporación, en placa vertida, en masa o en todo el medio
-Siembra por diseminación o en superficie o con cayado
2. Desarrollo bacteriano
Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que tienen sobre o
dentro de los distintos medios de cultivo , es así que la observación de las características de crecimiento de
las colonias de microorganismos en medio sólido (agar) y líquido (caldo), puede ser de gran utilidad.
Estudio bacteriano en medio líquido:
- Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rápido.
- Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como: presencia o
ausencia de: turbidez, sedimento y “película”.
- Producción de gas: formación de burbujas.
Estudio bacteriano en medio semisólido:
- Movilidad
- Cambios metabólicos
Estudio bacteriano en medio sólido:
- Características morfológicas de las colonias en cuanto a: elevación, forma, borde, superficie, tamaño,
consistencia y color de pigmentación.

3.2 Competencias

- Realizará diversas técnicas de siembra para su cultivo y aislamiento

- Aplica las técnicas de aislamiento hasta la obtención de cultivos puros
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 - Describe sus observaciones usando la terminología técnica apropiada

3.3 Materiales y equipos

1. Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos:
- Placas Petri con agar TSA
- Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado
- Tubos con caldo TSB
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa
2. Desarrollo bacteriano:
- Utilizar los medios de cultivo preparados en la práctica anterior y proceder a realizar los
sembrados en los distintos medios según técnicas
Ver figuras 3-1 a 3-4: Características morfológicas de los cultivos bacterianos.

3.4 Procedimiento:
1. Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos:
Siguiendo la metodología descrita según los esquemas anexos, proceder tal como sigue:
- Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada del cultivo de microorganismos, y
sembrar por el método de dispersión y agotamiento en las placas de TSA .
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inóculo del cultivo de bacterias y sembrar en
agar SIM, por el método de puntura.
- Con el asa en aro, toma el inóculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar en pico de
flauta o plano inclinado, por el método de estría .
- Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el método de
inoculación en el tubo con TSB.
2. Desarrollo bacteriano:
- Efectuará la lectura de los cultivos proporcionados por la profesora y observa.
Tener sumo cuidado de no sacudir los cultivos en caldo ya que esto puede trastornar
los crecimientos superficiales; describir. Hacer los esquemas de todas las
observaciones.
3.5 Resultados:
Reporta y describe

3.6 Cuestionario:
1. ¿Con qué propósito se emplean cada una de las diferentes técnicas de siembra?
2. Describe las características del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos proporcionados en la
práctica.
3. Describe el método de siembra por incorporación y señala en que casos se emplea

3.7 Fuentes de informacion

 Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook Biología de los Microorganismos. 10 ed, Madrid
Prentice Hall Iberia., 1999.
 Prescott L/ Harley J ,/ Klein D 576/P 85 2000 Madrid

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IV .- PRACTICA Nº 4

MÉTODOS DE COLORACIÓN

4.1 Marco teórico

1. Coloración Simple:
Aquella coloración en la que se utiliza sólo un colorante, el cual va a permitir visualizar la morfología de los
microorganismos.
2. Coloración Gram:
La diferenciación de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante
cristal violeta seguido por una solución yodoyodurada de potasio, para luego someterlas a una decoloración
después de la cual se usa una coloración de contraste, casi siempre safranina. Las bacterias gram-positivas
(coloración azul o morada) son resistentes a la decoloración y conservan el complejo cristal violeta-yodo, los
microorganismos gram-negativos, toman la coloración de contraste (coloración rosa o roja).
3. Coloración Ácido – Resistente (Coloración de Ziehl Neelsen):
En este método de tinción, el colorante primario, fucsina ácida, se formula con fenol para permitir el paso a
través de las paredes celulares de las micobacterias. El portaobjeto se calienta para facilitar la penetración y se
utiliza alcohol etílico como decolorante. Sin embargo, el reactivo se prepara con ácido clorhídrico para ayudar
a la decoloración de las células que no son ácido – resistentes.
4. Coloración de Esporas:
Para la observación de esporas, es necesario que el colorante penetre la pared de la espora, la cual es
relativamente impermeable, razón por la que se necesita de calentamiento.
5. Coloración Negativa:
La técnica de la tinción negativa incorpora materiales tales como la nigrosina o la tinta china, que al estar
compuesta de partículas demasiado grandes para penetrar en una célula, permiten observar algunos
microorganismos que permanecen sin teñir y que resaltan sobre un fondo oscuro; se utiliza principalmente
para observar la cápsula bacteriana.

4. 2 Competencias
Capacita y adiestra al estudiante para que (el) (la):
- Realice manualmente métodos de tinción habituales usados en la preparación de láminas de
observación
- Describa minuciosamente sus observaciones, al microscopio

4.3 Materiales y equipos

Cultivos bacterianos:
- Cultivo de Escherichia coli
- Cultivo de Staphylococcus aureus
- Cultivo de Klebsiella
Lámina fijada con frotis de Mycobacterium tuberculosis
1. Coloración simple:
- Azul de Metileno
2. Coloración Gram:
- Violeta de genciana (colorante primario)
- Lugol (mordiente)
- alcohol – acetona (decolorante)
- Fucsina básica (colorante de contraste)

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 3. Coloración Ácido – Resistente:
- Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
- Alcohol – ácido (decolorante)
- Azul de metileno (colorante de contraste)
4. Coloración de Esporas:
- Solución de azul de metileno
- Solución saturada alcohólica de eosina
.5. Coloración negativa:
- Tinta china

4.4 Procedimiento
1. Coloración simple:
- Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.
- Fija al calor.
- Cubre el frotis con el colorante Azul de Metileno y deja actuar por 3 a 5 minutos.
- Lava con agua y deja secar.
- Observa al microscopio con objetivo de inmersión.
-
2. Coloración Gram:
- Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.
- Deja secar al aire y fija con calor.
- Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.
- Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.
- Cubre el frotis con la solución de lugol y deja actuar durante 2 minutos.
- Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol – acetona y seguirá agregando hasta que
la tintura ya no fluya del frotis.
- Lava inmediatamente con agua corriente.
- Cubrirá el frotis con la solución de safranina durante 30 segundos.
- Lava con agua corriente y deja secar la preparación.
- Observa al microscopio utilizando el lente de inmersión.
-
3. Coloración Ácido – Resistente:
- Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y dejarlo reposar de 30
a 60 segundos antes de calentarlo.
- Calienta la preparación con suavidad, haciendo pasar el mechero de alcohol por debajo del
portaobjeto. Seguir calentando hasta que se observe el desprendimiento de vapores. Evitar que el
colorante hierva. Repetir 2 veces más.
- Enfría y lava con agua corriente.
- Decolora con alcohol – ácido hasta que no arrastre colorante.
- Lava con agua corriente.
- Cubrirá el frotis con azul de metileno, durante 1 minuto.
- Lava con agua corriente.
- Deja secar al aire.

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 - Observa al microscopio con lente de inmersión. Las bacterias ácido – alcohol resistentes se tiñen
de rojo y los demás microorganismos de color azul.
-

4. Coloración de Esporas:
- Haga un frotis fino y fije a la llama.
- Cubre con azul de metileno y calienta hasta hervir en forma intermitente por 1 minuto.
- Lava con agua destilada.
- Cubre con una mezcla de solución saturada alcohólica de Eosina por 30 segundos.
- Lava con agua destilada y deja secar al aire.
- Examina al microscopio con lente de inmersión.

5. Coloración negativa:
- Coloca varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio, cerca de uno de los bordes.
- Coloca un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
- Mezcla bien con el asa y luego extiende la mezcla a lo largo del portaobjetos, utilizando la
técnica del frotis sanguíneo.
- Deja secar el frotis.
- Cubre con safranina durante 10 segundos, luego enjuaga con cuidado y deja secar al aire.
- Observa al microscopio con lente de inmersión. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá
como una zona transparente que rodea a la pared celular.

4.5 Resultados
Registra , dibuja y colorea la morfología de cada una de las muestras coloreadas

4. 6 Cuestionario
1. ¿Qué importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloración de Gram?
2. ¿Cuáles son las diferencias químicas importantes que explican el estado ácido-resistente?

4. 7 Fuentes de información
 Ingraham, J. L. y C.A.: Introducción a la Microbiología: Vol. 1 y 2. 3 ed./Editorial Reverté, S.A. España,
1998.
 Jawetz, .;Melnlick y Adelberg. Brooks Geo F, Butel Janet S Microbiología Médica.23 ed. México 2005
 Agurto Saenz,Tomás-Ramos Gobeña. Juan Carlos Sena, Chumbes Fernando Microbiología Básica, 1 ed.
Lima 2004

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V.- PRACTICA Nº 5

METABOLISMO MICROBIANO

Marco teórico
En esta práctica se presentará un panorama general de las reacciones bioquímicas
microbianas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y sobre las proteínas,
haciendo uso de las pruebas bioquímicas diferenciales que permiten la identificación de
microorganismos (en especial los microorganismos patógenos)
.
5.2 Competencias
- Manipula e identifica los microorganismos en función a su comportamiento bioquímico.

5.3 Materiales y equipos

- Placas con agar nutritivo con 1% de almidón
- Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR – VP (Rojo de Metilo – Voges Proskauer), caldo
lactosado con indicador de Andrade.
- Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y con TSA.
- Cultivos de: E. coli, B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter, Proteus vulgaris, Staphylococcus. aureus,
Streptococcus viridans.
- Lugol.
- Reactivos de: kovac´s, rojo de metilo, Voges – Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amílico, KOH –
creatina al 40%
- Tiras de papel de filtro impregnadas con solución saturada de acetato de plomo.
- Peróxido de hidrógeno al 3%.
- Campanas de Durham y pipetas Pasteur.
-
5.4 Procedimientos
1. Acción sobre los hidratos de carbono
Fermentación de hidratos de carbono:
Primer día
- Inocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris.
- Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.
- Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Después del período de incubación, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo control.
- Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusión del indicador
de Andrade.
- Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metabólico a CO2 e H+ se
observará la presencia de gas, en forma de burbujas.

Hidrólisis del almidón:

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Primer día
- Con ayuda del lápiz de cera, divida por fuera la base de la placa Petri en 3 partes.
- En la sección 1, siembra B. Subtilis, en la sección 2 siembra E. Coli y en la sección 3 siembra Ps.
aeruginosa
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Agrega a toda la superficie del medio la solución de lugol.
- Observa la reacción alrededor del crecimiento microbiano.
-
Producción de ácidos y acetil-metil-carbinol (acetoína):
Prueba de Voges Proskauer (VP)
Primer día
- Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
- Por la técnica de inoculación, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- A cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solución de alfa-naftol y 4 gotas de la solución de KOH – creatina.
- Agita después de agregar las soluciones por 1 minuto.
- Deja en reposo durante 15 minutos.
- La reacción es positiva, si aparece una coloración rosada localizada en la mitad superior o en todo el tubo
dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol.
- Si la lectura se realiza después de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloración cobriza, siendo
esta una respuesta falsa positiva.
- La reacción es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.
-
Prueba de rojo de metilo:
Primer día
- Rotula los tubos con el nombre del microorganismo.
- Por la técnica de inoculación, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37ºC por 48 a 72 horas.
Segundo día
- Agrega 4 ó 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4 (rojo)
y 6.0 (amarillo).
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.
- La prueba es negativa si da una coloración amarillo – naranja.
-
Principios bioquímicos de las reacciones en TSI:
Primer día
- Con el asa de siembra, inocula una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estría la
superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
- Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se encuentra
en baja concentración con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad de ácido
producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilización de las
peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el
fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, solo hay fermentación y el medio permanece ácido.
- Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentación de la glucosa y alguno
(o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácido, por lo que el tubo permanece
amarillo.

F-CV3-3B-2 12 REV. JUNIO 2007

- No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta únicamente utilización oxidativa de
peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.
- Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
-
2. Acción sobre las proteínas
Hidrólisis de la gelatina:
Primer día
- Rotula cada tubo con el nombre de la cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.

- Inocula cada cepa en un tubo con gelatina, haciendo uso de un asa en punta, introduciendo de manera
vertical hasta el fondo del tubo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa los resultados. Observa la hidrólisis de la gelatina
-
Producción de indol:
Primer día
- Rotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.
- Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Agrega 4 gotas del reactivo de Kovac´s, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo que
presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
- La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del
tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo.
- Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecerán sin cambio
alguno (reacción negativa).
-
Producción de sulfuro de hidrógeno:
Primer día
- Por la técnica de puntura y estría, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de E. coli y P.
vulgaris.
- Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Observa el ennegrecimiento del papel de filtro, por la producción del sulfuro de hidrógeno (reacción
positiva).
-
3. Pruebas bioquímicas diferenciales
Utilización del citrato:
Primer día
- Siembra por la técnica de estría en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter aerogenes.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en 24 a 48
horas.
- Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
-
Hidrólisis de la úrea:
Primer día
- Por la técnica de estría, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No inocular el
fondo.
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 - Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo.
- La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.
-
Prueba de la catalasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de
Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inóculo a un portaobjetos limpio.
- Añade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
-
Reacción de la citocromo oxidasa:
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de E.coli o
Ps. aeruginosa, y transferir el inóculo a una tira del reactivo de oxidasa.
- Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo intensa en la tira,
en un máximo de 5 segundos.
-
-
5.5 Resultados
Reporta los resultados y explica el fundamento bioquímico de cada una de las pruebas
. realizadas en la práctica

5.6 Cuestionario.
1. ¿Cómo podría emplear las conclusiones que derivan de esta práctica para clasificar a las bacterias?

5.7 Fuentes de información

 Prescott L / Harley J, / Klein D. Microbiología 576/P 85, 2000
 Mac faddin, Jean F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.
Madrid. 574.19285/412. 2003

F-CV3-3B-2 14 REV. JUNIO 2007

VI PRACTICA Nº 6

METODOS FISICOS Y QUIMICOS DE CONTROL MICROBIANO

6.1 Marco teórico

1. Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias
La muerte microbiana se produce cuando una célula no puede volver a dividirse para formar dos nuevas
células o sea pierden su viabilidad
En esta practica vamos a determinar si un tratamiento específico mata todas las células, si reduce su
número hasta niveles aceptables o si simplemente detienen el crecimiento durante un período de tiempo
limitado
Los aspectos químicos de esta práctica se limitan a los compuestos que son normalmente tóxicos y que
se consideran como materiales desinfectantes o antisépticos
2. Efecto de los desinfectantes químicos:
Con frecuencia se desea una rápida desinfección y esterilización a temperatura ambiente, sobre todo para
diferentes objetos que pueden dañarse al aplicarles calor.
Existen varios compuestos químicos tales como los fenólicos, el formaldehído, alcoholes, halógenos y
detergentes, para la desinfección a la temperatura ambiente.
Una práctica muy común ha consistido en considerar al etanol al 70% y el isopropanol como soluciones
esterilizantes universales.

6.2 Competencias
- Elabora un listado de productos farmacéuticos cuya fabricación sea resultado de procesos
biotecnológicos
- Ensaya y observa el efecto de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias.
-
6.3 Materiales y equipos
1. Desarrollo bacteriano:
- Cultivos de la práctica anterior sembrados en los distintos medios
Características morfológicas de los cultivos bacterianos.
-
2. Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias:
- Lámpara de luz ultravioleta
- Solución de: merthiolate 1/1000, tintura de yodo, cristal violeta, fenol al 5%, Savlon 1/200
- Discos de Papel filtro
- Placas con agar nutritivo
- Cultivo de: Escherichia coli, Staphylococcus, Bacillus subtilis
- Baño maria
- Frasco con 30 mL de caldo nutritivo
- Pipetas estériles de: 1 mL y 5mL
- Placas petri estériles (6 por cada grupo)

F-CV3-3B-2 15 REV. JUNIO 2007

 - Tubos estériles (8 por cada grupo)
- Tubos con Agar nutritivo (4 por cada grupo)
- Hisopos estériles
- Asas de siembra

6. 4 Procedimiento
3. Acción de los agentes físicos y químicos sobre la viabilidad de las bacterias:
Acción del calor (llama directa)
- Esteriliza el asa de siembra a la llama directa del mechero.
- Toma el inóculo y siembra en la mitad de la placa con agar nutritivo
- Esteriliza el asa de siembra, tomar otro inoculo, somete a la acción de la llama directa y siembra en
la otra mitad del agar.
- Rotula e incuba a 37ºC durante 24 horas.
-
Acción del calor húmedo
- Contamina el fondo de cada uno de cuatro tubos con una gota de cultivo de Bacillus subtilis,
evitando tocar las paredes del tubo.
- Calienta cada uno de los tubos por flameado, desde la boca del tubo hasta unos 3 cm del fondo.
- Sumerge por 10 minutos cada uno de los tubos, en un baño de agua tal como sigue: el primer tubo a
40ºC, el segundo tubo a 70ºC, el tercer tubo a 100ºC; el cuarto tubo servirá de control.
- Añade a cada uno de los tubos en condiciones asépticas 5 mL de caldo nutritivo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
- Procede de manera similar con los otros 4 tubos, pero usando como cepa, el cultivo de Escherichia
coli.
-
Acción de la radiación ultravioleta
- Licua el agar en baño maria a 50ºC.
Siembra en superficie:
- Vierte el contenido de un tubo de agar licuado en una placa estéril y deja solidificar. Hacer lo
mismo en la placa restante.
- Coloca una gota del cultivo asignado en el centro de cada una de las 2 placas y siembra con un
hisopo estéril en toda la superficie de la placa. Dejar secar 30 minutos
Siembra en el medio:
- Transfiere 0.1 mL de los cultivos asignados, en cada uno de los 2 tubos restantes.
- Mezcla por rotación y vierte todo el contenido en su respectiva placa Petri. Deja solidificar
- Exponer las placas a la lámpara ultravioleta en la forma siguiente:
-

Método de siembra
Siembra en superficie Siembra en todo el medio
Placa Nº 1 Placa Nº 2 Placa Nº 1 Placa Nº 2
Tiempo de exposición a la luz
2 minutos 5 minutos 2 minutos 5 minutos
ultravioleta
- Incuba por 24 horas y anota los resultados
-
Acción de los agentes químicos
- Inocula abundantemente la superficie de una placa de agar, con 3 asadas del microorganismo en
estudio. Disemina uniformemente.
- Con una pinza previamente esterilizada, coloca los discos de papel embebidos con las sustancias
suministradas y equidistantes entre sí.
F-CV3-3B-2 16 REV. JUNIO 2007
 - Incuba a 37ºC por 24 horas.
-
Efecto de los desinfectantes químicos:
- Inocula 0,1 mL de Escherichia coli, en un tubo conteniendo desinfectante.
- Repite lo anterior utilizando TSB en lugar del desinfectante (tubo control).
- Toma una asada del primer tubo a los 5 minutos y siembra por el método de estría en un cuadrante
de la placa de agar nutritivo.
- Repite el procedimiento en los tres cuadrantes restantes a los 10, 20 y 30 minutos.
- Procede de igual forma con el tubo control.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
-
6. 5 Resultados
Reporta y describe:
1. Las características del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos ensayados.

6.6 Cuestionario
1.- El cuestionario se proporcionara a medida que se desarrolle la práctica
 6.7 Fuentes de informacion
 Brooks G. F Butel, J.S Morse S.A Microbiología médica de Jawetz, Melnick, y Adelberg Editorial El
Manual Moderno S.A de C.V 23ª. Edición. México, 2005.

F-CV3-3B-2 17 REV. JUNIO 2007

VII PRACTICA Nº 7

EFECTOS DE LOS ANTIBIÓTICOS SOBRE LAS BACTERIAS

7.1 Marco teórico

Los antibióticos (anti, -contra; bios , -vida) constituyen un grupo de compuestos terapéuticamente útiles.
Estos compuestos químicos se caracterizan por ser subproductos metabólicos de un microorganismo, y casi
siempre son letales para otro microorganismo no relacionado. A partir de 1940, se aislaron numerosos
antibióticos, que probaron ser eficaces contra una variedad de m.o patógenos ( bacterias y hongos )
La investigación en este campo sigue constituyendo uno de los principales objetivos de la industria
farmacéutica.
La acción de los antibióticos sobre las bacterias se puede demostrar in vitro de diferentes maneras. Un modo
preciso de ellos es por el método de dilución en tubo. Existe también el método del disco único de
sensibilidad ideado por Kirby y Bauer.

7. 2 Competencias
- Aplica métodos para evaluar la actividad antimicrobiana in -vitro
- Obtiene la concentración mínima inhibitoria de antibióticos en estudio

7.3 Materiales y equipos

- Frasco con 100 mL de caldo Mueller – Hinton
- Placas con agar Mueller – Hinton
- Escala de Mc Farland 0.5
- Cultivo de E.coli
- Cultivo de S.aureus
- Cultivo de Ps.aeruginosa
- Discos de antibióticos
- Hisopos estériles
- Pinzas estériles
- Solución de antibiótico a una concentración de 1000 mg/mL
- Tubos estériles de 16 x 150
- Pipetas estériles de 10 mL
- Pipetas estériles de 5 mL

7. 4 Procedimiento
1. Método de difusión en agar
Primer día
- Prepara una dilución de la bacteria en estudio equivalente a 0.5 de la escala de Mc Farland (1.5 x 10 8
bacterias).
- Siembra una placa de agar Mueller – Hinton con un hisopo embebido en la dilución anterior.
- Coloca los discos de los antibióticos con ayuda de las pinzas estériles a 2 cm del borde de la placa y
equidistantes entre si.
- Presiona suavemente cada disco para que se adhiera al agar.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Después de la incubación, observa los halos de inhibición alrededor de los discos de antibióticos.

F-CV3-3B-2 18 REV. JUNIO 2007

 - La sensibilidad del microorganismo a los antibióticos utilizados, se establece por comparación en una
gráfica de tamaños de la zona.
-
2. Método de dilución en tubo
Primer día
- Con una pipeta de 10 mL tomar el cultivo proporcionado y dejar caer una gota al frasco que contiene
100 mL de caldo Mueller – Hinton.
- Mezcla y con la misma pipeta, repartirá el caldo en 10 tubos estériles, inoculando el primer tubo con
9 mL y los restantes con 5 mL del caldo.
- Prepara una fila de diluciones del antibiótico de 100 mg a 4 ug; con la pipeta de 5 mL toma 1 mL de
la solución de antibiótico e inocula el primer tubo.
- Mezcla y saca 5 mL para el segundo tubo y así sucesivamente hasta el noveno tubo.
- Del noveno tubo, saca 5 mL y elimina conjuntamente con la pipeta.
- El tubo Nº 10 no recibirá antibiótico y servirá como control del desarrollo bacteriano.
- Incuba los tubos a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa la turbidez de los tubos comparándola con la del tubo control (Nº 9).
- Los tubos que no presentan turbidez se debe a que la bacteria fue inhibida en su desarrollo.
- La menor concentración de antibiótico que inhibió el desarrollo bacteriano será la MIC.

7 . 5 Resultados
1. Reporta los resultados obtenidos (diámetro de los halos) de los microorganismos empleados frente al
antibiótico analizado.
7.6 Cuestionario
- Se realizará a medida del desarrollo de la práctica

7.7 Fuentes de información

 Brooks Geo F.; Butel, Janet. S., Morse Stephen. A.: Microbiología médica. 17a. Edición. México,
Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2002.
 Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J. Brook. Biología de los Microorganismos 10 ed. Madrid,.
Prentice Hall Iberia. 1999
 Ramos Gorbeña Juan Carlos Sena Chumbes, Fernando Agurto Saenz Torres . Microbiologia básica Colora
ciones de bacterias y la bioquímica en los medios de cultivo 2004.

PRIMER EXAMEN ESCRITO

F-CV3-3B-2 19 REV. JUNIO 2007

IX PRACTICA Nº 8

PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( I )

8. 1 Marco teórico
1. Estudio de los estafilococos
La patogenicidad de una especie de Estafilococo, se determina por producción de hemolisina,
fermentación del manitol y producción de las enzimas coagulasa y desoxiribonucleasa.

2. Estudio de los estreptococos

Agrupados originalmente por su capacidad para producir lisis de los hematíes, así tenemos los
estreptococos alfa, beta y gama hemolíticos, según sea la lisis parcial, total o nula.
Existen varias pruebas específicas para el estudio de estos microorganismos como son:
- Prueba de la bacitracina, que se usa para la diferenciación de un estreptococo Beta hemolítico del
Grupo A, de los Beta hemolíticos del Grupo No A.
- Prueba de CAMP, que se usa para la diferenciación de un estreptococo beta hemolítico Grupo A, del
estreptococo beta hemolítico grupo B.
- Prueba de la catalasa, para evidenciar la presencia de esta enzima sobre el peróxido de hidrógeno.
- Prueba de Optochin, para evidenciar la sensibilidad del S. pneumoniae al Optochin del y la
resistencia del S. viridans
- .
8. 2 Competencias
- Ensaya los métodos de identificación diagnóstica in Vitro de especies representativas del género
Staphylococcus y Streptococcus.

8. 3 Material y métodos
Placas con agar sangre
Placas con agar manitol salado
- Placas con agar DNA
- Cultivo de: Staphylococcus aureus y S. epidermidis; Streptococcus viridans, S. pyogenes, S.
pneumoniae y S. agalactiae
- Set de colorantes Gram
- Reactivo de coagulasa
- Solución HCl 1N
- Solución de peróxido de hidrógeno al 3%
- Discos de Bacitracina
- Discos de Optochin

8 . 4 Procedimiento
1. Estudio de los estafilococos
Coloración y morfología
- Efectúa frotices en láminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Después de fijarlas al calor, realiza coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características morfológicas.

F-CV3-3B-2 20 REV. JUNIO 2007

 Inoculación en agar sangre
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y lo di vide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estafilococos: S. aureus y S.
epidermidis.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar sangre.
-
Crecimiento en agar manitol salado
Primer día
- Toma una placa de agar manitol salado y dividelo en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con las mismas cepas del ejercicio anterior.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el crecimiento en agar manitol salado y describe la morfología de las colonias.
- Observa el viraje del color del indicador rojo de fenol, debido a la acidez
- .
Prueba de la coagulasa
Primer día
- Toma dos tubos que contienen 0.5 mL de plasma de conejo (reactivo de coagulasa).
- Inocula cada uno de ellos con 0.1 mL de cada una de las dos cepas de estafilococos.
- Incuba a 37ºC.
- Observa cada hora la aparición de coágulos, por espacio de 4 horas.
- De ser negativo el resultado, se deja incubando y se hace una lectura final a las 24 horas.
- Si aparece un coágulo, la bacteria posee la enzima coagulasa.
-
Acción de la DNAsa
Primer día
- Toma una placa de agar DNA y la divide en dos sectores.
- Inocula en una mitad con el cultivo de S. aureus y la otra mitad con S. epidermidis.
- En ambos casos, la siembra la realiza con un solo trazo lineal perpendicular a la línea divisoria.
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- Agrega a la superficie del agar 1 ml de HCl 1N y espera unos minutos.
- El HCl 1N precipita el DNA contenido en el medio de cultivo, enturbiándolo.
- Observa la presencia de la enzima DNAsa, por la aparición de un halo transparente alrededor de la
siembra, que indica la ausencia de DNA.
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada de cada cultivo de S. aureus y S. epidermidis y lo coloca sobre un portaobjetos
limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
2. Estudio de los estreptococos
Coloración y morfología
- Efectúa frotis en laminas portaobjetos con cada una de las cepas.
- Después de fijarlas al calor, realice coloraciones de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características morfológicas.

F-CV3-3B-2 21 REV. JUNIO 2007

 -
Inoculación en agar sangre
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y la divide en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S. viridans (alfa
hemolítico) y S. pyogenes (beta hemolítico).
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa las diferencias de hemólisis en agar sangre.
-
Prueba de la bacitracina
Se usa para la diferenciación de un estreptococo Beta hemolítico del Grupo A, de los Beta hemolíticos
del Grupo No A.
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y divíde en dos sectores.
- Inocula cada sector correspondiente con cada una de las cepas de estreptococos: S.agalactiae y
S.pyogenes y coloca cuidadosamente y en forma estéril con ayuda de una pinza, un disco de
Bacitracina en cada mitad.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa el halo de inhibición, indicando la susceptibilidad a la Bacitracina del S. pyogenes.
-
Prueba de CAMP
Se usa para la diferenciación de un estreptococo beta hemolítico Grupo A, del estreptococo beta
hemolítico grupo B.
Primer día
- Inocula con trazo lineal en una placa de agar sangre, una colonia de S. aureus.
- Luego perpendicular al trazo anterior, inocula las cepas de estreptococos: S. agalactiae y S.
pyogenes en cada mitad de la placa sin tocar la cepa de estafilococo.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa los resultados obtenidos.
- El estreptococo beta hemolítico Grupo B (S.agalactiae), produce una sustancia (factor CAMP), que
agranda la zona de hemólisis producida por el estafilococo, factor que no posee el estreptococo beta
hemolítico Grupo A (S. pyogenes).
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada del cultivo de Streptococcus pyogenes y coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Añada 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
-
Prueba de Optochin
Primer día
- Toma una placa de agar sangre y la divíde en dos mitades.
- Inocula una mitad de la placa con S. viridans y la otra mitad con S. Pneumoniae y coloca
cuidadosamente y en forma estéril con ayuda de una pinza, un disco de Optochin en cada mitad.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.

8. 5 Resultados
Observa y reporta los resultados

F-CV3-3B-2 22 REV. JUNIO 2007

 8.6 Cuestionario
¿Qué factores condicionan la patogenicidad del S. aureus en comparación con otras especies de
estafilococos?
1. ¿Qué enfermedades produce el S. epidermidis y el S. saprophyticus?
2. Es recomendable en un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalistis, hacerse un examen de
secreción faríngea a fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes

8. 7 Fuentes de información
 Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. ,23a ed.
México. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2005 616.01/B84/ 2005.

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X.- PRACTICA Nº 9

PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( II )

9. 1 Marco teórico
1. Grupo Clostridia
Son formadores de esporas, anaerobios estrictos, cuyas especies patógenas se caracterizan por producir
exotoxinas muy importantes. Entre las enzimas mas importantes que producen son las proteolíticas.
Grupo Bacillus
El genero Bacillus, agrupa microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, Gram positivos,
caracterizados por su capacidad de producir endoesporas y que pueden sobrevivir en el ambiente por
mucho tiempo.
9. 2 Competencias
- Manipula en el Laboratorio especies del género Bacillus y Clostridium

9. 3 Materiales y equipos
- Cultivo de: Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis
- Tubos con gelatina
- Placas con agar sangre
- Tubos con caldo tioglicolato
- Tubos con TSA
- Peróxido de hidrógeno
- Set de coloración de esporas
- Set de coloración Gram

9. 4 Procedimiento
1. Grupo Clostridia
Coloración de gram y morfología
- Realiza frotices de los cultivos de ambos microorganismos los fíja al calor y colorea según la
técnica de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión y anota las características tintoreales y de
morfología de estos microorganismos.
-
Coloración de esporas
- Hace frotices de los cultivos de ambos microorganismos los fíja al calor y colorea según la técnica de
coloración de esporas.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
- Anota el tipo de esporas y su ubicación terminal, subterminal o central de ambas especies de
gérmenes
-
Cultivo en agar solidificado rápidamente
Primer dia
- Fundirá dos tubos de TSA.
- Enfriará los tubos a aproximadamente 45ºC.
F-CV3-3B-2 24 REV. JUNIO 2007
 - Inoculará cada tubo con los cultivos provistos.
- Agitará el tubo golpeándolo ligeramente con los dedos.
- Enfriará los tubos rápidamente poniéndolos bajo una corriente de agua fría.
- Luego limpia los tubos y rotula.
- Incuba hasta la siguiente clase.
Siguiente clase
- Después de la incubación, observa los tubos e indica las regiones donde se produjo el desarrollo.
-
Inoculación en caldo tioglicolato
Primer día
- Inocula cada tubo con el medio de tioglicolato con los cultivos provistos.
- Incuba los tubos a 37ºC durante 48 horas.
Lectura
- Después de transcurrido el tiempo de incubación, observa las regiones de crecimiento en el medio.
-
Grupo Bacillus
Coloración y morfología
- Prepara frotices del cultivo de Bacillus subtilis y colorea por la tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
- Observa los bacilos dispuestos en cadenas largas con los extremos rectos. Las esporas se localizan
generalmente en la parte subterminal del bacilo y aparecen como áreas no teñidas.
-
Inoculación en agar sangre
Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en agar sangre por el método de dispersión – agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el agar sangre, observa la beta – hemólisis producida por B.subtilis.
-
Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de B.subtilis en TSA por el método de dispersión – agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Observa las características de la colonia, gris blanquecina, grande, extendida, de bordes irregulares.
-
Hidrólisis de la gelatina
Primer día
- Siembra por el método de puntura en el tubo con gelatina.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Enfria el tubo y observa la hidrólisis de la gelatina.
-
Prueba de la catalasa
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Añade 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.
- Observa si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
- Descarta la lámina en un recipiente con desinfectante.
-
Movilidad
- Toma una asada del cultivo de B.subtilis y lo coloca sobre un portaobjeto limpio.

F-CV3-3B-2 25 REV. JUNIO 2007

 - Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del B.subtilis utilizando el
objetivo de 40x.
-

9 .5 Resultados
Esquematiza y reporta los resultados obtenidos en cuanto a su morfología microscópica y
las características de cada uno de los microorganismos trabajados en la practica

9. 6 Fuentes de informacion
 Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 23 ed.
Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V., 2005.

F-CV3-3B-2 26 REV. JUNIO 2007

XI.- PRACTICA Nº 10
PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA MEDICA ( III )

10 .1 Marco teórico
1. Grupo Enterobacterias
Las diferentes especies de enterobacterias se identifican por su actividad metabólica en diferentes
medios de cultivo que contienen carbohidratos, proteínas, aminoácidos, etc. Estos microorganismos no
producen citocromo – oxidasa, lo que las diferencia de las Pseudomonas, Alcalígenes, Aeromonas y
Vibrios.
2. Grupo Pseudomonas
Algunas especies son patógenas oportunistas para el hombre, siendo la mas importante Pseudomonas
aeruginosa por ser la especie mas frecuentemente asociada con enfermedad humana. P.aeruginosa
desarrolla fácilmente en los medios de cultivo, la mayoría de las especies son identificadas en base a su
olor característico, morfología colonial, pigmentos y otros.
3. Grupo Vibrios
En el género Vibrio se describen dos grupos: un grupo comprende a Vibrio cholerae, causante del cólera
y los Vibrio no aglutinantes que pueden producir diarreas no epidémicas. Otro grupo, lo conforman las
especies halofilicas, que tienen afinidad por el cloruro de sodio. Entre estos, V. parahaemoliticus, que
puede producir enfermedades similares al cólera pero sin ser tan severas.

10. 2 Competencias
- Ensaya los métodos de identificación diagnóstica in Vitro en el laboratorio de especies
representativas: Escherichia coli, Salmonella, Shigella , Vibrio.y Pseudomonas aeruginosa

10. 3 Materiales y métodos

Grupo Enterobacterias

- Placas con agar: Mc Conkey, SS, EMB, TSI, Citrato de Simmons

- Tubos con agar: Urea, SIM
- Tubos con caldo: VP – RM, peptonado, lactosado
- Campanas de Durham
- Cultivo de: E.coli, Salmonella tiphy, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes,
Proteus vulgaris
- Set de colorantes Gram
- Reactivos de: Kovac´s, Rojo de Metilo, Voges – Proskauer: (alfa – naftol al 5% y KOH – creatina al
40%), oxidasa
- Láminas porta y cubreobjetos
Grupo Pseudomonas
- Tubos con: TSA y TSI
- Tubos con TSB
- Cultivo de Pseudomonas aeruginosa
- Set de coloración Gram
F-CV3-3B-2 27 REV. JUNIO 2007
 - Reactivo de oxidasa

-
Grupo Vibrio
- Cultivo de Vibrio cholerae
- Cultivo de Vibrio parahaemolyticus
- Placas con agar TCBS
- Tubos con agar TSI
- Reactivo de oxidasa
- Set de coloración Gram
- Desoxicolato de sodio
10. 4 Procedimiento
1. Grupo Enterobacterias
Coloración y morfología
- En su mesa encontrará una cepa representativa de los siguientes grupos: Proteae, Escherichiae,
Salmonellae, Shigellae, y Klebsiellae; con la cual trabajará durante toda la práctica.
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
-
Movilidad
- Toma una asada de la cepa del cultivo proporcionado y lo coloca sobre un portaobjetos limpio.
- Coloca una laminilla encima del portaobjetos y observa la movilidad del microorganismo
utilizando el objetivo de 40x.
-
Inoculación en agar Mc Conkey
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento la placa con agar Mc
Conkey.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- La degradación de la lactosa a ácidos se manifiesta por el viraje de color a rojo del indicador de pH
rojo neutro; siendo estas colonias, lactosa – positivas.
- Las colonias que son lactosa – negativas son incoloras
-
Inoculación en agar EMB (Eosina – Azul de Metileno)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión –agotamiento en la placa con agar EMB.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- En el medio EMB observa colonias negruzcas con brillo metálico verdoso, cuando metabolizan la
lactosa o sacarosa y translúcidas o de color ámbar si son lactosa – negativas.
-
Inoculación en agar SS (Salmonella – Shigella)
Primer día
- Siembra la cepa proporcionada por el método de dispersión – agotamiento en la placa con agar SS.
- Incubar a 37ºC por 24 horas.
Segundo día

F-CV3-3B-2 28 REV. JUNIO 2007

 - En el medio SS, la detección de coliformes se comprueba cuando hay degradación a ácido mediante
el indicador de pH rojo neutro y observará colonias negras, si las bacterias producen sulfuro de
hidrógeno.

Diferenciación metabólica del grupo de Enterobacterias

Primer día
- Con la cepa asignada, procede a inocular por los métodos de siembra adecuados, los siguientes
medios:
- Caldos: Lactosado, peptonado y MR-VP
- Agar: Urea, TSI, SIM, Citrato
- Incuba a 37ºC por 24 horas
Segundo día
- El alumno anotará los resultados de este ejercicio y efectuará la identificación de la cepa
proporcionada. Comparará los resultados con la tabla proporcionada: Ver tabla: 10-1.
a) Caldo Lactosado: después del período de incubación, observe el resultado obtenido (cambio de
coloración, presencia de gas) y compare con los resultados de los demás alumnos de la clase.
b) Agar Urea: la prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el
tubo y es negativa, si el medio permanece del color original. Observe el resultado obtenido y compare
con los resultados de los demás alumnos de la clase.
c) Agar TSI: es indispensable que la lectura en el plazo establecido y observe:
- Producción de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
- Fermentación de la glucosa únicamente (rojo/amarillo).
- Fermentación doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo).
- No fermentación de carbohidratos (rojo/anaranjado).
- Producción de gas: formación de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.
d) Agar SIM (Azufre – Indol – Movilidad):
- Detecta la producción de hidrógeno sulfurado por medio de la observación de un precipitado negro
en el medio.
- Realiza la prueba de producción de indol como en (e)
- Observa la movilidad del microorganismo, y realiza un examen macroscópico del medio por una
zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.
e) Caldo peptonado: después del período de incubación:
- Agrega en zona 4 gotas del reactivo de Kovac´s, en cada tubo que presenta desarrollo bacteriano,
luego agitar suavemente.
- La reacción es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del
tubo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo y es negativa si no hay cambio alguno.
f) Caldo MR –VP (reacción de Rojo de Metilo):
- Agrega 4 ó 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4
(ROJO) y 6.0 (AMARILLO).
- La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable y negativa si da una coloración amarillo –
naranja.
g) Caldo MR – VP (reacción de Voges – Proskauer): agregar a cada tubo:
- 10 a 12 gotas de la solución de alfa-naftol y 4 gotas de la solución de KOH – creatina.
- Agita después de agregar las soluciones por 1 minuto y deja en reposo durante 15 minutos.
- La reacción es positiva, si aparece una coloración rosada localizada en la mitad superior o en todo el
tubo dentro de los primeros 15 minutos (presencia de acetil-metil-carbinol) y negativa, si el color
inicial del medio de cultivo no cambia.
h) Agar Citrato:
- La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en 24 a 48
horas y negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.
Nota: para la lectura se recomienda hacer uso de las tablas de identificación bioquímica que describen las
reacciones de diagnóstico clave para identificar los géneros de las bacterias entéricas
.

F-CV3-3B-2 29 REV. JUNIO 2007

 Reacción de la Citocromo Oxidasa
- Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento del tubo con la cepa proporcionada, y transferir
el inóculo a una tira del reactivo de oxidasa.
- Considerara la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloración azul violáceo intensa en la
tira, en un máximo de 5 segundos.

2. Grupo Pseudomonas
Coloración y morfología
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por la tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
-
Inoculación en TSA
Primer día
- Siembra la cepa de Pseudomonas aeruginosa en TSA por el método de dispersión – agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día Observa las características de la colonia y presencia de pigmentación
- .
Inoculación en agar TSI
Primer día
- Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estría la superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias
.
Reacción de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias
Cultivo a 42ºC
Primer día
- Siembra la cepa de P. aeruginosa en los tubos de TSB por la técnica de inoculación.
- Incuba a 42ºC por 24 horas
Segundo día
- Observa la presencia o no de crecimientomicrobiano a 42 ºC, en los tubos
-
3. Grupo Vibrio
Coloración y morfología
- Prepara frotices de la cepa del cultivo proporcionado y colorea por tinción de Gram.
- Observa al microscopio con lente de inmersión.
-
Inoculación en agar TCBS (Tiosulfato – Citrato – Sales biliares –Sacarosa)
Primer día
- Divide la placa de TCBS por la mitad y sembrar en cada mitad las cepas de Vibrio por el método de
dispersión – agotamiento.
- Incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
- Las colonias de Vibrio cholerae que desarrollan en TCBS son circulares, con el borde ligeramente
opaco, con un halo claro alrededor y son amarillas por que metabolizan la sacarosa.
- Las colonias de Vibrio parahaemolyticus que desarrollan en TCBS son circulares, pegajosas, con
halo claro alrededor, y son de color verde porque no degradan la sacarosa

Inoculación en agar TSI

Primer día

F-CV3-3B-2 30 REV. JUNIO 2007

 - Con el asa de siembra, inocula en el centro del tubo y estría la superficie del pico de flauta.
- Rotula e incuba a 37ºC por 24 horas.
Segundo día
Realiza la lectura tal como se indica para las enterobacterias.
Reacción de la Citocromo Oxidasa, proceder tal como se indica para las enterobacterias.
Prueba del filamento o “String Test”
- Deposita una gota de la solución de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lamina portaobjeto.
- Emulsiona en ella una colonia de V.cholerae o V. Parahaemolyticus con el asa de siembra.
- Detecta la presencia de filamento al levantar el asa.

10 .5 Resultados
1. Esquematiza, registra y reporta los resultados obtenidos, identificando en cada caso la especie.

10 .6 Cuestionario
Describa el fundamento de las pruebas realizadas

10. 7 Fuentes de informacion

 Koneman, E. W.; Allen, S. D.; Dowell Jr., V. R.; Janda, W. M.; Sommers, H. M.; Winn Jr, W. C.: Color,
Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company. Third Edition. Philadelphia,
1997.
 Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.: Brook. Biología de los Microorganismos. Prentice Hall Iberia.
Madrid, 1999.

XII PRACTICA Nº 11

SEMINARIO DE INVESTIGACION DE VIRUS

F-CV3-3B-2 31 REV. JUNIO 2007

,

XIII PRACTICA Nº 12

MICOLOGIA

12. 1 Marco teórico

Los hongos normalmente se encuentran en la naturaleza como organismos saprofitos libres y son
principalmente patógenos oportunistas, la mayoría de los hongos no son patógenos para el hombre. Solo
unas 50 especies causan enfermedades en el hombre y la incidencia de enfermedades fúngicas graves es
muy baja, sin embargo ciertas infecciones fúngicas superficiales son bastante comunes.
Su estudio en el laboratorio, es posible mediante un dispositivo para cultivo en Cámara Húmeda sistema
esterilizado que consta de una placa petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio en
“U”que soporta dos láminas porta y cubre objetos. Asépticamente seccionar una pequeña porción de
medio de Agar Sabouraud y colocar sobre la lámina porta objetos. Sembrar el hongo y cubrir la
preparación con la otra lámina. La placa es incubada a temperatura ambiente (20-25ºC) por 4 ó 5 días.

12. 2 Competencias
Ensaya los métodos de estudio in vitro para la identificación e investigación de especies representativas del
medio ambiente y de importancia clínica.

12. 3 Materiales y equipos

- Placas petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.
- Agua destilada estéril.
- Dispositivo para cultivo en Cámara Húmeda.
- Mechero de alcohol.
- Solución de KOH al 10%
- Azul de metileno.
- Papel filtro.
- Varilla de vidrio en “U”.
- Agar Sabouraud.
- Láminas porta y cubre objetos, asépticas.

12. 4 Procedimiento
- Utilizando aguja de Kolle o estilete, picar una colonia y extrae una fracción mínima o micelio.
- Deposita esta fracción sobre la porción de agar dispuesta en el portaobjeto de la cámara húmeda.
- Con ayuda de una pinza estéril cubrirá la preparación con la lámina cubre objetos.
- Humedece el papel filtro de la placa con agua estéril. y examina diariamente al microscopio la
lámina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo.
F-CV3-3B-2 32 REV. JUNIO 2007
 - Retira cada vez la lámina de cultivo y observa , y si es necesario, añade más agua al sistema.
- Observa la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificación del micelio, la aparición de
hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproducción.
- Con ayuda de un Manual de identificación de hongos determina el género correspondiente.
-

12. 5 Resultados
Observa esquematiza e informa los resultados. Elabora esquemas en cada etapa de desarrollo

12. 6 Cuestionario
1. ¿Cuál es la ventaja del empleo de la cámara húmeda en el estudio de los hongos?
2. Existe diferencias entre hongos a nivel del crecimiento y diferenciación del micelio?. Explique.

12 . 7 Fuentes de información

 Levinson, W. E.; Jawetz, E.: Microbiología e Inmunología. Editorial El Manual Moderno. Segunda
Edición. México, 2000.
 Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 16
édicion. México. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.,.1999.




F-CV3-3B-2 33 REV. JUNIO 2007

XIV PRACTICA Nº 13

FAGOCITOSIS
13 .1 Marco teórico
La fagocitosis es la propiedad que tiene algunas células de englobar a las bacterias o cualquier cuerpo extraño
y tratar de destruirlas por acción de enzimas es un fenómeno no especifico y se incrementa cuando intervienen
anticuerpos especificos contra bacterias u otros antígenos
Entre las células fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos: monocitos libres y
células fijas; células que pertenecen al sistema retículo endotelial (RES).
En la práctica se comprobarán los resultados de la prueba de fagocitosis in vivo, obtenidos en ratones
normales y en ratones inmunizados inoculados con glóbulos rojos de carnero
13 . 2 Competencias
- Ensaya en el laboratorio el fenómeno de la fagocitosis

13 . 3 Materiales y equipos
- Suspensión de glóbulos rojos de carnero al 2%.
- Ratones normales.
- Ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero.
- Colorante de Leishman
- Equipo de disección.
- Láminas portaobjetos.
- Torundas de algodón.

13 . 4 Procedimientos
- Inocula 0,5 mL de suspensión de glóbulos rojos de carnero por vía intraperitoneal, a cada uno de los
ratones normales e inmunizados.
- Después de 30 minutos, sacrifica a los ratones por dislocación cervical.
- Previa desinfección con alcohol, abre la cavidad abdominal y realiza frotices del líquido peritoneal
utilizando las torundas de algodón.
- Seca al aire y colorea las láminas con Leishman.
- Observa la presencia de glóbulos rojos de carnero libres y la existencia de macrófagos con glóbulos
rojos englobados.

13 . 5 Resultados

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 Reportar los resultados de las observaciones hechas en las láminas coloreadas y comparar el promedio de
los glóbulos rojos fagocitados por los macrófagos tanto de los animales normales como de los fagocitados
13 . 6 Cuestionario
I. ¿Cuáles son los mecanismos de defensa de la respuesta inmune inespecífica? Explique.
II. ¿Qué es la respuesta inmune específica y de cuantos tipos puede ser ésta?. ¿Qué se requiere para que
se inicie la respuesta inmune celular?

13.7 Bibliografia recomendada

 Abbas, A. K.; Litchman, A. H.; Pober, J. S.: Inmunología Celular y Molecular.. 3a ed. Madrid, McGraw-
Hill Interamericana,1999.
 Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 23a.
Edición. México, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.,. 2005.

 Weir, D.M.; Stewart BSc, J: Inmunología. México Editorial El manual Moderno., 1999.

F-CV3-3B-2 35 REV. JUNIO 2007

XIV PRACTICA Nº 14

PODER BACTERICIDA DEL SUERO

14 . 1 Marco teórico
El líquido obtenido de la sangre que se deja coagular se conoce como suero. Este comprende varias
moléculas, pero no células ni factores de coagulación, el suero de un animal inmunizado de manera adecuada
contiene sustancias neutralizantes especificas Se caracterizan por ser termolábiles y no dializables.
Por capacidad de anteponerse a las toxinas bacterianas, se les denominó anticuerpos o inmunoglobulinas.
Desde hace 70 años se conoce un componente sérico con capacidad de lisar eritrocitos,y destruir bacterias
Gramnegativas. Actualmente se sabe que el complemento es un grupo de proteínas séricas en concentraciones
bajas en el suero normal las cuales se “activan” para formar una cascada enzimática.

14.2 Competencias
- Demuestra in-vitro el poder bactericida del suero.

14 . 3 Materiales y equipos
- Muestra de sangre de un paciente con hemocultivo positivo, para la obtención del suero.
- Tubos de prueba
- Suspensiones bacterianas de: Salmonella typhi y Satphylococcus aureus.
- Escala de Mc Farland
- Solución salina estéril.
- Agar Mueller Hinton
- Placas Petri estériles.

14. 4 Procedimiento
- Obtiene una muestra de sangre procedente de un paciente con hemocultivo positivo, luego separa el
suero asépticamente y lo almacena a –20º C.
- Coloca 0,5 ml de suero en cuatro tubos (luego de descongelarlo y homogenizarlo).
- Rotula los tubos con los números 1, 1’, 2 y 2’.
- Los tubos 1 y 1’ deben permanecer tal cual y los tubos 2 y 2’, deben ser sometido a calor (56º C por
30’)
- Trabaja paralelamente un blanco (0,5 mL de solución salina).
- Prepara las suspensiones bacterianas de los microoganismos de estudio, a una concentración similar al
tubo 0,5 de la escala de Mc Farland.
- Mezcla el contenido de cada uno de los tubos 1, 1’, 2, 2’ y blanco (cada uno contiene un volumen de
0,5 mL) con 0,5 mL de las suspensiones bacterianas preparadas.
F-CV3-3B-2 36 REV. JUNIO 2007
 - Incuba los tubos conteniendo las mezclas, a 37º C por 1 hora.
- Siembra por duplicado, por el método de incorporación.

14 .5 Resultados
Observa, reporta y explica acerca del crecimiento microbiano en cada placa

14.6 Cuestionario

I. ¿Cuáles son los mecanismos de defensa de la respuesta inmune inespecífica? Explique.

II. ¿Qué es la respuesta inmune específica y de cuantos tipos puede ser ésta?. ¿Qué se requiere para que
se inicie la respuesta inmune celular?

14.5 Fuentes de información

 Abbas, A. K.; Litchman, A. H.; Pober, J. S.: Inmunología Celular y Molecular.. 3a ed. Madrid, McGraw-
Hill Interamericana,1999.
 Brooks, G. F.; Butel, J. S., Morse, S. A.: Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 23a.
Edición. México, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.,. 2005.

 Weir, D.M.; Stewart BSc, J: Inmunología. México Editorial El manual Moderno., 1999.

F-CV3-3B-2 37 REV. JUNIO 2007

F-CV3-3B-2 38 REV. JUNIO 2007