Levedura - Lise

Medida de atividade total e específica (antes)

Cromatografia de troca-iônica
Medida de atividade total e específica (após)

Diálise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Sequenciamento e Identificação de proteínas

Sayuri Miyamoto 2017

Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas

Determinação da massa
molecular

Sequenciamento da
proteína
Determinação de Massa Molecular da Proteína

SDS-PAGE
Cromatografia de exclusão
Espectrometria de massas
Comparativo entre métodos que permitem determinação de massa

SDS-PAGE Mr Precisão
d
± 10 %
D
Migração relativa

Rm =d/D
Mr = massa molecular
(ou peso molecular)

Cromatografia de Exclusão
Precisão
± 1 %
Eluição relativa

Espectrometria de Massas

Método bastante sensível Precisão

Valores de massa/carga ± 0.01 %
bastante precisos
 Espectrometria de Massas
Como funciona a técnica?

Espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) é uma técnica analítica

extremamente sensível que permite determinar a massa molecular.
Ela também fornece informações acerca da estrutura da molécula.

O equipamento que faz a medida da massa é o Espectrômetro de Massas.

MALDI-TOF Q-TOF
 Espectrômetro de Massas
Características básicas de um espectrômetro de massas

SISTEMA DE
AQUISIÇÃO DE
DADOS
ALTO VÁCUO
ÍONS EM FASE GASOSA

+
AMOSTRA
Sample
_
Inlet
(ex. proteínas)

Fonte de Ionização Analisador de Massas Detector

ESPETRO DE MASSAS
(m/z)
 Espectro de Massas
O resultado obtido na análise por espectrometria de massas é um espectro de massas.

O espectro de massa é um gráfico que mostra a abundância (intensidade) relativa de cada íon com
massa/carga (m/z) definidos.

Importante: o equipamento faz uma medida da razão (m/z) entre a massa do íon (m) sobre a carga do
íon (z) e não da massa em si.

A molécula pode ser ionizada:

-pela adição de um ou mais prótons ( [M+nH+]n+): modo de ionização positiva
-pela perda de um ou mais prótons ( [M-nH+]n-): modo de ionização negativa

Proteínas e peptídeos
normalmente sofrem protonação
e são analisados como íons
carregados positivamente
 Ionização
IONIZAÇÃO (formação de íons com carga positiva ou negativa) é o primeiro passo
fundamental para que a molécula possa ser introduzida no analisador de massas

Duas principais técnicas de ionização ”BRANDAS (Soft)” empregadas para análise de

biomoléculas:
ELECTROSPRAY e o MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization).

Nobel Prize in Chemistry, 2002

John B. Fenn is the chemist who Koichi Tanaka research engineer who
invented the ELECTROSPRAY developed the MALDI technique (1987).
method (1988). Professor of Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.
Chemistry at Yale University, USA,
and at Virginia Commonwealth
University, USA
Ionização por Electrospray (ESI)

Voet Biochemistry 3e
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.

Massa =(m/z x z) – z

Massa =(1027.6) x (100) – (100)

Massa= 102760-100

Massa = 102660
Ionização por MALDI

Massa =(m/z x z) – z

Massa =(29281 x 1) – 1

Massa= 29280
Espectros de Massa de Proteína Intacta

ESI MALDI
Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas

Determinação da massa
molecular

Sequenciamento da
proteína

1-análise da composição de aa
2-análise da seq. de aa

Sayuri Miyamoto 2014

 1- Análise da composição total de aminoácidos
• Hidrólise de todas as ligações peptídicas em meio fortemente ácido ou básico ( 2-4 M de
NaOH ou 6 M HCl) ou por enzimas (mistura de proteases)

• Aminoácidos são separados por técnicas cromatográficas (exemplo HPLC)

Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr

HCl 6 M, 100C, 24h

Asp 1
His Glu 1
Lys Asn 1
Cys Trp Ser 1
Gln 0
Asp Gly His 1
Ala Gly 0
Arg
Thr 0
Arg 2
Tyr Ser Lys Ala 1
Glu Leu
Arg Asn Tyr 1
Met 0
Thr Ile Val 0
Phe 0
Ile 1
Leu 1
Derivatização pré-coluna Lys 1
(o-ftalaldeído, fenilisotiocianto, etc.)
 2-Sequenciamento de Proteínas

I. Redução de pontes de disulfeto usando agentes redutores como o 2-mercaptoetanol.

É importante alquilar as cisteínas para evitar que as pontes de disulfetos se formem
novamente.

II. Clivagem da cadeia polipeptídica usando métodos de clivagem específicos.

(ex. Proteases como a Tripsina).

+H
3N- -COO-
Tripsina
(Cliva após resíduos básicos Lys e Arg)

Fragmentos Peptídicos

* O uso combinado de mais de um método de clivagem ajuda no ordenamento das sequência de peptídeos,
principalmente no método de Sanger
 2-Sequenciamento de Proteínas
III. Sequenciamento dos fragmentos peptídicos

Degradação de Edman
(Sequenciamento a partir do N-terminal)

Limitado a oligopeptídeos de até 50 aa

Sequenciamento através de análise

por MS e/ou MS/MS

MALDI-TOF Q-TOF
 2-Sequenciamento de Proteínas
Edman desenvolveu um método que permite remover
Degradação de Edman (1950) aminoácidos sequencialmente a partir do N-terminal.
 Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg)

Como ordenar a sequência de peptídeos??

Usar mais de um método de clivagem da cadeia polippetídica....

Exemplo: Quimotripsina (Cliva após resíduos aromáticos)

Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr
INSULINA

Foi sequenciada por

Frederik Sanger

Prêmio Nobel em 1958

http://www.whatisbiotechnology.org/exhibitions/sanger/insulin
Degradação de Edman

Sequenciadores Automáticos

Limitações:
Tempo de análise longo!
Grande quantidade de amostra!
Muito lento para os padrões de hoje!!!

Hoje em dia o sequenciamento é feito

por espectrometria de massas.
(+rápido, requer pouquíssima amostra)
 Espectrometria de Massas

Análise de massa de Proteínas Intactas (MS)

Análise de massa de Peptídeos (MS)
Sequenciamento
Espectrometria de massas propiciou grandes avanços nas áreas de
Proteômica, Glicômica e Lipidômica

Wenk, M.R. 2010 Cell 143, 188.

Sequenciamento de proteínas por
espectrometria de massas
 Busca em Banco de
Dados (ex. Mascot)
Busca baseada
em dados de MS
(PMF)

Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo

selecionado
Busca baseada em
dados de MS/MS
(sequenciamento)
Exemplo de análise de glicosidase por
SDS-PAGE e espectrometria de massas
Determinação da pureza e da massa molecular da glicosidase por SDS-PAGE

Padrão de glicosidase
 Determinação da massa molecular da glicosidase por MALDI-TOF

Massa = 57287 Da

Inte ns . [a .u.]
57288.292

3000

2000

MALDI-TOF
1000

40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 75000

m /z
Remoção da banda da glicosidase, digestão com tripsina e
análise por espectrometria de massa

Tripsinização

MALDI-TOF-TOF
 Espetro de massa dos peptídeos da beta-glicosidase

Lista de
x10 4 peptídeos
Inte ns . [a .u.]

1179.511
m/z
698.315
2.5 742.326
780.283
866.400
936.431
2.0
963.414
963.414 1034.066
898.397 1082.483
1.5
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1.0 1361.555
1333.524
1383.528
1515.656
742.326 1515.656 1728.736
0.5
1783.703
1783.703
2065.844
1940.766
2383.836
2938.198 3313.082 4074.899 2089.867
0.0 2272.853
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 2288.853
m /z
2310.801
2938.198
Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados
Lista de
peptídeos
m/z
698.315
742.326
780.283
866.400
936.431
963.414
1034.066
1082.483
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1361.555
1383.528
1515.656
1728.736
1783.703
1940.766
2089.867
2272.853
2288.853
2310.801
2938.198
 Banco de Dados (Database)

Swiss-Prot
Se a proteína é de um organismo bem caracterizado como
humanos, camundongos, levedura, ou arabdopsis, o Swiss Prot é o
recomendado

NCBIprot
Se a proteína é de bactéria ou planta, usar o NCBIprot, pois é um
banco de dados mais amplo que o Swiss-Prot
 Modificações

Modificações fixas
Exemplo mais comum é a alquilação de cisteínas.
O alquilante mais comum é a iodoacetamida (carbamidomethyl) ou
ácido iodoacético (carboxymethyl).

Modificações variáveis
Exemplo:
- Oxidações que ocorrem durante o processamento de amostra
(oxidação de metionina)
- Modificações pós-traducionais (fosforilação)
Scores acima de 93: significantes (p<0.05)

O score obtido na busca foi de 121.

 Busca em Banco de
Dados (ex. Mascot)
Busca baseada
em dados de MS
(PMF)

Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo

selecionado
Busca baseada em
dados de MS/MS
(sequenciamento)
Sequenciamento de Peptídeos baseado em MS/MS
 Matching dos escpectros de MS/MS realizado por software

MS/MS MS/MS
Experimental Teórico

Sequência do
peptídeo
 Resumo: Identificação de Proteínas/Enzimas

1. Determinação da massa molecular

• SDS-PAGE
• cromatografia de exclusão molecular
• espectrometria de massas (MALDI-TOF, Q-TOF)

2. Determinação da sequência de aminoácidos

• Degradação de Edman
• Espectrometria de massas

Em ambos os casos proteínas precisam ser clivadas especificamente (ex.

Proteases) para gerar peptídeos menores.

A espectrometria de massas é a técnica mais precisa e mais utilizada

atualmente.
 Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli
- mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas

Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas

Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos

Proteínas são identificadas por espectrometria de massas

Lenhinger
Análise Proteômica de uma Célula Eucariótica (HeLa)
- mais de 2,000 proteínas identificadas

36761 espectros de MS/MS

Avisos:

Entregar exercício 1

Resolver exercício 2 em casa

Gabaritos e materiais da aula disponíveis na página do Sandro

Próxima aula (20/Junho) teremos plantão de dúvidas na sala 4

Prova 2 será no dia 27/Junho no Anfiteatro Vermelho