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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 10 CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS POR EL


MÉTODO DE BIURET

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO


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OBJETIVOS
1. Cuantificar la concentración proteínas en diferentes muestras biológicas.
2. Determinar si los valores de proteínas en las muestras problemas son normales con relación a los
valores de referencia en suero y plasma.
3. Investigar la función de las proteínas que están presentes en suero, plasma, músculo, hoja, fríjol o
maíz.
4. Establecer de que es indicativo un aumento o disminución de las subfracciones o de las proteínas
totales séricas.

PREPARACIÓN PREVIA
1. Consultar cuales son los valores de referencia de proteínas en suero y plasma.
2. Determinar que diferencias hay entre suero y plasma
3. Leer el procedimiento y fundamento de la práctica.

MATERIALES EQUIPOS
1Plancha de agitación magnética 1 Centrífuga para tubos de 15 ml
1 Frasco Lavador 1 Pipeta Pasteur 1 Microcentrífuga
1 Agitador Magnético 4 Tubos de centrífuga de 15 ml. 4 Micropipetas de volumen Fijo de 100 μL ,
(alumnos) 250 μL, 500 μL y 1000 μL
1 Gradilla 1 Frasco de Alcohol (grupo) 2 Micropipetas de volumen variable de 100
μL y 1000 µL
1 Guardián 1 Pkte algodón e hisopos (grupo) 4 Espectrofotómetros y 8 Celdas vidrio .
1 Frasco para desechos 8 Tubos eppendorf
1 Beaker de 50 ml 14 Tubos de ensayo
4 Pipetas una de 1ml y tres de 5 ml Cinta y marcador permanente de
tubo (alumnos)

2 Morteros 1 Jeringa de 5 ml aguja de rosca


(alumnos)

3 Cajas de puntas blancas, amarillas


y azules.

1
REACTIVOS PREPARACIÓN
Reactivo de Biuret Solución A: disuelva 4,325 g de CuSO4 . 5 H2O en
aproximadamente 25 ml de H2O d.
Solución B: disuelva 43,25 g de Citrato de Sodio y 25 g de
Na2CO3 anhidro en aproximadamente 200 ml de H2O d calentado
simultáneamente. Cuando se enfríe coloque la solución A en la B
y disuelva por agitación magnética y lleve a volumen final de 250
ml.

Patrón de albúmina Sérica bovina 10 Pese 0,5 g de BSA y agregue 4.5 ml de agua destilada, disuelva
g/dL (Merck art A-7906) mediante agitación con vortex y complete a 5 ml de volumen final
con H2O d.

Solución Isotónica 0.85 % p/v Disuelva 0,2125 g de NaCl en 20 ml de H2O d y complete a 25


ml de volumen final.
Stock Buffer Pissum 20 ml de glicerol, 24.1 ml H2O, 12.5 ml buffer Tris HCl 1 M pH.
8.5, 2 g SDS.
Buffer Pissum Diluido 17 ml de stock, 3 ml de b Mercaptoetanol y 40 ml de H2O d.

Hidroxido de sodio al 3 %. Disuelva mediante agitación magnética 15 g de NaOH en 450 ml


de H2O d y lleve a volumen final de 500 ml en balon aforado.

Un pool de sueros claros que contenga 1 ml


de 6 – 8 g/dL de proteína previamente
cuantificados por el Método de
Kjeldhal.

Carbón Activado 1g
EDTA 1g
Hipoclorito de sodio 100 p.p.m 400 ml

INTRODUCCIÓN
Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes se hallan en todas las células, cumplen
diversas funciones biológicas como: trasporte de gases (hemoglobina, mioglobina); transporte de lípidos (
albúmina sérica, lipoproteínas de alta, media y baja densidad); defensa ante agentes extraños (anticuerpos Ig
A, Ig E, Ig D, Ig M, Ig G); hormonas (insulina, adrenalina, glucagón, calcitonina etc); regulación de la
neurotransmisión ( b endorfina, metencefalina, noradrenalina); catalizadores enzimáticos (todas las enzimas
de las diferentes rutas metabólicas por ejemplo glucosa 6 fosfatasa, piruvato cinasa, isocitrato deshidrogenasa
etc); soporte estructural (colágeno, elastina, quitina); en contracción muscular (miosina, actina); reparación
del material genético (ADN glicosidasas, AP endonucleasa Uvr–A etc); replicación de la información
genética (helicasas, ADN polimerasas, topoisomerasas etc); transcripción de la información genética (ARN
polimerasas etc [1, 2 ].

Las proteínas presentan diferentes pesos y tamaños moleculares y tienen los siguientes niveles de estructura:
primaria está determinada por el ordenamiento de los aminoácidos y las uniones de puentes bisulfuro,
secundaria conformaciones que se repiten periódicamente dentro del polipéptido debido a las interacciones
estéricas de los aminoácidos que están cerca originando la hélice α, hoja plegada  y bucles; terciaria está

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dada por la conformación tridimensional y cuaternaria por la forma como interaccionan entre si las proteínas
cuando hay más de una subunidad. También se clasifican por su forma en: globulares cuando las cadenas de
polipéptido se pliegan en forma esférica y fibrosa cuando las cadenas se organizan en cadenas largas u hojas
[3]. Están formadas por residuos de L- aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, cada aminoácido
está constituido por un grupo α amino, un radical α carboxilo y una cadena lateral (- R), unidos al carbono
α [4]. La cadena lateral permite dar la identidad a cada aminoácido y facilita que estos sean clasificados por
su polaridad en dos grupos polares y apolares o por el grupo funcional presente en R como aminoácidos:
alifáticos, aromáticos., hidroxilados, básicos, ácidos, azufrados etc. Algunas de estas propiedades son útiles
para la espectroscopia de absorción visible porque las proteínas pueden reducir un componente dentro del
reactivo o un elemento de este puede formar complejos con las proteínas, o uno de los reactivos puede
interaccionar con una región específica de la proteína utilizando las propiedades de polaridad o con un tipo de
enlace en particular, para que en los casos anteriormente mencionados se produzcan soluciones que
desarrollan color, por ejemplo al aplicar los métodos de Folin Lowry, Bradfored y Coomasie.

La cuantificación de proteínas es de gran importancia en diversos campos por ejemplo: en bioquímica clínica
las proteínas séricas permiten diagnosticar algunos desordenes y enfermedades; en biología molecular la
técnica SDS PAGE permite establecer peso molecular y separar subunidades de polipéptidos de distinto peso
molecular, para lo cual es relevante determinar la concentración de proteína en el extracto y el volumen que se
debe utilizar para sembrar en el gel a fin de poder visualizarlas las distintas subunidades con los diferentes
métodos de tinción; en biotecnología cuando se clona un gen de una enzima y se produce a gran escala
mediante birreactores se requiere de su concentración en g/L o g /dL para medir su velocidad catalítica
específica etc.

FUNDAMENTO
Cuando la urea es calentada cerca de 180 ° C se descompone para dar un producto llamado “Biuret” el cobre
contenido en este reactivo se une a las proteínas en medio alcalino para dar un complejo color violeta, el
color es dado por estructuras que contienen al menos dos enlaces peptídicos o por sustancias con dos grupos
-CONH2 ; -CH2NH2; -C(NH)-(NH2) ; CSNH2, unidos a través de C ó N directamente. El desarrollo de
color permite realizar una curva de calibración con diluciones de una proteína de concentración conocida
(estándar) que absorben la luz con diferente intensidad. Por lo tanto al aplicar la ley Lambert Beer o
regresión lineal se puede determinar la absortividad del complejo y hallar la concentración de una muestra
desconocida de una proteína o para una mezcla en solución. Esta reacción es la base de la determinación de
proteínas en suero y otros fluidos biológicos.

La máxima absorbancia del complejo proteína – Biuret en la región del visible se obtiene a 545 nm cuando la
absorbancia se lee contra un blanco de reactivos de Biuret. Si la curva se lee contra blanco de H2O el
máximo de absorbancia se obtiene a 580 nm. Las curvas de curvas de absorción del complejo proteína –
Biuret se pueden leer de la siguiente manera: complejo proteína – Biuret contra agua o complejo proteína –
Biuret contra blanco de reactivos. El complejo proteína – Biuret también presenta un máximo a 300 nm,
donde se incrementa cuatro veces la sensibilidad y la interferencia por turbidez también está aumentada.

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TRATAMIENTO DE MUESTRAS BIOLOGICAS
Extracción de Proteínas de Hoja

 Enfrié un montero a 4 C
 Pese 1 g de hoja.
 Adicione 1 ml de buffer Pissum y macere con ayuda de un mortero.
 Pase el extracto a un tubo de 1.5 ml e incube en baño de María por 1 h a 37 C.
 Centrifugue a 15.000 r.p.m por 25 min y recupere el sobrenadante transfiriendo a un tubo nuevo.
 Hierva el sobrenadante a 95 C 5 min.
 Guarde a – 20 C hasta su uso o refrigere a 4 C si va procesarlo el mismo día.

Extracción de proteína libre de músculo de pez.

 Enfrié un montero a 4 C.


 Pese 0.5-1 g de músculo.
 Adicione 1-2 ml de agua ó solución isotónica y macere.
 Centrifugue 4.500 r.p.m. por 3 min, recupere el sobrenadante y elimine pigmentos si es necesario
con carbón activado.
 Guarde –20 º C hasta su uso o a 4 C si va a procesar el mismo día.

Extracción de proteína libre en fríjol y maíz.

 Macere un grano de fríjol o maíz hasta obtener la harina lo más finamente posible.
 Pese en tubos eppendorf 300 mg y resuspenda en 600 µL NaCl 0.85 % y homogenice mediante
agitación por vortex. Rotule otros dos tubos de 1.5 ml y pese 15 mg de harina de fríjol ó maíz,
adicione 150 µL H20 destilada y homogenice mediante agitación por vortex.
 Guarde los tres tubos a –20 º C hasta su uso o refrigérelos a 4 C si va procesarlos el mismo día.

PROCEDIMIENTO MÉTODO BIURET


El ensayo se puede aplicar a soluciones cuya concentración de proteínas menores a 10 mg/ dL. Cuando la
concentración de las muestras sea superior a 10 g/dL diluya con solución isotónica o en agua destilada.

1. Utilice guantes de cirugía y tapa bocas durante el desarrollo de toda la practica de laboratorio.
2. Rotule con un marcador permanente o cinta un tubo corning de 15 ml como suero y siete tubos de
1,5 ml como: sangre completa Hemoglobina (SC Hb), plasma, plasma Biuret, suero Biuret, suero
α amilasa, suero inhibición α amilasa y un tubo 0.2 ml como plasma CCF aa (cromatografía en capa
fina de aminoácidos). Adicione 5 mg de EDTA en el tubo marcado como plasma.
3. Tome la jeringa que contiene los 5 ml de sangre periférica en ayunas (extraída por un experto) y
retírele la aguja descartándola dentro de un guardián.
4. Distribuya la sangre contenida en la jeringa haciendo un ángulo de 45° sobre la parte
interna de los tubos para dejar caer lentamente y así evitar hemólisis como se indica a continuación:
agregue 0.25 ml al tubo rotulado como sangre completa hemoglobina y tápelo, adicione 1 ml al
tubo marcado como plasma y el remanente de sangre adiciónelo en el que rotuló como suero.
Equilibre estos dos últimos y centrifugue a 4.200 r.p.m por 5 min en centrífuga o microcentrífuga
según sea el caso a fin de obtener el plasma y suero respectivamente. Pase el sobrenadante del
plasma al tubo marcado como plasma Biuret y plasma CCF de aminoácidos. Tome el tubo de suero
y llévelo a baño María para retraer el coagulo a 37 °C o déjelo a temperatura ambiente por 5 min,
con ayuda de un hisopo remueva el coagulo suavemente sin sacar del tubo y centrifugue nuevamente.

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5. Con una micropipeta de 1000 μL transfiera la mayor cantidad de suero a los tubos nuevos de 1.5 ml
que rotuló y tenga precaución de no llevar células rojas. Congele a -20 °C las dos muestras de
suero que se utilizarán en la practica de cuantificación de la actividad enzimática de α amilasa e
inhibición.
6. Separe con ayuda de una micropipeta la mayor cantidad en volumen de plasma obtenido y distribuya
de la siguiente manera: adicione 500 μL al tubo que rotuló como plasma biuret y agregue 100 μL al
tubo que marcó como plasma CCF aa; guarde este último en congelación hasta la práctica de
cromatografía de aminoácidos.
7. No hay cambio en las proteínas totales del suero de muestra (de suero o plasma) mantenidas a
temperatura ambiente por una semana y el suero es estable por 1 mes a ° 4 C.
8. Rotule 10 tubos de ensayo y procese los estándares de la curva de calibración, plasma y suero
como se indica en la Tabla 1. Utilice como control un suero de una persona normal o un pool de
sueros normales previamente cuantificados.
9. Si únicamente corre un patrón por análisis, entonces determine la concentración de la siguiente
manera.
g/dL= Abs Muestra X Concentración Patrón
Abs Patrón

Tabla 1. Elaboración de curva calibración y cuantificación de muestras biológicas por el método de


Biuret

ANEXO 10. Cuantificación de proteinas por el método de Biuret.


Tabla 1. Elaboración de curva calibración y cuantificación de muestras biológicas por el método de Biuret
Reactivos Fd B Patrón Patrón Patrón 1 2 3 4 5 6
2.5 g/dL 5,0 g/dL 10 g/dL
NaCl 0,85% 75 µL 50 µL
BSA 10 g/dL 25 µL
BSA 10 g/dL 50 µL
BSA 10 g/dL 100 µL
Extracto Fríjol 100 µL
Extracto músculo 100 µL
Extracto hoja 100 µL
Suero 100 µL
Plasma 100 µL
MP 100 µL
NaOH 3% 5 ml 4,9ml 4,9ml 4,9ml 4,9ml 5 ml 4,9ml 4,9ml 4,9ml 4,9ml
Biuret 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Deje en reposo 15 min a temperatura ambiente y lea contra blanco reactivos 545 nm

NOTA: el valor del complejo proteína-Biuret aumenta al máximo a los 15 minutos y es estable por varias
horas. Si va a realizar las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro Perkin Elmer utilice la mitad del
volumen para toda la mezcla de reacción.

10. Si únicamente corre un patrón por análisis, entonces determine la concentración de la siguiente
manera.
g/dL= Abs Muestra X Concentración Patrón
Abs Patrón
11. Descarte los residuos de reactivos en los colectores correspondientes e inactive las muestras
biológicas con hipoclorito de sodio 100 p.p.m.
12. Deseche las agujas en el guardián, jeringas y guantes en bolsa roja.

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INTERFERENCIAS
 Turbidez: se presenta frecuentemente en sueros lipémicos y en muchos de estos casos el éter
clarifica la solución. . Ocasionalmente cuando el suero es tanto ictérico como turbio, la extracción
con éter no es suficiente para la clarificación en tal caso la decoloración con KCN es empleada.

CÁLCULOS
1. Procese la Tabla 1 control de clase Anexo 10 para la curva de calibración, corrija los datos por
mínimos cuadrados y calcule los valores de intercepto, pendiente y coeficiente de correlación
2. Determine la concentración en g/ dL, mg/ mL para cada para cada muestra según el método
utilizado, compare con los valores de referencia y discuta. Convierta las concentraciones a g/L o
ng/L y regístrelos en la Tabla 2 Anexo 10.
3. Calcule la cantidad de L que se deben tomar de cada muestra si se requieren 50 g de proteína
para sembrar en una SDS-PAGE con tinción de Coomasie y registre en la Tabla 2 Anexo 10.
4. Calcule la cantidad de L que se deben tomar de cada muestra si se requieren 30 ng de proteína para
sembrar en una SDS-PAGE con tinción de plata y registre sus datos en la Tabla 2 Anexo 10.
5. Recuerde que la muestra será tratada en la siguiente practica con un volumen igual de buffer Carga
2X y el máximo volumen que se puede sembrar de esta mezcla en los pozos formados por los peines
0.75 mm, es 14 µL para la cámara miniprotean Bio Rad. Además el volumen mínimo que toman
las micropipetas del laboratorio es de 0.5 μL; por lo tanto si la muestra está muy concentrada se debe
diluir una alícuota previamente, a fin de obtener un volumen que sea fácilmente tomado por la
micropipeta (1-7 µL).
6. Establezca los valores mínimos y máximos que se pueden detectar en SDS PAGE si se realiza
tinción con plata o con azul de Coomasie y registre sus datos en la Tabla 2 Anexo 10.

Tabla 2. Registro de valores de concentración proteínas por método Biuret.

Volumen Volumen
Intrevalo Intrevalo
necesario necesario
Grupo Muestra Nombre Fd Biuret Biuret Biuret Biuret Fd detectado detectado
para para
coomassie plata
obtener obtener
g/dL mg/ mL μg/ μL ng/ μL 50 μg 30 ng μg/ μL ng/ μL
Coomasie Plata
1
2
3
4
5
MP

INVESTIGACIÓN
1. ¿Cuál es el fundamento, el límite de sensibilidad y las reacciones para los siguientes métodos:
Kjeldahl, Biuret, Folin Lowry, Bradford, Coomasie, Stoscheck y ácido bisincónico? Elabore una
tabla comparativa.
2. ¿Qué valores de bilirrubina, hemoglobina, sulfato de sodio y sulfito de sodio pueden interferir con el
método de Biuret?
3. ¿En cuales de las muestras tratadas en la práctica se cuantificaron proteínas totales?
4. ¿Qué interferencias pueden haber con los métodos de extracción de hoja y fríjol?
5. ¿Qué proteínas están presentes en músculo, hoja, fríjol o maíz?
6. ¿Cuáles proteínas de fríjol son solubles en agua y en solución salina?

6
7. ¿En qué casos las proteínas del suero están aumentadas?
8. ¿Qué indica un valor bajo de proteínas séricas?
9. ¿Qué método utilizaría si desea determinar proteínas totales en la muestra biológica y por qué?
10. ¿Qué métodos se utilizan para cuantificar subfracciones de proteínas séricas? Soporte con un
artículo.
11. ¿Cuál es el método más útil para separar proteínas plasmáticas?

RESULTADOS PARA SU ARTÍCULO

1. Establezca los tipos de reacciones químicas que se dan para la detección de proteínas en este
experimento.
2. Anexe el grafico de la curva de calibración corregida por mínimos cuadrados y los valores de la
Tabla 1 Anexo 10 con los valores de intercepto, pendiente, coeficiente de correlación y
concentración de proteínas para las diferentes muestras.
3. Determine en cuales de las muestras tratadas no se hallaron valores normales y discuta.
4. Establezca que indica a nivel metabólico un aumento o disminución de las proteínas plasmáticas o
séricas. Argumente sus resultados con los reportados por otros artículos.
5. Establezca cuales son los valores mínimos y máximos que se pueden detectar en proteína al
separarlas en geles SDS PAGE si se realiza tinción con nitrato de plata y con azul de Coomasie.
6. Adjunte los resultados de la Tabla 2 Anexo 10, calcule el volumen y el factor de dilución que debe
aplicar a las diferentes muestras para detectarlas en electroforesis SDS- PAGE por los métodos de
tinción propuestos y determine cuál es el más conveniente.

BIBLIOGRAFÍA

1. DARNELL, J., LODISH, H., & BALTIMORE, D. (1988). Biología Celular y Molecular. Barcelona:
Labor S.A. 670-671.
2. SPINEL, C. (2002). Biología Molécular de la Célula Eucarióta Animal. Bogotá: Marin Vieco Ltda.
159.
3. NELSON, D. L., & COX, M. M. (2001). Lehninger Principles of Biochemistry. New York: Worth
Publishers.116, 170.

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