Microbiología- Antibiograma y Tinción Gram

Antibiograma

Mide la sensibilidad de una bacteria frente a diferentes antimicrobianos in vitro y a partir de

estos resultados predice la eficacia in vivo. Con un antibiograma se pueden obtener resultados
cualitativos que indican si la bacteria es sensible o resistente a un antibiótico, o cuantitativos
que determinan la concentración mínima (CMI) de antimicrobiano que inhibe el crecimiento
bacteriano (en µg/ ml o en mg/l).

La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) es la medida de la

sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de antimicrobiano que
es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones
normalizadas. Es el método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica.
Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control (de referencia) con el fin de que los
resultados sean reproducibles y comparables. Este método nos ofrece información sobre la
sensibilidad de las bacterias S (sensible), I (intermedia) y R (resistente).

- Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un

tratamiento a la dosis habitual.
- Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
- Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posología).

Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma rutinaria,
y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o
semiautomatizados). Se puede realizar mediante:
1.- Difusión en agar: Disco placa y E test
2.- Dilución: Medio sólido y Medio líquido (micro/macrodilución)
3.- Mecanizados y Automatizados

La Concentración Mínima Bactericida (CMB) es la mínima cantidad de antibiótico capaz

de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en condiciones estandarizadas.

Métodos
En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el de
dilución en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente existen varios
métodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibióticos y
todos ellos se realizan bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales.

Dilución en caldo
Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones
1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del microorganismo. Los
antibióticos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo
hasta obtener las concentraciones apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Después
de un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos que indica el
desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los que no
contengan suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su desarrollo. La concentración de
antibiótico que presente ausencia de crecimiento es la Concentración Mínima Inhibitoria.

Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo
sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.

A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de
caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias que crece en estos
subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del
cultivo original. La mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir
a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM).

Difusión en agar
Este método incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su introducción permitió
agilizar la determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas frente a un número
importante de antimicrobianos de forma simultanea. El empleo de los discos de papel de
filtro para las pruebas de sensibilidad está estandarizado y se correlaciona con las CMIs.
Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente cualitativa, el método de
difusión por disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre todo de su comodidad,
economía y fiabilidad, ha sido uno de los más utilizados en los laboratorios.

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie

se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante
16-24 horas y se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición
que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas
por la NCCLS. De esta manera se sabe si el microorganismo es Sensible, Intermedio o
Resistente a cada uno de los antibióticos.

Método de E-test
Es un método más reciente, es una combinación de características de los métodos anteriores.
Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI
en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de
antibiótico.
El microorganismo se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o
antibióticos) a ensayar. Se incuba durante 16-24 horas a 35ºC y se valora la zona de inhibición
alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse
que presente el crecimiento.

Métodos automatizados
La mayoría de estos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre
microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes
pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia).
Anteriormente se hacia por lectura óptica del técnico a través de un espejo invertido.

Son sistemas fáciles y rápidos, generalmente automatizada o semiautomatizada. Son métodos

ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de sus grandes limitaciones es que sólo
ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento rápido y que no tengan
requerimientos especiales.

Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva
a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se
visualizan de color rosa o rojo o grosella.

La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños,
morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para
un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos
en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las
bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias
en la composición de su pared y arquitectura celular.

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos
teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el
colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados de tonos desde
el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o
dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).

Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano
ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa
es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer colorante
acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el
cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol
y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante.
 Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de
Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realización, a saber:

· Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución

de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.

· La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o

fucsina básica es de 1 año y la de la solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en
frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente.

· Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con
cepas de colección de E.coli, S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados
esperados.
· Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación
microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado gruesas, uso
de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijación y
excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de pobres
resultados en la tinción de Gram.

· Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción
pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser
recuperados en el cultivo.

· Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal

especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias.

En cuanto a la reacción gram y características morfológicas de los microorganismos

visualizados, éstas son:
· Gram:
- Positivo: de violeta fuerte a azul claro.
- Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo será intenso).
- Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser
debido a una mala extensión, fijación o tinción, presencia de células viejas, daño en la pared
celular o por particularidades especiales de la pared celular de ciertos microorganismos.

- Neutro: no toman ningún color, siendo generalmente el fondo alrededor de

ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reacción
gram ha sido vista en tinciones de muestras clínicas en donde están presentes elementos
fúngicos o algunas espécies de micobacterias.

- Otras características: a examinar en el gram son si la tinción de los

microorganismos es homogénea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular.
Método
El método mas adecuado para practicar una tinción de Gram depende en parte del
microorganismo que se desea teñir, la matriz en que se halla suspendido y los prejuicios
personales del investigador que practica la tinción. Continuamos con la descripción de la
aplicación del método que ha sido útil en la mayoría de los casos.

Técnica
1. Preparar una extensión delgada y uniforme sobre el portaobjetos y dejar secar sin
calentar. En el caso de las muestras obtenidas con gasas o algodones por frotamiento hay
que hacer girar la muestra, apretando firmemente en una pequeña zona del portaobjetos.
Si se trata de líquidos como orina o cefalorraquídeos se coloca una gota en el centro del
portaobjetos y se deja secar sin extender. Los materiales más densos, como el pus y los
esputos, pueden extenderse uniformemente, evitando sobre todo que queden zonas
excesivamente gruesas.
2. Pasar el portaobjetos por una llama de gas varias veces con el fin de matar las bacterias
y fijarlas a este.
3. Cubrir el portaobjetos con solución de cristal violeta; añadir inmediatamente 2-3 gotas
de solución de bicarbonato de sodio y mezclar, inclinando el portaobjetos o soplando
sobre el. Dejar teñir durante 30-60 segundos.
4. Inclinar el portaobjetos para decantar el colorante y cubrir el cristal violeta con yoduro.
Dejar en reposo durante 30-60 segundos.
5. La decoloración constituye el paso mas critico de la técnica. Inclinar el portaobjeto para
decantar la solución de yoduro, y lavarlo con acetona-alcohol, manteniéndolo en un
ángulo de más de 15 grados, hasta que la solución deje colorearse de azul. No hay que
intentar decolorar las zonas mas gruesas de la extensión, ya que de esta forma se
decoloran excesivamente las zonas menos gruesas, que son precisamente las que podrán
ser estudiadas en el microscopio.
6. Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua fría corriente para eliminar el alcohol-
acetona, y detener así la decoloración.
7. Cubrir el portaobjetos con safranina; dejar 15-30 segundos y lavar con agua corriente.
8. Secar con un paño la parte inferior del portaobjetos para eliminar los restos del colorante;
dejar secar al aire.

Limitaciones
La duración de cada paso no es crítica, y puede variar en unos segundos y hasta 5 minutos.
De hecho los reactivos pueden aplicarse sucesivamente con tanta rapidez como permita la
manipulación de los colorantes. La decoloración es la fase mas critica. La tendencia es
siempre decolorar excesivamente, lo cual hace que las bacterias grampositivas parezcan
gramnegativas. Hay que lavar el portaobjetos con acetona-alcohol hasta que deje de
colorearse la solución de azul en las zonas menos gruesas. A continuación hay que lavar el
portaobjetos y dejar secar el contenido al aire para posteriormente estudias en el microscopio.
En caso de urgencia, puede secarse con papel absorbente. Sin embargo, a pesar que se seque
de la forma más cuidadosa posible, siempre se arrastra parte del material.

Aplicaciones
Prácticamente, todas las muestras clínicas deben ser estudiadas en el microscopio, para
determinar la proporción de microorganismos y los elementos celulares presentes. Para este
tipo de preparación, la coloración de Gram constituye la técnica mas adecuada. Si la tinción
es buena, los elementos celulares presentan un color rosado o rojizo (todas las células de los
mamíferos son gramnegativas) y las bacterias se tiñen de color azul oscuro (grampositivas)
o rojo (gramnegativas). Si existen hongos estos son siempre grampositivos. Ciertas bacterias
grampositivas se decoloran con mayor facilidad que otras, especialmente en muestras clínicas
y en cultivos antiguos con medios artificiales. Aunque ciertas bacterias grampositivas pueden
aparecer como gramnegativas, lo contrario no ocurre nunca. En las muestras clínicas se
encuentran con frecuencia artefactos, que puede confundirse con bacterias lo cual puede
conducir a conclusiones erróneas